Abstract
Ikke-termisk atmosfærisk trykk plasma (NTAPP) er en ionisert gass ved romtemperatur og har potensiale som en ny apoptose-fremmende kreftterapi som virker ved generering av reaktive oksygenarter (ROS). Imidlertid er det viktig å fastslå selektivitet og standardisere komponenter og sammensetning av NTAPP. Her har vi laget en NTAPP genererende apparater kombinert med et Han gass fôringssystem og demonstrert sin høye selektivitet mot p53-muterte kreftceller. Vi bestemmes først de riktige betingelsene for NTAPP eksponering for selektivt å indusere apoptose i kreftceller. Den apoptotiske effekt av NTAPP var større for p53-muterte kreftceller; kunstig p53-ekspresjon i p53-negative HT29-celler ble redusert den pro-apoptotiske virkning av NTAPP. Vi har også undersøkt ekstra og intracellulære ROS-nivåer i NTAPP-behandlede celler til å utlede mekanisme NTAPP handling. Mens NTAPP-medierte økning i ekstracellulær nitrogenoksid (NO) ikke påvirke cellenes levedyktighet, økt intracellulær ROS i henhold NTAPP eksponering og indusert apoptotisk celledød. Denne effekten ble doseavhengig redusert etter behandling med ROS åtseldyr. NTAPP indusert apoptose selv i doxorubicin-resistent cancercellelinjer, demonstrere gjennomførbarheten av NTAPP som en potent kreftterapi. Sammen er disse resultatene støtter sterkt potensial NTAPP som en selektiv kreft behandling, spesielt for p53-muterte kreftceller
Citation. Ma Y, Ha CS, Hwang SW, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et al. (2014) Ikke-Thermal Atmosfærisk trykk Plasma Fortrinnsvis induserer apoptose i p53-mutert kreftceller ved Aktivere ROS Stress-respons Pathways. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10,1371 /journal.pone.0091947
Redaktør: Subrata Roy, University of Florida, USA
mottatt: 25 september 2013; Godkjent: 18 februar 2014; Publisert: 23 april 2014
Copyright: © 2014 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra KRICT (SI-1304) og Ministry of Knowledge Economy, Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Apoptose er en velkjent form for programmert celledød som fjerner ødelagte og uønskede celler; det tjener som en viktig mekanisme for å beskytte vev og organer fra ulike typer belastninger og celleskade [1]. Selektiv induksjon av apoptose i cancerceller er ansett som en ideell metode for behandling av kreft, og mange antikreftmidler med denne mekanismen har blitt utviklet. Men dagens tilnærminger fortsatt overfor betydelige utfordringer som skal overvinnes, inkludert legemiddelresistens, lav terapeutisk effektivitet, og kreftcelle selektivitet.
p53 tumor suppressor protein er viktig for å opprettholde genomisk stabilitet i pattedyr. Når cellene er utsatt for ulike genotoksiske og cellulære påkjenninger, slik som oksidativt stress, hypoksi, stråling eller kjemoterapeutiske medikamenter, er p53 aktivert, og dens ubiquitin-avhengig nedbrytning blokkeres, noe som fører til en opphopning av aktiv p53 transkripsjonsfaktor [1]. Aktivert p53 regulerer cellesyklus arrest, aktivering av anti-oksidanter og DNA-reparasjon, og apoptose ved å påvirke uttrykket av sine mål gener, inkludert cyclin-avhengig kinase (CDK) hemmer
p21 /WAF1 Hotell og gener involvert i celledød, slik som
BAX
,
PUMA
,
NOXA
, og
Fas product: [2], [3]. Når cellene blir utsatt for oksidativt stress, aktiverer p53 også transkripsjonen av sestrin, glutation peroksidase (GPX), og aldehyddehydrogenase (ALDH), for således å spille en sentral rolle i å opprettholde redox-balanse og genomisk stabilitet under oksidativt stress [4], [5 ]. Mutasjon av p53-genet eller forstyrrelse av veier som fører til p53-aktivering er ofte blitt observert i de fleste typer kreft hos mennesker [6].
