Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i Amerika. Monoklonale antistoffer er et levedyktig alternativ behandling for å hemme kreft vekst. Tumorspesifikk legemiddelavlevering kan oppnås benytte disse monoklonale antistoffer som målsøkende midler. Denne typen designer terapeutisk utvikler seg og med bruk av gull nanopartikler det er en lovende tilnærming til selektivt levere kjemoterapeutika til ondartede celler.
Gull nanopartikler (GNPs) viser ekstrem løftet i dagens medisinske forskning. GNPs har vist seg å ikke-invasiv drepe tumorceller ved hjelp av radiofrekvens-hypertermi. De har også blitt gjennomført så tidlig deteksjon midler på grunn av deres unike røntgenkontrastegenskaper; suksess ble avslørt med klar avgrensning av blodkapillærene i en preklinisk modell av CT (computertomografi). De grunnleggende parametrene for intelligent design av nanoconjugates er i forkant. Målet med denne studien er å definere de nødvendige design parametere for å kunne målrette kreft i bukspyttkjertelen celler.
Metodikk /hovedfunnene
nanoconjugates beskrevet i denne studien var preget med ulike fysisk-kjemiske teknikker. Vi viser at antallet av cetuximab molekyler (målsøkende middel) på en BNP, den hydrodynamiske størrelse nanoconjugates, tilgjengelig reaktivt overflateareal og evne til nanoconjugates binder EGFR (epidermal growth factor receptor), alle spiller viktige roller i en effektiv målretting tumorceller
in vitro Hotell og
in vivo
i en orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen.
Konklusjon
Våre resultater tyder på den spesifikke målrettingen av kreftceller, avhenger på et antall viktige komponenter 1) målsøkende middel til nanopartikkel-forholdet 2) tilgjengelighet av reaktivt overflateareal på nanopartikkel 3) evnen til nanoconjugate til å binde target og 4) hydrodynamiske diameter av nanoconjugate. Vi tror denne studien vil bidra til å definere designparametre for å formulere bedre strategier for spesielt rettet mot svulster med nanopartikkel konjugater
Citation. Khan JA, Kudgus RA, Szabolcs A, Dutta S, Wang E, Cao S, et al . (2011) Prosjektering Nanoconjugates Effektivt Target kreft i bukspyttkjertelen celler
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE seks (6): e20347. doi: 10,1371 /journal.pone.0020347
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 02.12.2010; Godkjent: 30 april 2011; Publisert: 27 juni 2011
Copyright: © 2011 Khan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health CA135011, CA136494, CA150190 og en MD Anderson Cancer Center Developmental Grant (UTMD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft hevder nesten 25% av dødsfall årlig. Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i Amerika, i både menn og kvinner. Til tross for store anstrengelser for å oppdage og behandle kreft i bukspyttkjertelen, forekomst og dødelighet forblir tilnærmet samme. Tidlig diagnose og effektiv levering av terapeutiske midler til ondartede celler forblir de to store utfordringene i kreft forvaltningstiltak [1].
Monoklonale antistoffer mot vekstfaktor-reseptorer har vist seg å være levedyktig behandlinger for å hemme kreft vekst [2] . Utilizing these monoklonale antistoffer, målsøkende midler for tumor bestemt leveranse er i utvikling som en lovende tilnærming til selektivt deliver chemotherapeutics [3]. Uorganiske nanomaterialer blir studert som leverings redskap for målrettet levering av legemidler. Gull nanomaterialer er av særlig interesse på grunn av den unike fysiko-kjemiske og optiske egenskaper, enkel syntese og overflatemodifisering [1], [4], [5], [6], [7], [8], [9] [10], [11], [12], [13].
Gull nanopartikler (GNPs) har nylig blitt brukt til å drepe kreftceller ved hypertermi bruk av ikke-invasiv radiofrekvente [14]. Deres verktøy som kontrastmiddel har også blitt demonstrert av klar avgrensning av blodkapillærene i en preklinisk modell av CT (computertomografi) i forhold til de konvensjonelle jod basert kontrastmidler [15]. Begge studiene er håpefull og deres nytte er ytterligere oppmuntret av sikkerhetsprofilen [16], [17].
