Abstract
Individuelle bakterier og endringer i sammensetningen av mikrobiomer har vært forbundet med menneskelige sykdommer, inkludert kreft. For å undersøke endringer i mikrobiomer forbundet med orale kreftformer, profilert vi kreft og anatomisk tilpasset kontralateral normalt vev fra samme pasient ved sekvensering av 16S rDNA hypervariable region amplikonene. Hos kreftprøver fra både en oppdagelse og en etterfølgende bekreftelse kohort, overflod av
firmicutes plakater (spesielt
Streptococcus
) og
aktinobakterier plakater (spesielt
Rothia
) ble signifikant redusert i forhold til kontralaterale normale prøver fra den samme pasient. Betydelige reduksjoner i overflod av disse phyla ble observert for pre-kreft, men ikke når man sammenligner prøver fra kontralaterale nettsteder (tunge og munngulv) fra friske personer. Vektet UniFrac rektor koordinerer analyse basert på 12 taxa atskilt fleste kreftformer fra andre prøver med størst separasjon av node positive saker. Disse studiene begynner å utvikle et rammeverk for å utnytte den muntlige mikrobiomer for overvåking av kreft i munnhulen utvikling, progresjon og tilbakefall
Citation. Schmidt BL, Kuczynski J, Bhattacharya A, Huey B, Corby PM, Queiroz ELS, et al . Muy-Teck Teh (2014) Endringer i Overflod av Oral Microbiota Associated med Oral Cancer. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10,1371 /journal.pone.0098741
mottatt: 21. august 2013, Godkjent: 07.05.2014; Publisert: 02.06.2014
Copyright: © 2014 Schmidt et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en tildeling av en GS Junior 454 Sekvense løp fra Roche, Nasjonalt Senter for Forskningsressurser, Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, og kontoret til direktør, National Institutes of Health, gjennom University of San Francisco ( UCSF) – CTSI tilskuddet nummer UL1 RR024129, og enkelte etterforsker utmerkelser fra National Cancer Institute stipend (R01 CA131286, R21 CA 941 186 215) og National Institute of Dental og kraniofaciale Forskning (R01 DE019796). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NIH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Mottak av en pris for sekvensering fra Roche, en kommersiell Funder, endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Dr. Justin Kuczynski er ansatt i andre Genome, Inc. Hans sysselsetting endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Årlig ~ 22.000 amerikanere er diagnostisert med kreft i munnhulen, hvorav 90% er plateepitelkarsinom (SCC). De fem års overlevelse, 40% har ikke bedret seg de siste 40 årene, og det er en av de laveste av de store kreftformer, noe som resulterer i flere mennesker dør av kreft i munnhulen enn melanom, cervical eller eggstokkreft i USA. Verdensbasis er det 350,000-400,000 nye tilfeller diagnostisert hvert år. I motsetning til de fleste andre anatomiske områder, som har gått ned i kreftforekomst, er forekomsten av kreft i munnhulen øker, særlig blant unge mennesker og kvinner [1], [2]. Den store risikofaktorer, tobakk og alkohol, kan ikke forklare endringer i forekomst, fordi kreft i munnhulen også ofte oppstår hos pasienter uten tidligere tobakk eller alkohol eksponering [3]. Nylig har humant papillomavirus (HPV) er identifisert som en etiologisk agent for orofaryngeal kreft, men HPV-infeksjon er ikke en betydelig bidragsyter til munnhulekreft, som viruset er sjelden funnet i disse kreftformene (2-4% av tilfellene) [4] . Dermed bidrag fra andre, muligens miljømessige faktorer er å bli funnet.