p53-avhengig induksjon av apoptose i respons til genotoksiske skaden er et viktig aspekt svulst undertrykkelse. Således er tapet av p53 i humane kreftformer bidrar til aggressiv oppførsel tumor og ofte fremmer motstand av kreftceller til stråling og kjemoterapeutiske medikamenter. For eksempel, behandling av p53
+ /+ mus thymocyttene med stråling resulterer i apoptose, mens p53
– /- thymocytter er resistente. Tilsvarende p53
+ /+ mus embryonale fibroblaster transformert med adenovirus E1A protein og Ha-ras-onkogen gjennomgå apoptose i respons til be-stråling eller kjemoterapeutiske midler, men p53
– /- fibroblaster er motstandsdyktig mot begge behandlingene [7 ]. I tillegg er noen p53-mutasjoner i kreft undertrykke funksjonen av p73, som induserer apoptose via en p53-uavhengig mekanisme [8]. Således er felles tap av p53-funksjon i kreftceller presenterer en stor begrensning for anticancer terapi.
Plasma er beskrevet som kvasi-nøytral blanding av ladede partikler og rester i en delvis ionisert gass. Nylig har mange studier forsøkt å dra nytte av den lave temperaturen i ikke-termiske lufttrykket plasmaer (NTAPPs) for biomedisinske anvendelser av kraft av kontrollerbarhet av plasma kjemi og kinetikk [9] – [11]. Det finnes flere typer NTAPPs, for eksempel plasma nål, plasma jets, og dielektriske barriere utslipp (DBDS) [11]. Gasskomponenten og styrken og pulsvarighet av det elektriske felt bestemme den eksakte plasma sammensetninger. Studiet av NTAPPs for kliniske applikasjoner har nylig blitt en svært aktiv forskningstema; NTAPPs enkelt ut i luft og kan anvendes uten å forårsake termisk skade på cellene. Effektene av NTAPPs på levende vev inkluderer sterilisering, sårheling og celle migrasjon endringer (for deg [10], [12]). Mangfoldet av ulike effekter av plasma avhenger plasma dosering og deres komplekse kjemiske sammensetninger.
Tidligere studier om klinisk anvendelse av NTAPP for pattedyrceller har hovedsakelig fokusert på sin effekt på celledød [13], [14] . Flere mulige mekanismer som er knyttet til NTAPP-mediert celledød ble rapportert, inkludert reduksjon av celleadhesjon [15], [16]. Spesielt flere forskningsgrupper viste at NTAPP induserer apoptose i enkelte kreftceller og kan brukes som en cancerterapi [17], [18]. Det er en økende mengde bevis som tyder på at reaktive oksygenforbindelser (ROS) er de store aktørene i NTAPP-indusert apoptose
in vitro product: [19] -. [22]
ROS er kjemisk reaktive radikaler, ioner eller molekyler som inneholder frie oksygenradikaler og et biprodukt av normal metabolisme. Basale nivåer av ROS aktivere flere signalkaskader for å fremme cellevekst under normale fysiologiske forhold [23] – [25]. Men overdreven ROS-nivåer indusere oksidativt stress og direkte angrep DNA, proteiner, lipider og andre cellulære komponenter, til slutt bidrar til celle alderdom og apoptose [26], [27].
Det første skrittet for å utvikle NTAPP som en potensiell kreftbehandling er å evaluere dens selektive virkning mot kreftceller. Her viser vi at NTAPP induserer apoptose i p53-muterte kreftceller, men ikke i grunnskolen eller stamceller. Vi viser også at NTAPP-formidlede økninger i intracellulært ROS indusere apoptotisk celledød i en konsentrasjonsavhengig måte. For ytterligere å vurdere muligheten for NTAPP for kreftbehandling, testet vi NTAPP i doksorubicin-resistente kreftceller, og fant at det var i stand til å indusere apoptose. Sammen utgjør disse resultatene sterkt støtte potensialet for NTAPP som et selektivt anticancer-behandling, spesielt for p53-mutert kreftformer og celler som er resistente overfor de eksisterende anticancer legemidler.
