Abstract
Bakgrunn
Selv om Sox2 uttrykk har blitt funnet i flere typer kreft, har det ennå ikke blitt brukt til å identifisere eller isolere cscs i somatisk carcinoma.
metoder
Siha og C33A celler som er stabilt transfektert med et plasmid inneholdende humant Sox2 transkripsjonelle elementer driver den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) reporter ble sortert inn i den Sox2-positive og de Sox2-negative populasjoner ved hjelp av FACS, og Sox2 uttrykk ble oppdaget av western blot og immunhistokjemi. Differensiering, selvfornyelse og tumordannelse evner, samt uttrykk for stemness og EMT relaterte gener av Sox2-positive og Sox2-negative livmorhalskreftceller ble preget
in vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
En pSox2 /EGFP systemet ble brukt til å skille Sox2-positive og Sox2-negative celler fra livmorkreft cellelinjer, Siha og C33A celler. Sammenlignet med de Sox2-negative celler, de Sox2-positive Siha og C33A celler utstilt større kapasitet for selvfornyelse, differensiering og tumordannelse. Videre Sox2-positive Siha og C33A cellene uttrykte høyere nivåer av stemness relaterte gener, for eksempel Sox2 /Bmi-1 /Oct4 /ALDH1, og EMT-relaterte gener, for eksempel vimentin /snail /β-catenin. Til sammen alle disse resultatene indikerte at celler som uttrykker endogen Sox2 er cscs i cervical karsinomer.
Konklusjon
Denne studien er den første til å etablere en funksjonell kobling mellom endogen Sox2 uttrykk og cscs i livmor karsinom . I tillegg gir denne studien viste at det er mulig å utvikle et verktøy for å isolere cscs fra somatiske svulster basert på uttrykk for den endogene atom protein Sox2 stedet for celleoverflatemarkører
Citation. Liu XF, Yang WT, Xu R, Liu JT, Zheng PS (2014) livmorhalskreft Celler med Positive Sox2 Expression Exhibit egenskapene til kreftstamceller. PLoS ONE 9 (1): e87092. doi: 10,1371 /journal.pone.0087092
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, Canada
mottatt: 23 juli 2013; Godkjent: 18 desember 2013; Publisert: 28 januar 2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en generell bevilgning fra Natural Science Foundation National Kina professor Peng-Sheng Zheng (nr 30571951), en spesiell vitenskapelig Distinguished Young Scientists Fund bevilgning (nr 30725043). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamcelle (CSC) hypotese antyder at tumormasser kan oppstå fra en enkelt kreftcelle med stilk-lignende egenskaper. Disse cscs er antatt å ha kapasiteten til selvfornyelse og differensiering, og de kan regenerere tumormassen og alle tumorcelletyper innenfor. Eksperimentelle bevis som støtter hypotesen ble først generert i 1997 av Dick gruppe, som viste at menneskelig leukemi er drevet av en liten bestand av leukemiske stamceller kan overføre sykdommen til NOD /SCID-mus [1]. Dette konseptet ble utvidet til solide svulster ved Clarke og Wicha, som demonstrerte at menneskelig brystkreft inneholder en undergruppe av celler med stilk-lignende egenskaper som bærer overflatemarkører CD44
+ /CD24
– /lin
– [ ,,,0],2]. Deretter cscs har blitt identifisert og fremadrettet isolert fra en rekke forskjellige maligniteter, inkludert hjernen kreft [3], prostatakreft [4], melanoma [5], multippelt myelom [6], tykktarmskreft [7], [8], bukspyttkjertel kreft [9] og hode og nakke kreft [10]. Imidlertid har cscs ikke blitt identifisert i cervikale karsinomer.