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et viktig mål i kreftforskning. Det er overuttrykt i mange humane maligniteter, inkludert kreft i bukspyttkjertelen. Human EGFR er et transmembran-glykoprotein [3], [18], [19], [20]. Den består av et ekstracellulært ligand-bindende domene, et hydrofobt transmembrandomene og et intracellulært tyrosinkinasedomene. Ligand-binding til EGFR induserer reseptor homo /heterodimerisering som fører til fosforylering av tyrosinrester. Fosforylering av EGFR aktiverer komplekse ned strømmen signaliserer hendelser som førte til spredning, migrasjon, invasjon, og hemming av apoptose av kreftceller [21], [22], [23].
Det monoklonale anti-EGFR-antistoff, Cetuximab (C225) er en unik målsøkende middel til å målrette EGFR-positive cancerceller. Cetuximab ble godkjent av FDA for behandling av pasienter med EGFR positive tykktarmskreft (CRC) [21], [22], [23]. Det har også blitt godkjent eller er i ulike faser av kliniske studier i mange andre kreftformer som NSCLC (ikke-småcellet lungekreft), SCCHN (plateepitelkarsinom i hode og hals) og kreft i bukspyttkjertelen [24], [25] [26]. Cetuximab er et kimært human:murine immunoglobulin G1 (IgG1) monoklonalt antistoff (MOAB). Bindingen av C225 til EGFR fører til reseptoren intern og nedbrytning uten reseptor fosforylering, og dermed hemme EGFR-assosiert trasé [24], [25], [26].
Til tross for den voksende nytten av GNPs i målrettet levering fundamental spørsmål forblir ubesvart. Hva er designkriterier for fabrikasjon nanoconjugates som vil sikre maksimal opptak i kreftceller? Heri, bruker vi cetuximab (C225) som en målsøkende middel og BNP som modellsystem. Vi viser at antallet C225 antistoffer på en BNP (C225:GNP forhold), den hydrodynamiske størrelse, det tilgjengelige reaktive overflateareal og evne til nanoconjugate binder EGFR, alle spiller viktige roller i en effektiv måte å målrette tumorceller
i vitro Hotell og
in vivo
i en orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen. Opptaksstudier med isotype kontroll IgG-BNP, viser at spesifisiteten til tumorcelle målretting er avhengig av nanopartikkeloverflatedekning av C225. Ikke-spesifikt opptak avtar når C225 til BNP ratio øker. Disse studiene er avgjørende for å utvikle et effektivt målrettet levering system for fremtidig klinisk bruk.
Arbeidet som presenteres her viser systematisk karakterisering av BNP-C225 nanoconjugates. Den spesifikke målgruppe potensiale ble undersøkt, både
in vitro Hotell og
in vivo
i en orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen. Våre resultater viser at den hydrodynamiske radius, tilgjengelig reaktivt overflateareal og lastekapasitet på C225 på GNPs spiller avgjørende roller for effektiv målretting av tumorceller. Disse funnene markere viktige parametere for å bli vurdert for en lovende nanopartikkel basert medikamentleveringssystem for fremtidig klinisk anvendelse.
Resultater
Karakterisering av nanoconjugates med variabel antistoff til nanopartikkel forholdstall
for å forstå parametrene som kreves for spesifikk målretting av nanoconjugates til kreftceller, valgte vi cetuximab (C225) som en målsøkende middel. C225 er et kimært humant-murint monoklonalt antistoff som binder til det ekstracellulære domene av EGFR [3]. EGFR er overuttrykt i mange humane ondartede sykdommer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, hvilket gjør det til et attraktivt mål [18]. For å bestemme den optimale valens C225 på GNPs (antall C225 molekyler per BNP og dermed C225:GNP ratio) for intracellulære opptaket, syntetisert vi ulike nanoconjugates med flere C225:GNP forholdstall. Karakterisering av disse nanoconjugates ble utført ved hjelp av flere fysiske teknikker: UV-Synlig (UV-Vis) spektroskopi, transmisjonselektronmikroskopi (TEM), dynamisk lysspredning (DLS) og Radiojodering av C225 med
125I. De GNPs brukt i denne studien ble syntetisert ved natriumborhydrid reduksjon av tetraklorgull [27], [28]. Som tidligere rapportert, er tilstedeværelsen av en overflate-plasmonresonans-bånd ved ca. 510 nm bekrefter dannelsen av sfæriske gull nanopartikler (Figur S1). Dannelsen av sfæriske GNPs og deres 5 nm størrelsesdiameter ble ytterligere bekreftet ved TEM (data ikke vist).