Materialer og metoder
Cellekultur og NTAPP behandling
celler anvendt i denne studien og deres kilder er oppsummert i tabell 1. HeLa og Hep G2-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum ( FBS) og 10 ml /l penicillin-streptomycin. G361, HCT116, HCT116 p53
– /-, HCT15, MES-SA, H1299, HT29, DLD-en, LoVo, doxorubicin bestandig HCT15 /CL02 og MES-SA /DX5 celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% (v /v) FBS og 10 ml /l penicillin-streptomycin. IMR90 og RKO celler ble dyrket i Minimum Essential Medium (MEM) supplert med 10% (v /v) FBS og 10 ml /l penicillin-streptomycin. RT-9-celler ble dyrket i DMEM:DMEM /F12 (01:01) supplert med 10% (v /v) FBS og 10 ml /l penicillin-streptomycin. Subkutant fettvev ble innhentet under elektiv kirurgi med pasient samtykke, som er godkjent av Samsung Hospital Institutional Review Board (IRB ingen. KBC11151). Adipose-vev avledede stamceller (ASCs) ble isolert fra vev [28] og dyrket i DMEM /Hams F-12 (DMEM /F12) supplert med 10% (v /v) FBS og 10 ml /l penicillin-streptomycin. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C under en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
For å eksponere cellene til NTAPP, 1 x 10
5-celler ble sådd ut i 35 -mm dyrkede plater og inkubert i 24 timer. Celler ble utsatt for den indikerte dose (5 standard l /min [SLM], 5 V) av NTAPP i 30 s til 1 min hver gang hver time i maksimalt 10 ganger. Når det er nødvendig, ble NTAPP-eksponerte celler videre inkubert i 15 timer før andre forsøk.
Western blot analyse
NTAPP utsatte cellene ble høstet og lysert som beskrevet [29]. Histoner ble ekstrahert med 0,6 N HCl. Prøver av totalt protein (50 ug) eller histoner ble analysert med anti-kaspase-3 (Cell Signaling Technology), anti-poly ADP-ribose polymerase (PARP, Cell Signaling Technology), anti-actin (Sigma-Aldrich) sera, og anti -phospho-H2AX (γ-H2AX) sera (Millipore), fosfor-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) og Bax (Santa Cruz Biotechnology). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus og anti-kanin (Jackson Immuno Research) sekundære antistoffer ble anvendt, og de behandlede membraner ble visualisert ved hjelp av ECL-sett (Amersham Biosciences).
Intracellulær ROS deteksjon
HeLa celler (1 x 10
5) ble sådd på 35-mm parabolen med dekkglass og gjentagelser utsatt for 5 V NTAPP i 30 s hver h for totalt syv ganger før intracellulær ROS-nivåer ble vurdert ved hjelp av en ROS deteksjon sett (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Non-fluorescerende karboksyl-H
2DCFDA kan enkelt permeabilize til levende celler og er oksidert av intracellulær ROS å avgi en lys grønn fluorescens signal. Tert-butylhydroperoksyd (TBHP), som er kjent for å indusere intracellulær ROS, ble anvendt som en positiv kontroll. N-acetylcystein (NAC) og natriumpyruvat (SP) ble anvendt som intracellulære og ekstracellulære ROS-fjerningsmidler, respektivt.
Ekstracellulær nitritt deteksjon
produksjon av ekstracellulær nitrogenoksid (NO) etter eksponering til NTAPP ble bestemt ved å måle akkumuleringen av nitritt, den stabile metabolitt av NO, utskilt i kulturmediet. Etter at cellene ble utsatt for NTAPP, ble 50 ul kulturmedium tatt, blandet med et likt volum av Griess-reagens (1% sulfanilamid, 0,1% naphthylethylenediamine-dihydroklorid, og 2% fosforsyre), og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Absorbansen ble målt ved 540 nm med en mikroplateleser (Softmax Pro 4,0, Molecular Devices) ved hjelp av en kalibreringskurve med en rekke 0-100 pM konsentrasjoner av nano
2. I NO scavenger eksperimentet, ble cellene forbehandlet med 30, 50, eller 100 pM konsentrasjoner av karboksy-ptio (Sigma-Aldrich) som reagerer støkiometrisk med NO før de ble utsatt for NTAPP.