De fleste kreftstamcelle assay har hittil vært avhengig av en rekke forskjellige celleoverflatemarkører, inkludert CD133, CD44, CD166, og CD24. Ved hjelp av disse overflatemarkører, kan cscs fra primær tumorvev bli beriket ved hjelp FACS teknologi, og deres forplantning kan testes i immunsvikt mus. Imidlertid kan overflatemarkører bare brukes til å isolere de mest vanlige cscs, og disse markørene er ofte ustabile i mange somatiske kreft [11]. Cscs beriket fra primærkulturer basert på serie xenograft passasje
in vivo
har blitt rapportert å inneholde en inkonsekvent undergruppe etter isolering ved hjelp av overflatemarkører CD133 og CD44 [12]. I tillegg er de oppnådde resultater med cscs isolert ved anvendelse av samme overflatemarkør ikke er konsistent blant laboratorier. Således blir det nødvendig å søke etter cytoplasmiske eller kjernefysiske maskin som kan brukes for isolering av cscs [13].
I en tidligere studie har vi identifisert ekspresjon av embryonale stamceller-spesifikke transkripsjonsfaktor Sox2 i primærlivmorhalskreft vev og tumorspheres dannet av primærlivmorhalskreft celler, og vi fant at Sox2 fungerer som et onkogen i livmorhalskreftutvikling ved å fremme cellevekst og tumorigenicity [14], [15]. Våre resultater tyder på at Sox2 kan være en potensiell markør for livmorhals cscs. I tillegg styrer Sox2 den pluripotency, selvfornyelse og spredning av embryonale stamceller. Det er blitt vist at murine og humane embryonale stamceller og neurale stamceller har høy Sox2 aktivitet [16], [17], [18], og øket Sox2 ekspresjon er også blitt funnet i bryst- og glioblastom CSC populasjoner [19], [ ,,,0],20]. Samlet utgjør disse dataene antyder at Sox2 er en kandidat kjernefysisk markør for cscs.
I denne studien har vi stabilt transfektert to livmorhalskreft cellelinjer, Siha og C33A, med et plasmid som inneholder menneskelig Sox2 transkripsjons elementer kjøre EGFP uttrykk. Vi viste at Sox2-positive livmorhalskreftceller delte alle egenskapene til cscs.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur betingelser
Den menneskelige livmorhalskreft cellelinjer Siha, HeLa, C33A, og CaSki ble alle kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Siha, HeLa, og C33A-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). CaSki celler ble dyrket i McCoys 5A medium (Sigma-Aldrich) med 10% FBS.
Bygging av pSox2 /EGFP
~11.5 kb menneskelige Sox2 promoter ble forsterket av polymerase chain reaction (PCR ) fra Siha genomisk DNA med følgende primere: fremover, 5′-gctagcgaccacatctggctgcttgtatatttaac-«3 og omvendt, 5»-catgcggggcgctgtgcgcg-«3. I tillegg er det 3 «ikke-translaterte region (3’UTR), poly (A) hale, og 3′-enhancer av Sox2 ble også amplifisert ved PCR med følgende primere: forover, 5»-tgagggccggacagcgaac-«3 og omvendt, 5»- gtcgacatgagaggtgagtgcagtgcaattac-«3. Vektorsekvensen av interesse, inkludert den uavhengige SV40 promoter-drevet neomycin motstand kassett, og EGFP sekvensen ble også forsterket fra pIRES2-EGFP vektor (Invitrogen). Deretter ble disse fragmentene klonet inn i TOPO vektorer (Invitrogen), og nøyaktigheten av den DNA-sekvens ble bekreftet ved sekvensering. Det riktige menneskelige Sox2 promoter, UTR /Enhancer, EGFP, og vektoren ble deretter klonet ved hjelp av en In-Fusion PCR Kloning Kit, og den resulterende vektor ble betegnet phSox2 /EGFP (Takara Bio Inc, Dalian, Kina).