BNP-C225-konjugater ble så syntetisert ved anvendelse av denne naken BNP-løsning og renset som beskrevet i materialer og fremgangsmåter seksjon. Antistoffet binder spontant til GNPs gjennom Au-S og Au-N bonding [19]. Fremstillingen av BNP-C225 ble overvåket ved UV-vis spektroskopi. Det er åpenbart at med tillegg av C225 er det en gradvis endring i rød SPR band av den nakne gull, fra 510 nm til 519 nm (Figur 1a). En slik rød forskyvning i SPR båndet til GNPs antyder endringen av de elektriske dobbelt lag av antistoffet som omgir GNPs og således indikerer binding av antistoffet til nanopartikler [29], [30].
en . Endring i absorbsjonsmaksima som en funksjon av økende konsentrasjon av C225 i fravær (kuler) og nærvær av NaCl (triangler). b. Konsentrasjon av C225 bundet til BNP som en funksjon av økende konsentrasjon av C225, bestemt ved å måle konsentrasjonen av fri merket C225 med I125 i supernatanten, etter pelletering ned BNP-C225-konjugater ved ultrasentrifugering.
For ytterligere å bekrefte BNP-C225 konjugering vi utfordret nanoconjugates mot salt indusert aggregering (kritisk koagulering konsentrasjon). Tilsetning av 140 mM NaCl er blitt rapportert å resultere i aggregering av åpen eller delvis dekket partikler, fører en slik aggregering til en dramatisk endring i rød SPR båndet. Den absorpsjonsspektra av de nanoconjugates ble registrert 15 minutter etter inkubasjon med 140 mM natriumklorid (NaCl). Som forventet, de nakne GNPs viste en drastisk rød skift i SPR band fra 510 nm til ca 600 nm (Figur 1a) som bekrefter aggregering av udekkede nanopartikler [31]. Salt indusert aggregering var direkte knyttet til den økte belastning av C225 på BNP overflate, derav SPR bandet helt forsvunnet ved en C225 til BNP-forhold på 3 (tre C225 molekyler pr BNP) som tyder på fravær av tilgjengelig reaktiv overflate for salt indusert aggregering.
Kvantifisering av C225 binding til gull nanopartikler av Radiojodering
bindingen av C225 til GNPs ble kvantifisert ved hjelp av radiomerket
125I-C225. Et fast konsentrasjon av GNPs ble inkubert med
125I-C225 på ulike C225:GNP forhold. Konjugatene ble sentrifugert ved høy hastighet (45000 g) i 1 time for å separere ubundet antistoff fra nanoconjugates. Effektiviteten av BNP-C225-I
125 binding ble deretter bestemt ved å måle utsendelse av gammastråler som kommer fra den frie og bundne
125I-C225 i supernatanten og pelleten fraksjonene, henholdsvis. Som vist i figur 1b og fig S2, var det en svært høy bindingsprosentandel av C225 (~90%) for å GNPs opp til et forhold på 3 (3 C225 molekyler pr BNP). Imidlertid er en minimal økning i binding observert over et forhold på 3. Dette lille økning i høye antistoffkonsentrasjoner kan være på grunn av svake ikke-spesifikke protein-protein interaksjoner mellom bundet og fritt antistoff. Denne informasjonen videre bekrefter observasjoner gjort av UV-Vis-spektroskopi diskutert ovenfor; hvor omfanget av salt indusert aggregering ble funnet å være minimal i forholdet 3.