Transfeksjon av pcDNA-p53 -Ha
Vi har lagt til 2 mikrogram av plasmid pcDNA-p53-HA (vennlig levert av Dr. J. Song, Yonsei University, Seoul, Korea) i 6 mL lineær L-PEI (polyetylenimin), blandet med 150 mM NaCl, og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Blandingen ble påført på HT29-celler før inkubering over natten.
Strømningscytometri
Etter 10 gjentatte eksponeringer av 5 V NTAPP etterfulgt av 15 timers inkubering ble cellene høstet med trypsin-EDTA og fiksert med 70 % kald etanol. Celler ble behandlet med 100 ug /ml RNase i 30 minutter i 37 ° C og resuspendert i 1 x bindingsbuffer (10 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2). Cellene ble farget med 0,01 mg /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich), eller dobbelt farget med 5 mL FITC Annexin V (BD Biosciences) og 5 pl 7AAD (eBioscience) per million celler for å påvise celler i apoptotiske status. Flowcytometri ble gjennomført med FACSCalibur (BD Biosciences) og Cellquest programvare.
Globalt modell analyse av plasma kjemi
Fordi det er vanskelig å eksperimentelt måle alle arter som finnes i NTAPP, plasma ingeniører utviklet en global modell [30], [31] som beregner romlig midlede kjemiske arter, samt ladede partikler, under et gitt kjøreforhold av eksterne kretser ved hjelp av tidsavhengige kontinuitetsligninger for hver art. Simuleringen domene er delt i to regioner: den plasmakildeområdet og den nøytrale gass domene uten plasmaer. De sistnevnte region kontakt med oppvask som inneholder celler. De anses kjemiske reaksjoner er de samme som i tabell 2 ved Sakiyama
et al.
[31], med unntak av at tilsetningen av helium (He) arter, som ble anvendt som buffer gass av den innretning som anvendes NTAPP for dette eksperimentet. Det totale antall arter er 68, og det totale antall av reaksjoner er 826.
Den globale modell som brukes i denne undersøkelsen løst kontinuitetsligninger for tunge partikkelarter og en energibalanse ligning for elektron arter. På grunn av den kvasi-nøytralitet av plasma, kan elektrontettheten beregnes fra summering av alle positive arter tetthet og subtraksjon av alle negative arter tetthet. Ligningene ble løst numerisk med en in-house koden ved hjelp av en fjerde ordens Runge-Kutta metoden.
Statistisk analyse
Alle data er representert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av minst tre uavhengige eksperimenter. Vi søkte
t
-UNDERSØKELSER å vurdere statistisk signifikante forskjeller.
p
0,05 (*) og
p
. 0,01 (**) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med kontrollgruppen
Resultater
Egenskaper av designet NTAPP enhet
Vi har konstruert et apparat som genererer NTAPP å utsette å leve celler. Denne NTAPP enheten er designet for å ha det elektriske felt vinkelrett på retningen av gass-strømmen for å redusere mengden av ladede partikler gjennom dysen. Således diffuse den genererte ROS vidt, men ladede partikler er begrenset innenfor plasmagenerering regionen. Den lille sideforholdet til stråleområdet til plasmavolumet resulterer også i redusert mengde av UV fotoner fra enheten. Videre er lang avstand fra anordningen til cellene og kulturmedier å redusere effektene av UV fotoner som absorberes av bakgrunns gasser og væsker veldig godt. Derfor forventer vi denne enheten gir hovedsakelig ROS fra plasma, sammenlignet med direkte plasmastråler som leverer ladede partikler direkte til målene. Figur 1 viser et skjematisk bilde av plasmageneratoren som brukes i dette eksperimentet. Anordningen er en ringformet typen dielektrisk barriere utladning (DBD) [32] som er angitt for NTAPP generasjon under luft eller andre gasser ved høy spenning sinusformede bølgeformer eller kortvarige pulser blir tilført mellom to elektroder, hvorav minst en av dem er isolert. Isolatoren forhindrer strøm bygger seg opp mellom elektrodene, noe som skaper elektrisk sikker plasmagass uten vesentlig oppvarming.