Immunohistokjemi og Immunocytochemistry
Immunohistokjemi ble utført på fire-mikrometer deler av parafininnstøpte vev. Tumor vevssnitt ble suksessivt deparaffinized og rehydratiseres før forbehandling med 10 mM natriumcitrat antigen gjenfinning-buffer (pH 6,0) i en damptrykkoker. Etter behandling med 3% H
2o
2, de følgende antistoffene ble inkubert med seksjonene over natten ved 4 ° C: anti-Sox2 (1:100), anti-Ki67 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 01:50), anti-Bmi1 (1:100), anti-Oct4 (1:100), anti-Nanog (1:100), anti-Ki67 (1:80), anti-vimentin (1 :200), anti-snegl (1:150), anti-β-catenin (1:250), og anti-E-cadherin (1:200). Alle antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), med mindre annet er angitt. Vevssnittene ble deretter inkubert med biotinylert immunoglobulin G (IgG) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking, ble seksjonene inkubert i streptavidin-peroksydase-kompleks i 30 minutter, og immunfarging ble utført ved anvendelse av 0,05% 3′-diaminobenzidin, etterfulgt av kontra med hematoksylin. Sera fra ikke-immuniserte geiter eller mus ble benyttet som negative kontroller.
I tillegg ble cellene dyrket på dekkglass i 48 timer, fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, og permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter ved romtemperatur. Uttrykket nivåer av de forskjellige proteiner i disse cellene ble bestemt ved immunocytokjemi som beskrevet ovenfor.
TUNEL-analysen
parafininnstøpte vev objektglass ble fremstilt fra de xenograft tumorer. TUNEL farging ble oppdaget av Tunel analysen kit (Roche) i henhold til produsentens anvisninger. Apoptotiske kjerner ble analysert ved å telle det totale antall TUNEL-positive kjerner, med unntak av celler som gjennomgår mitose i 10 tilfeldige områder.
Western blotting
Cellelysater ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat (SDS ) polyakrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann, ble følgende antistoffer anvendt for western blotting: anti-Sox2 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:500), anti-Bmi1 (1 :500), anti-Oct4 (1:500), anti-Nanog (1:500), anti-vimentin (1:500), anti-snegle (1:500), anti-β-catenin (1:500) , anti-E-cadherin (1:500), og anti-β-aktin (1:1000) over natten ved 4 ° C. Alle antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, med mindre annet er angitt. Etter vasking ble de bundne antistoffer visualisert ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert anti-geit, maur-kanin eller anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific Inc., New York, New York) og den Immobilon vestlige Chemiluminescent Substrate HRP (Millipore, Billerica, MA) og deretter visualisert på X-ray filmer [21]
flowcytometrisystemer og separasjon av EGFP
+ og EGFP
-. Bestander av FACS
livmorhalskreft cellelinjer var dyrket i 48 timer etter transfeksjon med pSox2 /EGFP. Cellene ble fordøyd og resuspendert i PBS supplert med 2% FBS, og andelen av EGFP
+ celler ble bestemt ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
Cell syklus analyse ble utført ved hjelp av FACS henhold til produsentens protokoll. Cellene ble høstet og fiksert i 70% etanol over natten ved 4 ° C. Tretti minutter før FACS-analyse ble cellene behandlet med RNaseA og deretter farget med propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich). Cellesyklus distribusjon ble analysert med en FACSCalibur flowcytometer hjelp Mod-Fit LT programvare
For å få EGFP
+ og EGFP
-. Populasjoner, Siha og C33A celler ble transfektert med pSox2 /EGFP plasmid bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Seleksjon ble utført ved anvendelse av standard kulturmedium med 1 mg /ml G418. Den generasjonen av encellete-avledet kulturer ble utført ved hjelp av en FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Sorterings portene ble etablert som den høyeste og laveste 10% av EGFP-uttrykke celler. Cellene ble dyrket i DMEM /F12 med 1x B-27 serum-fritt supplement (Invitrogen), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor [22], og basisk fibroblast vekstfaktor (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ).
Tumorsphere Formation Assay
De sorterte celler ble opprettholdt i stamcelle media bestående av DMEM /F12 media basal, N2 og B27 kosttilskudd (Invitrogen), 20 ng /ml humant rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) og 20 ng /mL grunn fibroblastisk vekstfaktor (bFGF; Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ)
for det tumorsphere-analysen ble cellene sådd ut i en tetthet på 200 celler /brønn i 24-brønners ultra. -Lav feste plater eller i en tetthet på 1 celle /brønn i 96-brønners plater og opprettholdt i stamcelle media. Tumorspheres som oppsto innen 2 uker ble registrert. For serie tumorsphere formasjons analyser, ble kulene høstet, skilt ut med 0,25% trypsin /EDTA, filtrert gjennom en 40 pm sikt og re-belagt som beskrevet ovenfor.
Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra det laveste og høyeste 10% av EGFP-uttrykkende celler med TRIzol reagens (Invitrogen). RNA-konsentrasjonen ble bestemt, og total cDNA ble anvendt som et templat for PCR-amplifikasjon. Real-time kvantitativ PCR ble utført i tre eksemplarer for hver primer sett ved hjelp av en iQ5 Flerfarget Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA). Protokollen for real-time PCR var en syklus på 95 ° C i 30 sekunder etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder med påfølgende dissosiasjon trinn. Syklusen terskelverdien ble bestemt som det punktet hvor fluorescens skredet en forhåndsinnstilt grense bestemt av instrumentets programvare.
Tumor Xenotransplantat analysen
Seks uker gammel kvinne NOD /SCID mus ble brukt å vurdere stamcelleegenskaper
in vivo
. -Celler ble injisert inn i underhuden på fotens rygg med en blanding av 01:01 Matrigel. Tumorvolumet (V) ble bestemt ved lengden (a) og bredde (b) som V = ab
2/2. De eksperimentelle protokollene ble evaluert og godkjent av Animal Care og bruk komité Medical School of Xi’an Jiaotong University.
cellevekst og cellelevedyktigheten Analyser
Cells (2 × 10
4) ble dyrket i triplikat i 35-mm kulturskåler i 7 dager. Cellene ble høstet i lengderetningen og telt ved bruk av et hemocytometer og et lysmikroskop. Cellelevedyktigheten ble vurdert ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma-Aldrich) fargestoff i henhold til en standard protokoll. Antall levedyktige celler ble bestemt ved å måle absorbansen ved 490 nm.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med SPSS 16,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). De to-tailed chi-kvadrat test ble benyttet for å bestemme betydningen av forskjeller mellom kovariatene. Students t test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans når to grupper ble sammenlignet. For å undersøke forholdet mellom to kvantitative variable, ble Pearsons lineær regresjonsanalyse utført. I alle tester, p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Utvikling av EGFP-uttrykk Plasmid drevet av Human Sox2 Transkripsjonell Elements
For å isolere den distinkte endogene Sox2. -expressing undergruppe og avgjøre om det har preg av cscs, vi konstruerte plasmid pSox2 /EGFP, som inneholder 11,5 kb av menneske Sox2 promotersekvens plassert oppstrøms for EGFP reporter. Dette plasmid inneholder også den humane Sox2 3’UTR, 3 «poly (A) hale, og 3»-enhancer plassert nedstrøms av EGFP reporter. I tillegg ble en uavhengig SV40 promoter-drevet neomycinresistens kassetten benyttes for å tillate for positiv utvelgelse av celler som ervervet plasmidet uavhengig av deres evne til å aktivere den Sox2 promoter (fig. 1).
Skjematisk av pSox2 /EGFP reporter system. Den hSox2 promoter og transkripsjons elementer inkludert 3’UTR, poly (A) halen, og 3 «Enhancer ble klonet inn i pEGFP vektoren.