En rolle for bakteriell infeksjon i forårsaker eller fremme kreft er godt kjent med hensyn til foreningen av
Helicobacter pylori
med magekreft [5], og andre kreftformer, inkludert galleblære, tarm, lunge og prostata, har vært assosiert med bestemte bakterieinfeksjoner [6], [7], [8]. Det er rimelig å spørre, derfor, hvis endringer i sammensetningen av den normale munnhulen mikrobiomer, som består av mer enn 600 forskjellige bakteriearter [9] og /eller kronisk bakteriell infeksjon kan være promotorer eller årsaker til munnkreft. Faktisk, er forandringer i den mikrobielle fellesskap vanligvis forbindes med tannsykdommer så som periodontal sykdom, som er mest sannsynlig et blandingsflora bestående sykdom karakterisert ved utveksten av visse patologiske organismer [10], og kronisk periodontitt har blitt rapportert å være en risikofaktor for oral premaligne lesjoner og kreft [11]. Forhøyede nivåer og endringer i sammensetningen av bakterie- og soppfloraen i munnhulen har blitt rapportert i forbindelse med perorale pre-kreft og kreft [12]. Det er imidlertid ingen enighet blant rapporter angående cancerassosierte forandringer i munn mikrobiomer. Dette forvirring kan ha oppstått på grunn tidlige undersøkelser var begrenset til analyse av de forholdsvis lite antall kjente og dyrkbare orale bakteriearter [13], [14], og senere studier ved bruk av molekylærbiologiske metoder rettet mot bestemte phyla [15] eller klonet og sekvensert liten antall kloner pr prøven [16], [17].
Culture uavhengige fremgangsmåter, spesielt de som anvender neste generasjon sekvensering av den hypervariable region av 16S ribosomale subenhet, tilveiebringe et middel for mer omfattende og mer nøyaktig profil av mikrobiomer i helse og sykdom [18]. Slike studier i munn mikrobiomer [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] avsløre på den ene siden at sunn oral mikrobiomer er preget av et relativt lite antall bakterie phyla (9-13), den hyppigst rapporterte rikelig phyla være
firmicutes
,
Proteobacteria
,
bacteroidetes
,
aktinobakterier
, og
Fusobacteria product: [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. På den annen side har de fleste av inter-individuell variasjon blitt tilskrevet mangfold på arter eller stammenivå [24].
Streptococcus
er oftest observert å være de dominerende slekten i sunn oral mikrobiomer, og sjeldnere
Prevotella
,
Veillonella
,
Neisseria
, og
Haemophilus
dominere en persons muntlig mikrobiomer [19], [24]. Variasjon er også observert i den mikrobielle fellesskap sammensetningen av biofilmer ved hver intraoral habitat (
f.eks
., Tannoverflaten, lateral og dorsal tunge, etc.), mest sannsynlig reflekterer de forskjellige overflateegenskaper og microenvironments [21], [24].
Slik skal undersøke mulige endringer i sammensetningen av oral mikrobiomer i kreft i munnhulen, derfor er det nødvendig å kontrollere for forskjeller mellom muntlig sekundære og interindividuell variasjon. I tillegg høye tilbakefallsrater og forekomst av andre primære oral cancer støtter forslaget om at disse kreftutvikling av et felt av genetisk endrede celler, begrepet «-feltet cancerization» [29]. Slike felt har blitt rapportert å øke så mye som 7 cm fra en tumor og skal vises klinisk normal [30]. Av disse grunner, undersøkte vi oral cancer assosiert mikrobiomer ved ikke-invasiv måte sampling av kreft lesjonen og en anatomisk tilpasset kontralaterale region av normalt vev fra hver enkelt. Vi utsettes DNA isolert fra disse prøvene til 16S ribosomal subenhet forsterkning og sekvensering. Målet med disse studiene var å begynne å legge et grunnlag som ville tillate utnyttelse av den muntlige mikrobiomer for behandling og oppfølging av kreft i munnhulen initiering, progresjon og tilbakefall.