Målrettet levering av gull nanopartikler til kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro
For å forstå hvilken rolle multivalency på den intracellulære opptak av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer med variabel EGFR uttrykk, behandlet vi ASPC-en, PANC-1 og MiaPaca-2 celler med BNP-C225 eller uspesifikke isotypekontrollantistoff BNP-IgG på ulike antistoff til BNP (Ab:GNP) forholdstall. EGFR uttrykk i disse cellene følger rekkefølgen ASPC-1≥PANC-1 MiaPaca-2 [19]. Mengden av cellulært opptak for BNP-C225 og BNP-IgG i de forskjellige cellelinjer ble kvantifisert ved å bestemme gullinnholdet i cellene gjennom instrumentell nøytron aktiveringsanalyse (INAA). Figurene 2a, 2b og 2c representerer gull innhold av ASPC-1, PANC-1 og MiaPaca-2-celler, respektivt. Det fremgår av figurene at opptaket av de nanoconjugates i alle tre cellelinjer øker gradvis med økende C225:GNP forholdet (økt valens). Det maksimale opptak ble observert med 1,5 forholdet (svarte søyler); utover dette forholdet opptaket av de nanoconjugates gradvis redusert. Opptaket utviklingen av den nanoconjugates følger et lignende mønster i alle de tre cellelinjer. Det er også viktig å merke seg at graden av opptak var mye mindre for de tilsvarende forhold for isotype kontroller, BNP-IgG (grå søyler). Interessant var den ikke-spesifikt opptak av BNP-IgG gradvis avtok med økende IgG:GNP forhold hvor minimumsopptak ble observert i et forhold på 3. Det er sannsynlig at ved den nedre Ab:GNP forholdet, det tilgjengelige frie reaktive overflateareal på BNP kan ikke-spesifikt bindes enten til serumproteiner eller cellemembraner eller begge deler; som i sin tur kan bidra til ikke-spesifikt opptak av nanoconjugates. Adsorpsjon av serumkomponenter er kjent for å påvirke opptaket av BNP [32]. Økende Ab:GNP forhold bør øke antistoff dekningen av nanopartikler overflate, og dermed gi mindre åpent areal tilgjengelig for ikke-spesifikke interaksjoner. Reduksjon av slike ikke-spesifikke interaksjoner kan forklare redusert opptak av BNP-IgG konjugater observert ved høyere forholdstall (figur 2).
a. ASPC-1 celler, f. PANC-1 celler, c. MiaPaca-2 celler, behandlet med BNP-C225 (svarte søyler) eller BNP-IgG (grå søyler) forberedt på ulike Ab:GNP forholdstall. Y-aksen representerer Gold konsentrasjon som ppm av total tørrvekt av celler.
Intern av nanoconjugates av kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro
For ytterligere å bekrefte den intracellulære opptak og lokalisering av GNPs, TEM-analyse ble utført etter behandling av cellene med det samme nanoconjugates brukes for opptaksstudier. Figur 3 viser TEM mikrografer av ASPC-1 celler etter behandling med BNP-C225 med varierende C225:GNP forholdstall. Lav, middels og høy forstørrelse bildene er representert for C225:GNPs forholdstall på 0,38, 1,5 og 3,0 (figur 3). De nanoconjugates er vist innenfor de vesikulær strukturer av celler, noe som bekrefter intracellulære opptaket av nanoconjugates. Lignende resultater ble også oppnådd med PANC-1 og MiaPaca-2-celler (figurene S3, S4). Differensial opptak av de GNPs av kreftceller som har forskjellige C225:GNP forhold kan også være på grunn av differensial affiniteten av nanoconjugates å binde EGFR, eller størrelsen på nanoconjugates. Interessant, når de samme cellelinjer ble behandlet med BNP-IgG isotype kontroll, de fleste av GNPs er funnet ved periferien av cellemembranen med minimal endocytose (figur S5). Dette er konsistent med en fersk rapport som beskriver målretting av en solid svulst med transferrin belagt GNPs [33].