Sortering Stue Endogene Sox2-uttrykker livmorhalskreftceller Bruke pSox2 /EGFP system
Sox2 uttrykk var preget i fire menneskelivmorhalskreft cellelinjer (HeLa, Siha, CaSki, og C33A) ved hjelp av pSox /EGFP system samt western blot og immunocytokjemisk analyse (fig. 2A). Sox2 var synlig som nukleær farging av immunkjemi i enkle eller gruppert Siha og C33A celler (Fig. 2B). Imidlertid Sox2 var ikke påvisbart i HeLa eller CaSki-celler ved western blot eller immunokjemisk analyse (Fig. 2A og 2B). Når pSox2 /EGFP ble transient transfektert inn i fire menneskelivmorhalskreft cellelinjer, 6,31% og 4,10% av EGFP-positive celler kunne påvises ved FACS i de transfekterte Siha og C33A celler, henholdsvis (Fig. 2C). Imidlertid er bare 0,84% og 0,69% av EGFP-positive celler var observerbar i de transfekterte HeLa og CaSki-celler, henholdsvis (fig. 2C). EGFP-positive celler omfattet mindre enn 0,2% av hvert utransfekterte kontroll livmorhalskreft cellelinje (Fig. 2C), noe som tyder på at de fleste EGFP-positive celler i pSox2 /EGFP-transfekterte cervikale kreftceller ble endogene Sox-uttrykkende celler. Alt i alt, de oppnådde resultater ved bruk av pSox2 /EGFP-systemet var i overensstemmelse med Sox2 uttrykk resultatene fra western blot og immuncytokjemisk analyse i alle fire cervical cancer-cellelinjer. Disse resultater antyder at den pSox2 /EGFP plasmid-systemet er egnet for isolering av endogene Sox2-uttrykkende cervikale kreftceller. I tillegg, fordi flere Siha og C33A celler endogent uttrykt Sox2 forhold til HeLa og CaSki cellene ble Siha og C33A cellelinjer valgt å vurdere om endogene Sox2-uttrykke celler er cscs i cervical karsinomer.
Sox2 protein uttrykk var oppdaget av western blot (A) og immunhistokjemi (B) i livmorhalskreft cellelinjer HeLa, Siha, CaSki, og C33A. (C) Overflod av EGFP-positive tumorceller i livmorkreft cellelinjer transfektert med pSox2 /EGFP reporter. (D) Immunhistokjemisk analyse av EGFP
+ og EGFP
– celler. (E) Sox2 protein uttrykk i et monolag, tumorsphere celler, og sortert EGFP
+ og EGFP
– celler
For å få leve Sox2-uttrykke celler, Siha og C33A celler. transfektert med pSox2 /EGFP-plasmidet. Etter valget i kultur med 1000 mikrogram /ml G418 i to uker, ble alle G418-resistente celler samlet og sortert ved hjelp av en FACSAria jeg; cellene som falt inn i 10
th og 90
th persentiler av EGFP uttrykk ble sortert og samlet inn i to separate rør. Den første rør, som inneholdt celler med høyest EGFP ekspresjon, ble funnet å inneholde mer enn 90% av alle EGFP-uttrykkende celler, og ble referert til som den EGFP-positive populasjon. Den andre rør, som inneholdt cellene i den laveste 10% av EGFP uttrykk, bare inneholdt EGFP-ikke-uttrykkende celler, og ble referert til som den EGFP-negative pasienter (fig. 2D). Videre western blot og immunocytokjemisk analyse viste at bare EGFP
+ Siha og EGFP
+ C33A celler uttrykt Sox2 protein; EGFP
– Siha og EGFP
– C33A cellene inneholdt ingen påvisbare Sox2 protein (Fig 2E.). Disse resultatene indikerer at pSox2 /EGFP systemet kan brukes til å lykkes slags levende celler som endogent uttrykker Sox2 fra livmorhalskreft cellelinjer.