Resultater
For å undersøke endringer i munn mikrobiomer assosiert med kreft i munnhulen, vi prospektivt samlet kreft og anatomisk tilpasset pasientens klinisk normale prøver fra fem pasienter (tabell 1, Study en Discovery Cohort, Tabell S1). For å bekrefte og utvide våre innledende observasjoner, utførte vi en annen studie (studie 2, Bord S2 – S6, totalt antall prøver = 83) der vi prospektivt samlet inn et uavhengig sett med angrepne og anatomisk tilpasset klinisk normale prøver fra munnhulen (tabell 2, Study 2 bekreftelse Cohort, Tabell S2), karsinom
in situ plakater (CIS, tabell S3) og pre-kreftpasienter (tabell S4), samt fra venstre og høyre side av sidemålet og etasje i munnen på sunne normale individer (Tabell S5). I studie 2, vi også inkludert en uavhengig analyse av de første fem kreftpasienter fra studie 1 og seks par replikere prøver (tre kreft og tre pre-kreftpasienter, Tabell S6). Sistnevnte ble tatt med for å vurdere reproduserbarheten prøvetaking og behandling, og ble ikke inkludert i noen av analysene (se nærmere omtale i Methods).
Study 1. Disco kohort
Vi penslet oral cancer lesjon og en tilsvarende anatomisk tilpasset klinisk normalt vev området fra Discovery Cohort av fem pasienter (tab 1). Ved hjelp av Roche GS Junior instrument for å utføre pyrosekvensering, erholdt vi, i en enkelt kjøring, totalt 104,380 sekvenser fra amplikonene som spredte V4 hypervariable regionen av de bakterielle 16S lille ribosomale subenhet (tabell S7). Antallet rå sekvens lyder variert ved ti-ganger på tvers av prøvene, som strekker seg fra 1231 til et maksimum på 17 682 rå leser. Kvalitet filtrerte sekvenser ble søkt mot Greengenes referansedatabasen av 16S sekvenser, gruppert på 97%, og operasjonell Taksonomiske Units (Otus) ble tildelt taksonomisk klassifisering ved hjelp mothur sin Bayesiansk klassifikator. Av de 92,987 sekvenser som passerte kvalitet filtrering, 81308 var lik kjente bakterier og de fleste kunne klassifiseres til slekten nivå (65037) med færre klassifisert på artsnivå (17115). Sequence dekningen var variabel over prøver; antall lyder per prøve tilordnet otus (unntatt de som er filtrert på grunn av dårlig kvalitet, eller mangel på en relatert sekvens i Greengenes referansedatabasen) varierte fra 1038 til et maksimum på 14 359, og består av 76-85% av rå-sekvenser (Tabell S7 ). Totalt 276 otus ble identifisert (per prøve område, 37-161, (tabell S8). Trykk, vakuum-analyse utført på familienivå viste et ganske bredt spekter av α mangfold med antallet detekterte familier som strekker seg fra ~15-28 (figur .. S1A) tre pasientprøver, normal og kreft fra pasient 117 og den normale prøven fra pasient 142, plateaued ved færre familier enn de andre prøvene, noe som indikerer noe redusert diversitet i disse prøvene Alle prøver flatet ut til en viss grad, men ikke helt, videre sekvensering ville sannsynligvis avsløre flere familier. på den annen side, pyrosekvensering støy og PCR-feil kan feilaktig øke otu nummer [31]. En lignende effekt ble sett ved slekten nivå (figur S1b).