TEM bilder på ulike forstørrelser, viser internalisering av BNP-C225. Vennligst se figur S3 og S4 for TEM bilder som illustrerer BNP-C225 intern av PANC-en og MiaPaca-2 celler.
Hydrodynamisk diameter på nanoconjugates og deres evne til å beslaglegge EGFR
i et forsøk på å fremkalle den mekanisme for differensial opptak av BNP-C225, hypotese vi at de forskjellige C225:GNP forhold har differensial evnen til å binde EGFR. For å validere denne hypotesen, utførte vi western blot analyse. De forskjellige BNP-C225 og BNP-IgG konjugater ble inkubert med ASPC-1-cellelysater i 2 timer, deretter sentrifugert ved høy hastighet. Pelleten ble vasket en gang og deretter ble supernatanten og pelleten ble underkastet Western blot-analyse for å detektere den relative tilstedeværelse av EGFR i de forskjellige fraksjoner. Resultatene er vist i figur 4a. Dette viser klart det er en progressiv utarming av EGFR i supernatanten med en økende C225:GNP forhold (midtre panel). Også interessant å legge merke til en anrikning av EGFR i pelletfraksjonen (øvre panel) nådde et platå ved et forhold på 01/05 til 02/29, mest sannsynlig en funksjon av C225 lasting på pelleten overflaten. p-aktin nivåer ble brukt som laste kontroller som viser lik belastning av protein i forskjellige baner. Det er også viktig å merke seg at når de samme lysater ble behandlet med BNP-IgG, ble nesten ingen påvisbar EGFR befinner seg i pelletfraksjonen, for det meste den ble funnet i supernatantfraksjonen, noe som ytterligere bekrefter bindingsspesifisiteten av BNP-C225 til EGFR. Sammen tyder disse dataene på at BNP-C225 konjugater kan spesifikt beslaglegge EGFR fra cellelysatene og sequestering evne øker med et økende antall C225 molekyler på BNP overflaten.
a. Binding av BNP-C225 og BNP-IgG til EGFR verifisert av Western Blot analyse. Cellelysater fra ASPC-1-celler ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med BNP-C225 og BNP-IgG konjugater med forskjellige forhold mellom antistoff på overflaten av partikkelen. Etter inkubering ble prøvene sentrifugert ved høy hastighet, og supernatanten ble samlet opp, og pelleten ble vasket en gang og respun; den nanoconjugate fraksjon var 20 ganger konsentrasjonen av supernatanten. Pelleten og de overliggende fraksjoner ble lastet på en 7,5% SDS-PAGE-gel og analysert for EGFR. b. Hydrodynamisk diameter på BNP-C225 målt ved dynamisk lysspredning spek
evne nanoconjugates binder EGFR med en C225:GNP forhold på 1,5 til 3 er lik.; imidlertid reduserer
in vitro
intracellulært opptak som forholdet endres fra 1,5 til 3. For å forklare den synkende opptak av de nanoconjugates med økende C225:GNP forhold, undersøkte vi rollen til den hydrodynamiske diameter av nanoconjugates . Den hydrodynamiske diameter (HD) av konjugatene ble bestemt ved hjelp av dynamisk lysspredning spektroskopi (DLS) målinger (figur 4b). Nylig, HD har vist seg å være kritisk for tumor målretting av kvanteprikker [34]. Videre har det også blitt vist at
in vitro
cellulært opptak og responsen er avhengig av størrelsen på nanoconjugates. Ved konjugering med en 0,38 C225:GNP forholdet HD av GNPs øker umiddelbart fra 7 nm til 21 nm, noe som ytterligere bekrefter binding av C225 til BNP overflaten [35]. HD forblir omkring 21 nm til et forhold på 2,29 deretter kraftig øker i et forhold på 3. Det skal bemerkes av figurene 1b og S2 at nesten alle antistoffmolekyler forblir bundet til BNP overflaten opp til et forhold på 3. Imidlertid, der er bare en gradvis økning i binding over dette forhold, mest sannsynlig tilskrives ikke-spesifikk binding. Denne ikke-spesifikk binding av antistoffmolekyler kan være årsaken til dannelsen av en løs sekundært lag rundt BNP-C225 resulterer i en kraftig økning i HD ved høyere C225:GNP forholdstall. En slik kraftig økning i HD kan også være på grunn av heterogeniteten til prøven. Innhenting av et diskret antall antistoffmolekyler pr BNP er meget vanskelig å oppnå eksperimentelt. Forholdet mellom multivalency av nanopartikler til sine hydrodynamiske diameter må undersøkes nærmere. TEM-analyse bekreftet at den kraftige økningen i HD er ikke på grunn av aggregering av nanopartikler. TEM mikrografer viste ingen signifikant aggregering av nanopartikler med ulike C225:GNP forhold (figur S6).