EGFP-positive celler har en høyere kapasitet for tumorigenitet enn EGFP-negative celler
En av de viktigste egenskapene til cscs er deres kraftige evne til å danne svulster. For å teste tumordannelsen evne til EGFP + cervikale kreftceller, ble EGFP-positive og EGFP- cellepopulasjoner sortert fra både Siha og C33A cellelinjene injisert subkutant inn i NOD /SCID-mus. Når 10
5 celler ble inokulert i NOD /SCID-mus, både EGFP + og EGFP- bestander av Siha og C33A celler dannes svulster. Imidlertid tumorene dannet av Siha-EGFP
+ celler vokste mye raskere (figur 3A.) Og var mye større (figur 3B og 3C.) Enn de som dannes ved den Siha-EGFP
–celler (fig. 3A, B og C; p 0,05). Tilsvarende C33A-EGFP
+ celler dannet svulster som vokste mye raskere og var mye større enn de som dannes ved C33A-EGFP
– celler (figur 3D, E og F;. P 0,05). Svulstdannelse som en funksjon av inokulering av forskjellige fortynninger av EGFP
+ og EGFP
– Siha og C33A-celler er oppsummert i tabell 1. tumor-initiering frekvensen for Siha-EGFP
+ celler var 1/402 , som var 17,7 ganger høyere enn for de Siha-EGFP
– celler (1/7114; p 0,001). Den tumor-initiering frekvensen for C33A-EGFP
+ -celler var 1/3058, som var 23,8 ganger høyere enn den for C33A-EFGP
– celler (en /72860; p 0,001), noe som tyder på at EGFP-positive Siha og C33A befolkningen inneholdt flere cscs enn EGFP-negative befolkningen. Videre ble apoptose /spredning celle rente evaluert i xenograft (TUNEL /Ki67 flekker) for å utelukke muligheten for at redusert tumorvekst ved EGFP- celler skyldes en mindre celle levedyktighet, tunel og Ki67-merking resultater i xenograft vev ved Siha og C33A-celler ble vist på figur 3G og oppsummert i fig. 3H. Det er ikke noen forskjeller i TUNEL og Ki67-positiv celle hastighet i xenograft vev som er dannet av Sox2-positiv og negativ Siha og C33A celler, noe som antyder det reduserte tumorvekst med EGFP- cellen var ikke på grunn av den mindre cellenes levedyktighet. Til sammen alle disse resultatene indikerer at endogene Sox2-uttrykke livmorhalskreftcellene har betydelig forbedret svulstdannelse evne fordi EGFP + Siha og C33A cellene inneholdt flere cscs enn EGFP- celler.
Tumor vekstkurver (A) og tumor vekter (B, C) av NOD /SCID mus inokulert med Siha-EGFP
+ og Siha-EGFP
– celler (1 x 10
5 celler). Tumorvekstkurver (D) og tumorvektene (E, F) av NOD /SCID-mus inokulert med C33A-EGFP
+ og C33A-EGFP
–celler (1 x 10
5 celler). Den apoptose /proliferasjon celle hastigheten ble evaluert ved Tunel analyser og Ki67-merking i xenograft (G og H) av EGFP + og EGFP- celler. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p . 0,05
EGFP-positive celler Exhibit en høyere evne til selvfornyelse og differensiering enn EGFP-negative celler
Bortsett fra tumordannelse evne, cscs dele to viktige egenskaper med stamceller: selvfornyelse og differensiering. Den tumorsphere-analysen er anerkjent som en klassisk analyse for selvfornyelse. EGFP-positive og EGFP-negative Siha og C33A livmorhalskreftceller ble dyrket i serumfritt medium under forhold som var optimal for voksende tumorspheres. Som vist på fig. 4A, EGFP-positive celler isolert fra Siha og C33A cellelinjer generert klassiske tumorspheres, mens EGFP-negative celler dannet noen celle aggregater men ikke danner tumorspheres. For å utelukke virkningene av celle aggregering, noe som kan forekomme i kulturer med lav tetthet, ble cellene dyrket ved en tetthet på 1 celle /brønn etter enkelt-cellesortering ved hjelp av FACS for å teste deres evne til tumorsphere dannelse i 96-brønners plater. Omtrent 6% av EGFP-positive celler Siha dannet tumorspheres, som var vesentlig høyere enn andelen av EGFP-negative Siha celler som dannes tumorspheres (ca. 1,6% tumorsphere formasjon; p 0,05). Tilsvarende mer EGFP-positive celler C33A dannet tumorspheres (ca. 12%) sammenlignet med EGFP-negative C33A-celler (ca. 3%) (figur 4B;. P 0,05). Videre begge EGFP-positive Siha og C33A cellene var i stand til å danne tumorspheres i tre påfølgende avsnitt av tumorsphere kulturer, og disse cellene dannet mange flere tumorspheres enn EGFP-negative celler i hver kultur passasje (fig 4C, p. 0,05). Videre ble apoptose /spredning celle rente evaluert i tumorsphere (TUNEL /Ki67 flekker) for å utelukke muligheten for at redusert tumorvekst ved EGFP- cellene er på grunn av mindre celle levedyktighet. TUNEL og Ki67-merking resulterer i tumorspheres etter Siha og C33A-celler ble vist i figur 4D og oppsummert i fig. 4E, hvor det ikke er noen forskjeller i TUNEL og Ki67-positiv celle hastighet i tumorspheres mellom Sox2-positive og negative Siha og C33A celler, noe som tyder på at den minsket tumorsphere formasjonen kapasitet ved EGFP- celler var ikke på grunn av den mindre cellenes levedyktighet . Samlet utgjør disse funnene tyder på at endogene Sox2-uttrykke Siha og C33A celler muligens inneholde flere celler som har selvfornyelse evne.