Diversity of microbiomes forbundet med anatomisk tilpasset oral cancer og normale prøver
Otus av kreft og klinisk normale prøver i Discovery kohorten ble klassifisert i 12 phyla (tabell S7). de fleste tilhørte en av fem phyla (99,2%, normal , 98,0% kreft) med mer rikelig phyla være
firmicutes
,
bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacteria
, og
aktinobakterier
(tabell 7, figur 1). Selv om distribusjon i kreft og klinisk normale prøver av disse fem felles phyla varierte blant individer (figur 1), i alle pasienter, observerte vi en betydelig reduksjon i overflod av
firmicutes Hotell og
aktinobakterier
i kreft sammenlignet med anatomisk tilpasset kontralaterale klinisk normal pasientprøve, (p = 0,004, FDR justert p = 0,02 og p = 0,028, FDR justert p = 0,07, henholdsvis). Vi observerte også at andelen av
Fusobacteria
var økt hos alle pasienter, men endringen i overflod nådde ikke statistisk signifikans (p = 0,074, figur 2). Vi merker oss imidlertid at å observere konsistente endringer i overflod av de tre phyla i denne lille kohorten er svært viktig. Ignorerer samspill mellom de relative Forekomsten av forskjellige phyla, en binomial test gir p = 0,0022 som sannsynligheten (under null-hypotesen) av å ha tre eller flere phyla hvor (alle fem pasientene deler økning) eller (alle fem dele en reduksjon).
den relative fordelingen av phyla (prosent av sekvenser) er vist for hver pasientprøve med klinisk normale prøver vist sammen på toppen og kreftprøver på bunnen
(a – e. ) Relativ mengde av hver av de fem mer rikelig phyla i kreft sammenlignet med klinisk normale prøver fra hver av de fem pasienter. Merk at data vises på ulike skalaer, reflekterer overflod av phyla. Størrelsene av endringene i overflod er tydelig større enn den statistiske telle støy, som angitt ved feilfelt anslag, som er basert på kvadratroten av det faktiske antall lesninger. (F) Endring i relative overflod vist som forskjellen i overflod av phyla assosiert med kreft i forhold til anatomisk tilpasset kontralaterale klinisk normale prøver. I kreftformer, reduksjon i den relative overflod av
firmicutes Hotell og
aktinobakterier
ble sett hos alle pasienter, mens den relative overflod av
Fusobacteria
ble forhøyet i kreft fra alle pasienter.
Study 2. bekreftelse kohort
For å bekrefte disse innledende observasjoner, utførte vi Study 2. Som før, vi penslet både lesjon (kreft eller pre-kreft) og en kontralateral anatomisk klinisk normal matchet nettstedet. Vi penslet på venstre og høyre side av side tunge og munngulv av friske individer. Bruke Illumina MiSeq instrument, sekvensert vi amplikonene spenner 16S rDNA V4 hypervariable region. Vi fikk 4.486.196 rå sekvens leser med et utvalg av 31 109 til 125 847 leser per prøve etter unntatt to prøver som mislyktes i sekvensering (Tabeller S9 – S13). Vi tildelt taksonomisk klassifisering til Otus som før. Av sekvensene som passerte kvalitet filtrering, 4.444.432 lignet på kjente bakterier og de fleste kunne klassifiseres til slekten nivå (4148785) med færre klassifisert på artsnivå (1.650.037). Vi identifiserte totalt 2107 Otus (per prøve utvalg, 90-482, Bord S9 – S13). Vakuum, analyse viste et ganske bredt spekter av α mangfold med nesten alle prøvene plateauing til en viss grad (figur S2). Som omtalt ovenfor, kan sekvense støy og PCR-feil øke Otu tall [32].
Mangfold i microbiomes forbundet med anatomisk tilpasset prøver fra kreft i munnhulen, pre-kreft og sunne normale individer i studie 2
Vi først fastslått at data samles inn på ni av ti Discovery Kohort prøvene som ble vellykket profilerte i studie 2 (tabell S9) ble sterkt korrelert med de originale data innhentet av 454 pyrosekvensering (figur S3). Vi betraktet Bekreftelse Cohort består bare av prøver fra kreftpasienter som ikke inngår i Discovery Cohort,
, dvs.