Levering av BNP-C225 i en orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen
For ytterligere å undersøke evnen til disse nanoconjugates spesifikt mot kreftceller
in vivo
, vi utnyttet en orthotopic bukspyttkjertelkreft modell. Modellen ble generert etter kirurgisk implantering ASPC-1-celler som uttrykker luciferase inn i bukspyttkjertelen av nakne mus og fikk vokse i 12 dager. Hver tredje dag ble musene injisert med 200 ul av ketamin og 100 mL av luciferin og avbildes for tumorvekst progresjon av bioluminiscence målinger. Denne ortotopisk modell forsøker å etterligne humant patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen [36] og gjør det mulig for tumorceller til å oppleve effekten av mikromiljøet i bukspyttkjertelen. På dag 12, ble BNP-C225 og BNP-IgG administrert i.p. for å studere tumoropptak og fordeling av nanoconjugates med forskjellige Ab:GNP forhold. Musene ble avlivet 24 timer etter injeksjon nanoconjugate og tumorene og andre vitale organer ble oppsamlet for bestemmelse av gull innhold av INAA. Figur 5a viser et representativt eksempel på et biolumine bilde av mus 12 dager etter ortotopisk implantering av tumorcellene i bukspyttkjertelen (øvre panel). Sterk Bioluminescens antyder dannelse og vekst av en tumor i bukspyttkjertelen. Tumorvekst ble ytterligere bekreftet ved å måle tumorstørrelsen ved slutten av forsøkene når det går ut over mus (nedre panel). Svulsten størrelse målt ved hjelp av formelen ab
2/2 (a = lengde, b = bredde) var ~62 mm
3 når nanoconjugates ble administrert for biofordelingsstudier. Figur 5b viser tumoropptak av BNP-C225 og BNP-IgG ved varierende Ab:GNP forhold som en funksjon av gullinnholdet bestemt ved INAA.
in vivo Hotell og
in vitro
tumoropptak av nanoconjugates fulgt et lignende mønster. Statistisk analyse ved hjelp av den tosidige studenter t-test viste at opptaket av BNP-C225 med et forhold på 0,76 og 1,5 var betydelig høyere enn forholdet 3 (p 0,05). Videre er opptaket av BNP-C225 konjugater var signifikant høyere (p 0,05) enn den isotypekontroll, BNP-IgG i alle forhold med unntak av 3. Som nevnt tidligere, er HD av BNP-C225 holdt seg konstant fra et forhold på 0,38 til 2,29 (rundt 21 nm), men øker dramatisk i et forhold på 3 (134 nm). Teoretisk sett kan den største HD av nanoconjugates ved et forhold på 3 bidra til lavere diffusjon og i sin tur reduksjon i opptak [37]. Dette illustrerer at HD er en kritisk faktor for
in vivo
opptak og dermed en nøkkelfaktor for aktiv målretting. For ytterligere å undersøke den intratumoral (inne i cellene, eller i blodkar eller i kapselen utsiden av tumorvev) plassering av de nanoconjugates, utførte vi TEM på tumorvevet som er vist i figur 5a, som ble oppnådd etter at det går ut over musene 24 h legge intraperitoneal administrasjon av ulike nanoconjugates. Figur 6 viser plasseringen av GNPs i ulike områder av tumorvev i tilfelle av BNP-C225 (C225:GNP 3,0 (figur 6a og b), og 1,5 (figur 6c) behandlede grupper. Det er innlysende at GNPs finnes inne i cellene ( Figur 6a, venstre og høyre panel er bilder av det samme området, forskjellig forstørrelse) samt kapselen dekker svulstvev (figur 6b, venstre og høyre panelet er bilder av det samme området, forskjellig forstørrelse). Men nanoconjugates er hovedsakelig lokalisert utenfor svulstvev i tilfelle av BNP-IgG behandlede gruppen (IgG:GNP 1,5) (figur S7).