(A, B) Tumorsphere formasjon analyse bilder og antall tumorspheres dannet av Siha og C33A celler i kulturer med lav tetthet. (C) Tumorsphere dannelse analyse av EGFP
+ celler under passaged kultur følgende encellede sortering av FACS. Den apoptose /proliferasjon celle hastigheten ble evaluert ved Tunel analyser og Ki67-merking i xenograft (D og E) av EGFP + og EGFP- celler. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p 0,05
For å identifisere den selvfornyelse evne
in vivo
, serie transplantasjon analysen ble utført med 10
2 av Sox2 positive og. negative Siha og C33A celler, henholdsvis. De Sox2-positive Siha og C33A celler kan danne svulster i serie tre passasjer av transplantasjonsforsøk. Imidlertid 10
2 av de Sox2 negative celler ikke kunne danne en hvilken som helst svulst i den første transplantasjon eksperimentet. Derfor Sox2 positive Siha og C33A celler har mer selvfornyelse evne enn de negative celler
in vivo
. Videre ble det Sox2-proteinet detekteres ved immunhistokjemisk farging i tumor xenograft vev dannet av EGFP-positive og EGFP-negative Siha og C33A celler (figur 5A). Både Sox2-positive og Sox2-negative celler ble funnet i tumorxenografter dannet av EGFP-positive celler. Imidlertid kan bare Sox2-negative celler påvises i tumorvev som dannes av Sox2-negative cervikale kreftceller. Disse resultatene ytterligere understøttet at Sox2-positive Siha og C33A celler ikke bare har den selvfornyelse evne til å reprodusere de Sox2-positive celler, men også ha differensieringen evnen til å produsere de Sox2-negative celler
in vivo
.
(A) Sox2 uttrykk ble oppdaget av IHC i xenograft vev dannet av Siha-EGFP +, Siha-EGFP-, C33A-EGFP + og C33A-EGFP- celler. (B) Den prosenter av EGFP + celler i den første, andre og tredje passasjer i differensiering medium. Bars = SE. *, P. 0,05
Når EGFP-positive Siha og C33A celler ble dyrket i DMEM inneholder 10% FBS, andelen av EGFP-positive Siha celler ble redusert fra 95,78% i første passasje til 77,16% i den andre passasje, og 34,82% i den tredje passasje. På tilsvarende måte, andelen av EGFP-positive C33A celler ble redusert fra 90,32% i den første passasje til 44,56% og 12,01% i den andre og tredje passasjer i differensiering medier, henholdsvis (fig. 5B). I tillegg kan EGFP-negative Siha og C33A celler bare generere EGFP-negative celler, og kan ikke gi noen EGFP-positive celler (Fig. 5B). Disse resultatene indikerer at bare endogene Sox2-uttrykke livmorhalskreftcellene har differensiering evne in vitro.