(A) Skjematisk beskrivelse av NTAPP genererende enhet som brukes til behandling av levende celler. Det dielektriske materiale som brukes er teflon (polytetrafluoroethyle), og elektroden er laget av kobber. (B) NTAPP generert fra enheten. Plasmatettheten er av størrelsesorden 10
12 /cm
3, og det totale effektforbruket i plasma er 1,11 W for en topp-til-topp spenning på 7 kV med en inngang likespenning på 5 V. mengder av beregnede ROS-arter er vist i figur S1.
Som vist i figur 1, er anordningen kombinert med en Han gassmatesystem, en AC-kraftleverandøren, og DBD enheten dekket med plast tilfeller å redusere ROS diffusjon. Han gass strømmer inn i innløpet av innretningen med en hastighet på 1 til 5 standardliter per minutt (SLM), som styres av en massestrømsregulator (MKP, MPR-2000). AC-spenning tilføres til den indre elektrode av den DBD anordningen ved en frekvens på 11,4 kHz og et påført topp-til-topp spenning på 7 til 20 kV, som er generert ved hjelp av en transformatorkrets som består av likeretterdioder og bipolar effekttransistorene (Ramsey Electronics, PG13 plasma generator kit). DC-inngangsspenning i området fra 5 til 12 V, som er utpekt som en kontrollparameter for å endre den påtrykte spenning til DBD enheten. For eksempel, en inngangsspenning på 5, 6, og 12 V svarer til topp-til-topp utgangsspenninger på 7,5, 8,9, og 18,8 kV, respektivt. Den totale kraft som forbrukes i plasma er 14,11 W for topp-til-topp spenning på 7 kV med en inngang likespenning på 5 V, som er betingelsen for mesteparten av det eksperimentelle målinger.
informasjon angående plasma komponenter og sammensetningen er uunnværlig for reproduserbarheten og mekanismen for NTAPP handling. Imidlertid er det vanskelig å måle hvert element som genereres fra plasmaet anordningen, særlig ved atmosfæretrykk, fordi mange ROS ikke sende ut lys som kan detekteres i optisk emisjonsspektroskopi og massespektroskopi er også vanskelig å bruke på dette trykk. Global modellering blir vanligvis brukt for analyse av NTAPP reaksjonskinetikk og plasma kjemi under de gitte driftsbetingelser [30], [31]. Derfor, for å analysere komponenter og sammensetning av vår NTAPP enhet, brukt vi global modellering, som er svært lik den til Sakiyama et al. [31], med unntak av at tilsetningen av He-relaterte reaksjoner. Resultatene av den globale modell med variasjonen av He molfraksjon, samt fuktighet, ved en fast inngangseffekt på 80 W er presentert i figur S1.
For tørr luft med null fuktighet, reaksjonene relatert til vann er utelukket, og dermed det totale antall arter og det totale antall reaksjoner er redusert til 43 og 454, henholdsvis. Som Sakiyama et al. [31] viste to forskjellige simulerings regioner for tømme lag og nøytralgass domene, ble simuleringen domener av utladningsregion og nøytralgass region vurderes separat. Figur S1A og S1B er resultatet av utladningsregionen, og fig S1C og S1D er for nøytralgass-regionen i kontakt rettene. Fig S1A viser ROS tetthet på innsiden av plasmaet anordning for forskjellige gassfraksjoner Den som kan styres ved å endre gass-strømningshastighet. Ettersom terskelen energier for interaksjon med ROS er lavere enn de med He, blir ROS-tettheter i hovedsak bestemt av mengden av luft, og de mest dominerende artene innsiden av utladningsregionen er atomært oksygen på grunn av den elektronstøt dissosiasjon fremgangs O
2 og O
3 [30]. Den mest tallrike arter er oksygenatomer, nitrogenoksid og ozon når den blandede luft fraksjonen er større enn 1%. Fig S1B viser virkningen av fuktighet på ROS tetthet for blandingen av 99% He og 1% luft. Den regnes som molfraksjonen av vanndamp er 1%, noe som tilsvarer 30% relativ fuktighet ved romtemperatur. Endringen i ROS tetthet er ikke signifikant med inkluderingen av virkningen av fuktighet, unntatt for den ekstra eksistensen av OH, H, H
2o
2, HNO
2, HNO
3, HO
2 og H