., Ekskludert vi ni Discovery kohort prøver (Tabell 2, Tabell S9). Vi igjen fant at flertallet av Otus (61-100%) tilhørte en av de fem rikere phyla (
firmicutes
,
bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacteria
, og
aktinobakterier
) (figur 3a, tabell S14). Vi spurte om det var betydelige reduksjoner i overflod av
firmicutes Hotell og
aktinobakterier
i kreft sammenlignet med anatomisk matchet kontralaterale klinisk normal pasientprøve. Faktisk, som vi har observert i Discovery kohort (studie 1), var det en signifikant reduksjon i mengde av disse to phyla i kreft sammenlignet med de anatomisk passet kontralaterale klinisk normale pasientprøver (p = 0,042 og p = 0,004, respektivt), bekrefter våre innledende observasjoner (figur 3b, figur S4).
(a) det er vist den relative fordelingen av phyla (prosent av sekvenser). For kreft, inkludert vi bare pasienter som både kreft og kontralaterale klinisk normale prøver var tilgjengelige. (B) Endring i relativ overflod av phyla vist som forskjellen i overflod av phyla assosiert med kreft eller pre-kreft sammenlignet med anatomisk tilpasset kontralateral klinisk normale prøver. For friske normale prøver sammenlignet vi til venstre og høyre side av side tunge eller munngulv.
I studie 2, vi også observert at flertallet av Otus i prøver fra pre-kreftpasienter og friske normaler (figur 3a) tilhørte en av de fem phyla
firmicutes
,
bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacteria
, og
aktinobakterier
(pre-kreft = 99-100%, sunn normal = 87-100%). Vi spurte igjen om betydelige reduksjoner i overflod av
firmicutes Hotell og
aktinobakterier
kan også være til stede når man sammenligner pre-kreft og anatomisk tilpasset kontralateral klinisk normale pasientprøver. Vi fant at overflod av
firmicutes Hotell og
aktinobakterier
ble redusert (p = 0,048 og p = 0,037, henholdsvis), noe som tyder på at endringer i overflod av disse to phyla kan oppstå tidlig (figur 3b ). Derimot, fant vi ikke signifikante forskjeller i overflod av disse to phyla eller noen av de fem rikere phyla når man sammenligner de venstre og høyre side av den laterale tunge og munngulv av sunne normale individer (figur 3b).
for å undersøke endringer i overflod på slekten nivået for fem rikere phyla, vi vurderte pasient matchet prøver fra bekreftelse Cohort og også inkludert fire av de fem Discovery Kohort saker som ble vellykket analysert i studie 2 (14 kreftformer fra 13 pasienter, Tabell S9). Vi normalisert antall Otus én million teller, (Tabell S15) og for hver phylum, fant vi ut endringer i overflod av slektene som representerte 10% av Otus i mer enn 20% av prøvene (figur S5 og S6). ble observert betydelig reduksjon i overflod for
Streptococcus product: (p = 0,003) og
Rothia product: (p = 0,021) i kreft i forhold til anatomisk tilpasset klinisk normale prøver (Tabell S16). Derimot, observerte vi økt overflod av
Fusobacterium product: (p = 0,044) i forhold til tilpasset klinisk normale prøver fra kreftpasienter. I pre-kreft, observerte vi betydelig redusert overflod av
Streptococcus product: (p = 0,042) (tabell S16). Vi fant ingen signifikante forskjeller i overflod av disse mer vanlige slekter når man sammenligner overflod i prøver tatt fra venstre og høyre side av den laterale tunge og munngulv av friske individer (Tabell S16).
Vi har også bemerket at selv om vi fant ingen konsistente endringer i overflod av
bacteroidetes
når man sammenligner innen individer (figur 3b), prøver fra kreft og pre-kreftpasienter (både lesjon og anatomisk tilpasset kontralateral klinisk normalt vev) var assosiert med økt overflod av
bacteroidetes
sammenlignet med prøver fra friske normale individer (Figur 3a).