EGFP-positive livmorhalskreft celler uttrykker Mer Stem Cell relaterte proteiner enn EGFP-negative celler
Sox2, OCT4, Bmi1, og Nanog er anerkjent som stamcelleselvfornyelse-relaterte atomtranskripsjonsfaktorer. Vi sammenlignet ekspresjonen av disse transkripsjonsfaktorer i EGFP-positive celler, EGFP-negative celler og tumor-xenografter. Som vist i figur 6, real-time PCR (fig. 6A), western blot analyse (Fig. 6B og C), og immunhistokjemisk analyse (fig. 6D) viste at EGFP-positive Siha celler og tumorer som dannes av disse cellene uttrykte høyere nivåer av Bmi1, OCT4, og Sox2 proteiner enn EGFP-negative Siha celler både på transkripsjonsnivået (fig. 6A) og det translasjonelle nivå (fig. 6B, C og D). Men Nanog protein uttrykk var uendret
(A) Differential uttrykk for flere stamcellerelaterte gener i Siha-EGFP
+ og Siha-EGFP
-. Fraksjoner validert av qPCR. (B) Påvisning av stamcellerelaterte faktorer sortert Siha-EGFP
+ og Siha-EGFP
– celler ved western blot. (C) Semi-kvantitativ analyse av stamcellemessige forhold i forhold til p-aktin. (D) Stamcellerelatert genekspresjon i tumorxenografter ble detektert ved immunohistokjemi. ALDH1 ble detektert ved immunohistokjemi (E), western blot (F), og semi-kvantitativ analyse (G) i Siha-EGFP
+ og Siha-EGFP
– tumorer. β-aktin ble benyttet som kontroll for lasting RT-PCR og western-blotting. Feilfelt representerer S.D. (N = 3). * P. 0,05
Videre, i de senere årene har et økende antall studier indikerte at ALDH-positive celler representerer cscs i mange somatiske svulster [23]. I denne studien, immunkjemiske farging (Fig. 6E, til venstre) og western blot analyser (Fig. 6F og G) viste at EGFP-positive celler uttrykte ALDH, mens EGFP-negative celler ikke. Immunhistokjemisk analyse viser også at svulstvevet dannet av EGFP-positive Siha celler, ikke de som er dannet av EGFP-negative Siha celler, ble farget av ALDH1 antistoff (Fig. 6E, høyre). I C33A celler ble stamcelle relaterte gener Bmi1, OCT4 og Nanog også oppdaget av western blot. Resultatet viste at C33A-EGFP + subpopulasjonen celler uttrykte mye sterkere enn C33A-EGFP- celler, forventer Nanog, som var lik Siha celler (figur S1, A og B). I tillegg ALDH1 var detekterbar i EGFP + -celler, men ikke i EGFP- celler ved western blot og IHC (fig S1, A-C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at EGFP-positive livmorhalskreftceller uttrykker også noen stamcellerelaterte faktorer, som OCT4, Bmi1, og ALDH1.
EGFP-positive Cervical kreft celler utstilt Flere EMT funksjoner enn EGFP- negative celler
EMT induksjon har blitt rapportert å generere celler med stilk-lignende egenskaper [24], og cscs dele noen eiendommer med celler som gjennomgår EMT [25], [26]. Her, vurderte vi status for EMT markører i Sox2-positive celler, Sox2-negative celler, og tumorvev dannet av disse cellene (fig. 7). I Siha-EGFP
+ celler og tumorvev, real-time PCR viste at mesenchyme proteiner som vimentin, sneglen, og β-catenin ble markert oppregulert på mRNA-nivå (fig. 7A). Tilsvarende Western blot (Fig. 7B), immunocytokjemisk (fig. 7C), og immunohistokjemiske analyser (fig. 7D) viste at de var også oppregulert på proteinnivået. I motsetning til dette, ble E-cadherin, et velkjent epitelial markør, nedregulert i EGFP-positive celler og Siha oppregulert i EGFP-negative celler og tumor-xenografter (Fig. 7A-D). Vi har også funnet at EMT-relaterte gener, vimentin og β-catenin, ble uttrykt på et høyere nivå i EGFP-positive C33A celler enn det i EGFP-negative celler ved Western blot og immunocytokjemisk farging. Den epiteliale markør E-cadherin var detekterbar i C33A-EGFP- celler, men ikke i C33A-EGFP + celler. Imidlertid sneglen protein ble ikke uttrykt i både EGFP-positive og EGFP-negative celler. (Figur S2).