2. ROS generert i plasma anordningen diffundere ut i luften, og de er plottet i Figur S1C etter spredningen på 0,1 ms som ble estimert som ankomsttiden av artene fra plasmaet munnstykket til fatet. Etter diffusjonsprosessen av ROS gjennom luften, de mest dominerende artene er ozon i stedet for atomært oksygen, og den lett festes til O
2 for å generere O
3. Til slutt viser figur S1D føflekken antall ROS ankomst til parabol per arealenhet og tidsenhet. Det totale antall mol kan anslås ved å multiplisere arealet av fatet og totale mengden av interaksjon tid. For eksempel, med en tallerken diameter på 3,5 cm og med driftstider på 30 sekunder, er den totale multiplikasjonsfaktoren 289. Derfor er det maksimale antall mol av ozon levert til media ca 30 mmol. Transporten av ROS innsiden av væsker er ikke godt forstått, og er meget vanskelig å beregne, men det finnes noen referanser for reaksjonshastigheten for hydratiserte elektroner og hydroksylradikaler, samt for transport proton hopper i vandig oppløsning [31]. Hvis vi antar at 10-30% av gass ROS leveres i flytende medier, det totale mole antall innsiden av flytende varierer 3-9 mmol.
Differential effekter av NTAPP på ulike typer menneskelige celler
for å finne de optimale eksponeringsforhold NTAPP å hemme kreftcelle spredning, den innledende forsøket vurderes effekten av ulike NTAPP intensiteter på celle levedyktighet i normale og kreftceller. Til å begynne med vi anvendt NTAPP med en rekke inngangsspenning (5-10 V) en gang til kreftcellelinje HepG2, den normale embryonale lunge fibroblast cellelinje WI38, og ASCer i 1 minutt, deretter ble cellene inkubert i 24 timer før vi kvantifisert celleviabilitet ved hjelp av MTT-analyser. MTT-assayet er for å vurdere cellelevedyktighet som reflekterer antall levedyktige celler er tilstede. Økt levedyktighet antyder at de behandlede celler formere seg hurtigere enn kontrollcellene. Redusert levedyktighet betyr at de behandlede celler sprer langsommere enn kontrollen eller noen av de behandlede celler gjennomgår celledød. I dette eksperimentet, ble avstanden (3 cm) mellom NTAPP anordningen og cellene og gass-strømmen (5 SLM) løst.
Som vist i fig S2, mens forskjeller i levedyktigheten ble ikke observert mellom behandlet og ubehandlede HepG2 celler, antallet WI38-VA13 og ASC celler litt øket enn de ubehandlede kontrollcellene. Disse resultatene antyder at NTAPP eksponering kan fremkalle forskjellige fysiologiske responser i ikke-kreft og kreftceller. Vi har også bekreftet at endringene i celle levedyktighet skyldes NTAPP eksponering og ikke av han gass som brukes til å generere NTAPP (Figur S3).
Vi neste prøvde å utlede de riktige NTAPP vilkår for å blokkere spredning i kreftceller men ikke i normale celler. Da HeLa-celler ble utsatt for 5 V NTAPP i 30 sek hver h for maksimalt 9 timer (10 repeterende NTAPP eksponeringer), som vist i figur 2A, er den relative prosentandel av levedyktige celler var litt mindre økning i eksponerte celler (134%) sammenlignet til ueksponerte kontrollceller (145%). I tillegg er forskjellen i de relative levedyktige celler mellom NTAPP-behandlede og ubehandlede HeLa-celler ble mer fremtredende når cellene ble ytterligere inkubert i 15 timer etter 10 NTAPP eksponeringer: den relative prosentandel av levedyktige celler var bare 106% i celler eksponert for 10 repeterende NTAPP med 15 timers ytterligere inkubering, sammenlignet med 200% i ubehandlet kontroll (figur 2A). Interessant, da vi anvendt de samme betingelser for NTAPP til primær fibroblast IMR90-celler og ASCer, ble det relative antall celler forsterket i NTAPP-eksponerte celler sammenlignet med ubehandlede kontroll (figur 2C og E). De relative prosentandelene av levedyktige celler i ASC og IMR90-celler som var utsatt for NTAPP 10 ganger og ytterligere inkubert i 15 timer var 178% og 168%, henholdsvis, mens den for ubehandlede celler var ca. 150% (figur 2C og E). Disse observasjonene tyder sterkt på at vi ansatt de rette eksponeringsforholdene NTAPP (repeterende eksponering av 5 V-inngang NTAPP med ytterligere inkubasjon) for å selektivt hemme HeLa celleproliferasjon og aktiverer spredning i IMR90 celler og ASCs.