Prevotella
arter, særlig skilte og inkludert, for eksempel, Otus tilsvarende
P. intermedia
,
P. melaninogenica
,
P. nanceiensis
,
P. oris
,
P. tannerae Hotell og uklassifiserte arter (figur S5, tabell S15). Forhøyede nivåer av
P. melaninogenica
har vært rapportert tidligere som en potensiell spytt biomarkør for kreft i munnhulen [33] og
P. intermedia
er en periodontal patogen [34]. Videre studier vil være nødvendig for å forstå bidrag av generell (
bacteroidetes
) og lesjon spesifikke endringer (
aktinobakterier
,
firmicutes
) i mikrobiomer av kreft i munnhulen og pre -cancer pasienter.
Otus skille kreft fra anatomisk tilpasset kontralaterale normal pasientprøver
for å ivareta behovet for biomarkører å forutsi oppførselen til oral cancer som kan analyseres ved ikke-invasive tester, spurte vi om kreftprøvene kan bli preget av bakterielle preparat. Vurderer kreft /normal parede prøver identifiserte vi 11 Otus fra phyla
aktinobakterier product: (
Actinomyces Hotell og
Rothia
, 2 Otus fra hver slekt) og
firmicutes
(
Streptococcus
, 7 Otus) som ble betydelig redusert i kreft og en Otu fra phylum
Fusobacteria product: (
Fusobacterium
) som ble økt i kreft sammenlignet med anatomisk matchet kontralaterale normale pasientprøver (Tabell S17). Vektet UniFrac rektor koordinerer analyse (PCoA) basert på dette settet med Otus atskilt fleste kreftformer fra normale og pre-kreft prøver med fem av de sju lymfeknute positive tilfeller danner en tett klynge i nedre høyre hjørne av tomten (figur 4). Metastaser til cervical (halsen) lymfeknuter er en viktig faktor for kreft i munnhulen pasient overlevelse [35]. Dagens mangel på pålitelige metoder for å vurdere risiko for metastase resultater hos pasienter som rutinemessig utsatt for ytterligere kirurgi for å fjerne lymfeknuter, selv om de fleste ikke vil dra nytte av prosedyren. Den tette klynger av prøver fra node-positive pasienter i figur 4 viser at endringer i sammensetningen av oral cancer mikrobiomer kan også være lovende som et tumorassosiert biomarkør av risiko for metastasering.
PCoA basert på en vektet UniFrac avstand mellom prøvene gitt overflod av 12 Otus. Axis 1 (PCoA1): 54% av variasjonen forklart. Akse 2 (PCoA2): 24% av variasjon forklart. N0 og N + viser knutepunkt status for kreftpasient, N0 = node negativ, N + = positiv node. Kreft kontroll og pre-kreft kontroll er kontralaterale klinisk normale pasientprøver. Andre identifiserer prøver fra friske normale individer
Hele micrbiome -. Beta mangfold
For å undersøke sample-to-sample ulikhet, delutvalgt vi dataene ved å tilfeldig velge 31,109 sekvenser fra hver kommune til justere for variasjoner i sekvense dybde (Tabell S18). Når du vurderer de tre utvalgsgrupper (Kreft, friske normale, og Pre-kreft), observerte vi betydelige mikrobiomer forskjeller for pasienten identitet basert på både vektet UniFrac (overflod) og uveide UniFrac (nærvær /fravær) beregninger (tabell S19, figur S7 og S8). Ingen andre sammenligninger, slik som venstre vs høyre, antall sekvenser eller lesjon (kreft eller pre-kreft) vs. kontroll normale nettsider viste signifikante forskjeller. Disse observasjonene er i samsvar med andre studier som har fremhevet den inter-individuelle forskjeller i munn mikrobiomer [24]. Videre støtter de vår studie design, som måler endringer i mikrobiomer innen enkeltpersoner,
dvs.
., Bruker hver pasient som hans eller hennes egen kontroll.