a. bioluminesens bilder på dag 12 som viser tumor nærvær (øverst panel) og digitalkamera bilder (nederst panel) av tumormasser skåret etter opphør av musene ovenfor. musene ble avlivet på dag 13, 24 timer etter nanoconjugate behandlinger. b.
In vivo tumor
opptak av BNP-C225 og BNP-IgG konjugater ved varierende forhold mellom antistoff; 24 timer etter intraperitoneal injeksjon av konjugatene inn i en ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen. Opptaket ble bestemt ved å måle gullkonsentrasjonen i svulster ved INAA. Y-aksen representerer gull konsentrasjon som ppm.
a og b. BNP-C225 med 3,0 forholdet mellom Ab:GNP vises til venstre i en lav forstørrelse til å vise et stort areal på svulstvev og på høyre forstørrelsen økes til belyse internalisering av konjugatene selv. c. BNP-C225 med 1,5 forholdet mellom Ab:GNP vises til venstre i lav forstørrelse til å vise et stort areal på svulstvev og på høyre forstørrelsen økes for å avsløre konjugater seg inne i cellerommet.
tilstedeværelsen av injiserte konjugater i andre viktige organer ble også bestemt ved INAA (figur S8). Gull-opptaket ble også funnet i andre organer, slik som milt, lever, lunge, nyre og hjerne [38], [39].
diskusjon
målrettet levering av uorganiske nanomaterialer er et viktig område forskning for nanomedisin. Unike fysikalsk-kjemiske egenskaper av uorganiske nanomaterialer kan benyttes for flere biomedisinske anvendelser slik som deteksjon /diagnose, behandling og avbildning. Derfor er det viktig å definere de designparametre for spesifikt å levere nanoconjugates til cellene av interesse. Det er flere viktige faktorer som kan definerer suksess for målrettet levering; (I) valg av en passende modell for å studere levering tilnærming; (Ii) valg av en effektiv målretting agent; (Iii) optimering av antall målsøkende midler per nanopartikler; (Iv) tilgjengelighet av frie reaktive område på partikkeloverflaten som kan initiere ikke-spesifikk binding; (V) evne til målsøkende middel til å beslaglegge målet og (vi) hydrodynamisk størrelse nanoconjugates.
De fleste av leverings strategier er testet i ikke-ortotopiske modeller hvor svulster er generert fra det opprinnelige området. En stor fordel med denne modellen er svulster er lett å utvikle og vekst kan overvåkes ved manuell måling med glidemålepunktene. En ulempe ved denne modell er at tumorcellene ikke opplever en sann svulst mikromiljøet. I kontrast, implantater orthotopic modell kreftceller i organet svulst opprinnelse, som gjør det en mer realistisk modell. Derfor har vi valgt den orthotopic modell for å studere design parametere nødvendig for nanoconjugates å lykkes og spesifikt rettet mot en svulst.