(A-F) (A, B) HeLa, (C, D) adipose tissue-avledede stamceller (ASCs) og (e, F) IMR90-celler ble eksponert med 5 V-inngang NTAPP i 30 sek hver h til 10 ganger, og cellelevedyktigheten ble evalueres ved hver angitt frekvenseksponering. Inkubasjonstid indikerer tiden etter første eksponering for NTAPP. Den 24-timers inkubasjon prøve ble fremstilt med 10 repeterende NTAPP eksponering, etterfulgt av ytterligere inkubasjon i 15 timer. (A, C, E) De relative prosentandelene av levedyktige celler er vist som sammenligner startcellenummer forut for eksponering og inkubering som 100%. Levedyktige celler ble kvantifisert med MTT-analyser, og data er vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
p
0,05 (*) og
p
0,01 (**) indikerer signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollen tilstand. (B, D, F) For de samme NTAPP-eksponerte prøver av (A), (C), (E), respektivt, γ-H2AX, caspase-3, spaltet caspase-3, PARP, og spaltet PARP ble vurdert etter western blot analyser. Aktin er vist som en lasting kontroll.
Vi deretter undersøkt hvorvidt redusert HeLa-celleformering følgende repeterende NTAPP eksponering var på grunn av apoptose ved å overvåke spaltning av caspase-3 og dens nedstrøms effektor PARP, som begge aktiveres av apoptose. Når de utsettes for 10 gjentatt 5 V NTAPP i 30 sekunder hver, spaltet caspase-3 og PARP ble påvist i HeLa-celler, men ikke i IMR90 eller ASC-celler (figur 2B). I samsvar med relativ celle tall vist (figur 2A, C og E), kløyvde caspase-3 og PARP ble betydelig økt med ytterligere 15 timers inkubasjon i HeLa celler, men ble ikke observert i ASCs eller IMR90 celler (figur 2B, D, og F). Disse resultater viser at NTAPP behandling induserer apoptose i HeLa-celler, men ikke i normal ASC eller IMR90-celler. Vi bekreftet også at gjentatt eksponering NTAPP induserer apoptose i HeLa-celler ved hjelp av flow cytometri med Annexin V-/7AAD farging (figur S4).
i betraktning at genomiske ustabilitet på grunn av DNA-skade er en viktig årsak til apoptose, vi undersøkt enten NTAPP eksponering indusert DNA-skader i apoptotiske HeLa-celler. Fosforyleringen av histon H2AX er en av de tidligste cellulære hendelser som oppstår i respons til DNA-dobbeltstrengbrudd [7]. Mens kreftceller, inkludert HeLa, vanligvis viser lav basal γ-H2AX uttrykk uten stress, var det betydelig økt i NTAPP eksponerte HeLa celler (figur 2B). Ikke overraskende ble det ikke γ-H2AX ekspresjon detektert i ASCer eller primære IMR90-celler (figur 2D og F). Denne observasjonen viser at NTAPP eksponering selektivt induserer DNA-skader som fører til HeLa celle apoptose.