Diskusjoner
Å studere muntlige malignitet-assosierte mikrobiomer endringer utførte vi en Discovery-skjermen (studie 1), hvor vi ikke-invasiv samplede kreft og kontralaterale klinisk normale vevsprøver fra hver enkelt. Sammenligning av sammensetningen av mikrobielle samfunn innenfor pasienter identifisert endringer i overflod av
aktinobakterier Hotell og
firmicutes
. Vi har bekreftet disse observasjonene i en andre Bekreftelse Cohort (studie 2) og videre funnet signifikante endringer i overflod av
aktinobakterier
slekten
Rothia Hotell og
firmicutes
slekten
Streptococcus
når de vurderer alle krefttilfeller i studie 2 (tabell S16). Selv om vi ikke ser en betydelig endring i overflod av phylum
Fusobacteria
i enten Discovery eller en bekreftelse Kohorter, fant vi en betydelig økning i overflod av
Fusobacteria
slekten,
Fusobacterium
når de vurderer alle kreftpasienter i studie 2. Vi merke seg at mens kohorter av pasienter studert her er små og heterogene, våre funn angående overflod av phyla er lik publiserte studier, som fokuserte på omfattende analyse av den muntlige mikrobiomer. Videre, bruk av forskjellige sekvenseringsteknologi måler overflod av 16S rDNA-amplikonene i Studies 1 og 2 støtter robustheten våre observasjoner. Likevel ytterligere større studier skal bidra til å bedre definere oral cancer tilknyttet endringer i overflod av disse phyla og slekter. Videre har vi observert forandringer i overflod av
firmicutes plakater (
Streptococcus
) i forbindelse med orale pre-kreftformer, noe som tyder på at oral lesjon tilknyttet endringer i sammensetningen av den mikrobielle fellesskap kan oppstå tidlig i munn kreftutvikling og /eller herold kreft progresjon.
Røyking er en risikofaktor for orale sykdommer, inkludert kreft og periodontitt. Studier har vist at røyking påvirker sammensetningen av bakteriesamfunn i munnhulen, inkludert, for eksempel spytt mikrobiomer av sunne røykere og ikke-røykere [36] og de subgingivale microbiomes av pasienter med periodontal sykdom [37], samt som dannelsen av plakk biofilm [38]. I vår studie fant vi ingen bevis for generelle forskjeller i microbiomes som kunne tilskrives røyking, men med bare tre nåværende røykere og fire ikke-røykere i våre kreftpasient kohorter for eksempel, kan vi ikke trekke noen konklusjoner på dette tidspunktet. På den ene siden, fordi vi brukte hver pasient som hans /hennes egen kontroll, ville vi ikke forvente å se røyking forbundet forskjeller i overflod av bakterieflora assosiert med kreft, siden røyking vil påvirke både kontrollstedet og kreft. På den annen side, i røykere, celler ved klinisk normale områder og kreft min reagerer forskjellig på røyking induserte endringer i biofilmdannelse, for eksempel øke muligheten for at mens kreft forbundet endringer i overflod av bakterieflora hos røykere og ikke-røykere ligne, kan dannelsen og funksjonelle konsekvenser av de endrede microbiomes forskjellig i disse pasientgruppene. Tilsvarende betraktninger kan gjelde immunsupprimerte individer.