Vi valgte cetuximab som en målsøkende middel og gull nanopartikler som stillaset for målretting levering. En av de store fordeler ved å benytte gull nanopartikler er deres dannelse av bindinger som er stabile med biomolekyler som organothiols, organoamines, proteiner, antistoffer og [5]. Vi demonstrerte særlig binding av cetuximab til GNPs opp til et forhold på 3. (C225:GNP = 3) over hvilken bare en marginal økning i binding er observert. Denne marginale økningen kan være på grunn av mangel på fri reaktiv overflate som er igjen på de GNPs. Arten av binding mellom gull og proteiner har vært gjenstand for intens undersøkelse i løpet av de siste flere tiår. Det er nå generelt akseptert at det er tre hovedtyper av interaksjoner som forekommer mellom et protein /antistoff og en gull nanopartikkel; (I) elektrostatiske interaksjoner av negativt ladede GNPs med positivt ladede proteiner; (Ii) kovalente interaksjoner mellom tiol /amingrupper som er tilstede i aminosyrerester i antistoffer og GNPs; og (iii) hydrofobe interaksjoner mellom proteiner og GNPs [19], [40]. Ved hjelp av røntgenstråle-fotoelektron-spektroskopi og termogravimetrisk analyse vi tidligere har demonstrert at cetuximab benytter tiol og amin-funksjonalitet til å binde seg til overflaten av gull nanopartikler [19], [40].
Det er også viktig å validere designparametre for forskjellige cellelinjer med variabel ekspresjon av målreseptoren. Dette er særlig viktig med tanke på den heterogene natur av tumorer. I disse studiene benyttet vi tre forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer med variabel uttrykk av EGFR. Vi har også vist at intracellulære opptaket av BNP-C225 er ikke bare avhengig av antallet av cetuximab molekyler, men også avhenger av deres evne til å binde EGFR, så vel som hydrodynamiske størrelsen på nanoconjugates. Det er også tydelig at ikke-spesifikt opptak kan minimeres
in vitro
ved å optimalisere dekningen av målsøkende middel på nanopartikkel overflaten. Maksimal spesifikt opptak av BNP-C225 er observert når det er tre C225-molekyler på en BNP, selv om den totale opptak reduseres. Disse data viser videre den kombinerte vekt av antall målsøkende midler per partikkel og den hydrodynamiske størrelse på nanoconjugates. Dette gjenspeiles også i forskjellen mellom spesifikt opptak av BNP-C225 og ikke-spesifikt opptak av BNP-IgG.
Nylig har flere grupper hatt fokus på å forstå design parametere for effektivt å målrette svulster med nanoconjugates i en preklinisk modell. Det har også blitt rapportert at en nanoconjugate med en størrelse på 100 nm på en effektiv måte å målrette tumorceller [41]. Antistoff rettet mot liposomer har blitt funnet å utøve økt effekt over sine ikke-målrettede motstykker [42]. Videre levering av siRNA hjelp overføre målrettede polymere nanopartikler viste bedre effekt selv om deres kinetikk, biodistribusjon og tumoropptak var lik [43]. Lignende observasjoner ble også gjort i en studie av transferrin-belagt gull nanopartikler; Det ble demonstrert at liganden innhold på nanopartiklene er viktig for målretting [33]. Her undersøker vi en ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen og i sin tur, viser de kritiske roller at antallet antistoff-molekyler på BNP, evne til nanoconjugates til å binde target-reseptoren, tilgjengeligheten av den reaktive overflate for ikke-spesifikk interaksjon . og hydrodynamiske størrelsen på nanoconjugates spiller i effektiv design
til sammen våre data tyder på at den spesifikke målrettingen av tumorceller er avhengig av en rekke viktige faktorer; 1) målsøkende middel til nanopartikkel-forhold; 2) tilgjengelighet av det reaktive overflatearealet på nanopartikkel; 3) evne til å binde nanoconjugate målet og 4) hydrodynamiske diameter av nanoconjugate. Dermed intelligent design for vellykket satsing på kreftceller krever optimalisering av disse viktige faktorer. Vi tror denne studien vil bidra til å definere designparametre for å formulere bedre strategier for spesielt rettet mot svulster med nanopartikkel konjugater.
Materialer og metoder
Syntese og karakterisering av BNP-antistoff konjugater