Anti-proliferativ effekt av NTAPP på melanom og muntlige carcinoma celler
På grunn av eksponeringen av NTAPP selektivt induserer apoptose i HeLa-celler, men ikke i hoved IMR90 eller ASCer, undersøkte vi dens effekt på andre typer kreftceller, inkludert melanom G361 og orale plateepitel carcinom yd-9-celler, som er avledet fra kreftformer som finnes i overflaten av legemet, hvor plasmabehandling kan bli lett anvendelig. Som vist i figur 3A og C, 10 gjentatte eksponeringer av 5 V NTAPP etterfulgt av 15 timers inkubasjon hadde en anti-proliferativ effekt på G-361 og YD-9-celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. NTAPP eksponering også indusert γ-H2AX uttrykk av DNA-skade og apoptose i G-361 og YD-9 celler (figur 3B og D). Disse resultater viser at som i HeLa-celler, fører NTAPP eksponering for betydelig apoptotisk celledød i melanoma og orale plateepitel carcinom-celler, noe som tyder på muligheten av plasma påføring på hud og oral cancer.
(A-D) (A , B) Oral plateepitel carcinom yd-9 og (C, D) melanom-G361-celler ble eksponert med 5 V-inngang NTAPP i 30 sek hver h til 10 ganger, og cellelevedyktigheten ble bedømt ved hver indikert eksponering frekvens. Inkubasjonstid indikerer tiden etter første eksponering for NTAPP. Den 24-timers inkubasjon prøve ble fremstilt med 10 repeterende NTAPP eksponering, etterfulgt av ytterligere inkubasjon i 15 timer. (A, C) De relative prosentandelene av levedyktige celler er vist som sammenligner startcellenummer forut for eksponering og inkubering som 100%. Levedyktige celler ble kvantifisert med MTT-analyser, og data er vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
p
0,05 (*) og
p
0,01 (**) indikerer signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollen tilstand. (B, D) for samme NTAPP-eksponerte prøver av (A) og (C), henholdsvis γ-H2AX, caspase-3, caspase-3 spaltet, PARP, og spaltet PARP ble vurdert ved Western blot-analyser. Actin vises som en lasting kontroll.
Meget fortrinnsrett anti-proliferativ effekt av NTAPP på p53-mangelkreftceller
Under samme NTAPP forholdene, var dens anti-proliferativ effekt større i HeLa-celler enn i G-361 og YD-9 celler (figur 2A og 3), men alle celletyper til slutt gjennomgikk apoptose. γ-H2AX fosforylering og apoptose ble observert i HeLa-celler ved 10 gjentatte NATPP stimuleringer ble brukt, men dette ble bare observert i G-361 og YD-9-celler når cellene ble videre inkubert i 15 timer etter eksponering NTAPP. HeLa, G-361, og YD-9 er alle kreftcellene, men bare HeLa-cellene mangler funksjonell p53 [33] – [35]. Tatt i betraktning at NTAPP induserer apoptose gjennom DNA-skade og at p53 er nøkkelen tumor suppressor som reaksjon på genotoksiske påkjenninger, postulerte vi hvorvidt nærvær eller fravær av funksjonell p53 i HeLa, yd-9, og G361-celler gjør forskjellen i den anti-proliferative effekten av NTAPP.
for å vise forholdet mellom funksjonen av p53 og følsomheten av kreftceller til NTAPP, sammenlignet vi den anti-proliferative effekt av NTAPP i kolorektal cancer cellelinjer HCT116 (p53
+ /+) og HCT116-E6 (p53
– /-), som begge har nøyaktig samme genetisk bakgrunn med unntak av funksjonell p53. Når HCT116 (p53
+ /+) og HCT116-E6 (p53
– /-) mottatt 10 repeterende 5 V NTAPP stimuleringer, etterfulgt av 15 timers ytterligere inkubasjon den samme tilstand som brukes i det foregående NTAPP behandling, den relative prosentandel av levedyktige celler ble redusert både i HCT116 (p53
+ /+) og HCT116-E6 (p53
– /-) sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 4A og B). Interessant, HCT116-E6 (p53
– /-) celler viste overfølsomhet for NTAPP sammenlignet med HCT116 (p53
+ /+); den relative prosentandel av levedyktige celler var bare 80% i HCT116-E6 og 140% i HCT116, sammenlignet med 180% i begge ubehandlede kontrollgrupper (Figur 4A og B). Disse resultatene er i overensstemmelse med effekten av NTAPP observert for HeLa, yd-9, og G361-celler og foreslår sterkt at kreftceller uten funksjonell p53 er betydelig mer følsomme for NTAPP enn celler som med funksjonell p53.
(A