Tilstedeværelsen av bakterier i muntlig kreft og /eller forskjeller i bakteriesamfunn forbundet med oral cancer er rapportert tidligere ved hjelp av enten kultur avhengig [13], [14] eller molekylær metoder [15], [16], [17], men ingen konsistente observasjoner er rapportert over disse studiene. Det er imidlertid vanskelig å foreta sammenligninger selv blant to nylige studier rapporterer overflod av bakterier [16], [17] og dette studium, på grunn av forskjeller i (a) prøvetype (swab, denne studien vs. vevsprøve [16] , [17]), (b) munnhulen område, (c) kilde pasient matchet normale kontrollprøver (anatomisk tilpasset kontralaterale klinisk normal, denne studien, øvre aerodigestive kanal slimhinner [16], ved normal [17]), (d ) amplifiserte regionen av 16S ribosomal-genet (V4, denne studien, V4 V5-[16] eller V1-V4 [17]), (e) metoden (Sanger [16], [17] vs. pyrosekvensering eller MiSeq, denne studien ), og (f) antall kloner eller sekvens leser tilordnet otus per prøve (gjennomsnittlig 8000 og 55 000 leser per prøve, Studie 1 og 2, respektivt, sammenlignet med ~90 eller ~250 kloner per sample [16], [17] ). For eksempel, Pushalkar og medarbeidere [16] rapporterer på 10 pasienter fant at 75 og 80% av klonene (normal og kreft, henholdsvis) ble tildelt phylum
firmicutes
. Dette forhold er ikke bare høyere enn 40-0% rapportert i andre studier i munnhulen av friske eller kreftpasienter, men siden bare ~90 kloner ble sekvensert per prøve, det er for få kloner for pålitelig å bestemme relative overflod av andre phyla for sammenligninger. En phylum nivå analyse av kun 16 tungen, gulvet i munnen og munnhulen kreft rapportert av Bebek og kolleger [17], men avslørte kreft tilhørende økning i overflod av phylum
Fusobacteria
, i samsvar med våre observasjoner, men redusert overflod av
Streptococcus
kunne ikke bli sett, så få kloner ble tildelt denne slekten.
Vi kan ikke skille om de observerte endringene i den mikrobielle samfunnet gjenspeiler det faktum at enkelte bakterier er mer egnet til å overholde og vokse i kreft mikromiljøet, eller om de er kreft fremme. Videre er det uklart hvordan man skal veie de potensielle bidrag fra endringer i rikelig slekter som
Streptococcus
forhold til den mindre
aktinobakterier
slekter. Potensielle roller for bakterier og sopp i kreft fremming omfatte dannelse av kreftfremkallende stoffer, slik som nitrosamin eller andre pro-kreftfremkallende kjemikalier, kronisk betennelse og direkte effekter på signalisering i epitel-celler som resulterer i forbedret spredning eller undertrykkelse av apoptose [6], [7] , [12], [39]. Bare et mindretall av den muntlige mikrobielle samfunn kan forholde seg til harde og myke muntlig vev, og montering av komplekset oral biofilm oppnås ved påfølgende etterlevelse av sekundære koloniherrer.
Streptococcus
er en tidlig kolonisator og
Fusobacterium product: (
f.eks
.,
F. Nucleatum
) har en tilbøyelighet for co-aggregering med mange slekter, danner en bro mellom tidlige og sene kolonister i munn biofilm [40]. Dermed på den ene siden, den observerte nedgangen i utbredelsen av
Streptococcus Hotell og økt overflod av
Fusobacterium
slekter i pre-kreft kunne reflektere endrede overflateegenskaper kreftceller og stroma, som kan ikke lenger støtte vedheft av
streptokokker
. På den annen side kan vi hypotese at endringer i overflod av disse to slekter kan resultere i en forbedret pro-inflammatorisk miljø, siden
Streptococcus
arter har blitt rapportert å dempe
Fusobacterium nucleatum
Induced pro inflammatorisk respons til orale epitelceller [41], [42]. Vi ser også at
Fusobacterium nucleatum
vokst som en biofilm er i stand til å invadere organotypiske kulturer [43], og for det andre, at organismen har nylig blitt rapportert i tykktarm kreft [44], [45], noe som ytterligere støtter en potensielle rolle i kreft i munnhulen.
munnhule tilbyr en relativt unik mulighet til skjermen på risikopersoner for (muntlig) kreft, fordi lesjoner kan sees, og som vi rapporterer her, skiftet i mikrobiomer av kreft og pre-cancer lesjoner sammenlignet med anatomisk tilpasset klinisk normal vev fra det samme individet kan påvises i en ikke invasiv innsamlede penselprøver. Spytt er et annet ikke-invasiv samlet oral prøve stort sett består av bakterieceller, men også kaste epiteliale og immunceller.
