Abstract
Bakgrunn
Survivin hemmer apoptose og sin over uttrykket er assosiert med dårlig prognose i flere kreftformer. Mens flere studier har analysert survivin uttrykk i esophageal plateepitelkarsinom, har noen fokusert på esophageal adenokarsinom (EAC) og /eller kreft-tilstøtende plateepitel (CASE). Hensikten med denne studien var 1) å bestemme graden av Survivin opp regulering i prøver av EAC og CASE, 2) å vurdere om survivin uttrykk i EAC og CASE korrelerer med tilbakefall og /eller død, og 3) for å undersøke effekten av survivin hemming på apoptose i EAC celler.
Metoder
Fersk frosne prøver av EAC og CASE fra samme pasient ble brukt for QRT-PCR og Western blot analyse, og formalinfiksert, parafin- innleiret vev ble anvendt for immunhistokjemi. EAC cellelinjer, OE19 og OE33, ble transfektert med små interfererende RNA (siRNAs) til knockdown Survivin uttrykk. Dette ble bekreftet av QRT-PCR for survivin uttrykk og Western blot analyse av spaltet PARP, kløyvde caspase 3 og Survivin. Survivin uttrykk data var korrelert med klinisk utfall.
Resultater
Survivin uttrykk var betydelig høyere i EAC tumorprøver i forhold til saken fra samme pasient. Pasienter med høyt uttrykk for survivin i EAC svulsten hadde en økt risiko for død. Survivin uttrykk ble også bemerket i saken og korrelert med økt risiko for fjernmetastaser. Cellelinje evalueringen vist at hemming av survivin resulterte i en økning i apoptose
Konklusjon
Høyere uttrykk for survivin i svulstvev var assosiert med økt risiko for død.; mens survivin uttrykk i saken var en overlegen prediktor for gjentakelse. Hemming av survivin i EAC cellelinjer viste ytterligere økt apoptose, støtter de potensielle fordelene ved terapeutiske strategier rettet mot denne markøren
Citation. Malhotra U, Zaidi AH, Kosovec JE, Kasi PM, Komatsu Y, Rotoloni CL, et al. (2013) prognostisk verdi og målrettet Hemming av Survivin Expression i Esophageal Adenocarcinoma og kreft-tilknytning plateepitel. PLoS ONE 8 (11): e78343. doi: 10,1371 /journal.pone.0078343
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 29 juli 2013; Godkjent: 13 september 2013; Publisert: 04.11.2013
Copyright: © 2013 Malhotra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. David Gold og Irene Blumenkranz for å gi stipend støtte. Grant tall og nettadressen er ikke tilgjengelige. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er i dag den åttende vanligste kreftformen i verden; med esophageal adenokarsinom (EAC) sto for 50% av esophageal krefttilfeller [1] – [5]. De fem-års overlevelse for kreftfaren er mindre enn 20%, og forekomsten har økt med nesten tre ganger i den vestlige halvkule de siste 20 årene [6], [7]. De fleste EAC pasienter blir diagnostisert med avansert stadium sykdom og har dårlige langsiktige overlevelse med tiden ansatt kjemoterapeutika [5], [8], [9]. Effekten av strømregimer har nådd et platå, og ytterligere intensivering av cytotoksiske midler eller stråling doseeskalerings har vist seg å være forbundet med betydelige uønskede bivirkninger. Følgelig er det behov for utvikling av effektive målrettet terapi rettet mot behandling av spesifikke mekanismer for carcinogenesis nødvendig for å forbedre overlevelse [2] -. [4], [10], [11]
Survivin, også kjent som Baculoviral inhibitor av apoptose Gjenta-inneholdende 5 eller BIRC5, er en inhibitor av apoptose eller programmert celledød [10] – [13]. Virkningsmekanismen ved den indre reaksjonsveien er som følger: Survivin binder seg til og hemmer caspase 9, forårsaker deaktivering av apoptotiske reaksjonsvei; procaspase 3 er ikke spaltes og dermed ikke spalter PARP (Poly ADP-ribose polymerase); som et resultat av PARP forblir aktiv og fortsetter med DNA-reparasjon, noe som resulterer i inhibering av apoptose (figur 1) [8], [10], [11], [13], [14]. Vanligvis Survivin finnes bare under embryonal og føtal utvikling som et middel for å regulere riktig celledeling og vekst og ikke påvises i de fleste terminalt differensierte normale vev [15]. Noen normale voksne vev med vedvarende survivin uttrykk inkluderer blodkreft stamceller [16], thymocytter [17], melanocytter [18], mageslimhinnen [19] og kolonepitelet [19]. Studier har rapportert øket ekspresjon av Survivin i en rekke kreftformer, inkludert bryst, lunge, melanom, leukemi, lymfom, tykktarm, bukspyttkjertel og så videre [15]. Bevis støtter også i forhold til ekspresjon av Survivin i esophageal squamous cell carcinoma og dens forbindelse med en dårlig prognose [3], [4], [8], [10], [11], [20]. Fordi Survivin ikke uttrykkes i de fleste av friskt vev, representerer det et ideelt mål for utvikling av nye kreftmidler [3], [4], [8], [10], [11], [13], [20 ], [21]. Faktisk midler rettet mot survivin er for tiden i fase I og fase II kliniske studier hos pasienter med avansert kreft hvor metoder for hemming inkluderer antisensoligonukleotider (ASOS), transkripsjons repressors og immunterapi [10], [14], [22]. Noen av disse midlene har vist lovende innledende resultater, men ingen har forbedret total overlevelse [3], [4], [7], [10], [11], [14], [22] – [24].
survivin bindes til og hemmer caspase 9, caspase 9 er ute av stand til å spalte caspase 3, caspase 3 er ute av stand til å spalte PARP, PARP fremmer DNA-reparasjon og induserer ikke apoptose.
Selv om det har vært mange rapporter analysere rollen survivin i esophageal plateepitelkarsinom (SCC), har svært få studier adressert sin rolle i esophageal adenokarsinom (EAC) [3], [4], [7] – [9], [21] , [25], [26]. I tillegg uttrykk for denne anti-apoptotiske genet i kreft-tilstøtende plateepitel (CASE) er ikke undersøkt. Hensikten med vår studie var derfor en) for å fastslå graden av Survivin opp regulering i prøver av EAC pasienter og CASE, 2) å vurdere tilbakefall og overlevelse med survivin uttrykk i EAC og CASE vev, og 3) å undersøke effekten av survivin hemming på apoptose i EAC cellelinjer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
undersøkelsen ble utført etter å ha innhentet godkjenning fra University of Pittsburgh Institutional Review Board. Det ble tatt prøver fra UPMC Cancer Center – Esophageal Cancer Risk Registeret, University of Pittsburgh IRB Study Antall 98-122 med URL: https://www.upmccancercenter.com/trials/trialDisplay.cfm?id=2277 type=D. Som en del av studien ble alle pasientprøver innhentet med full skriftlig samtykke.
Cellelinjer
EAC cellelinjer OE19 (JROECL19) og OE33 (JROECL33) ble oppnådd gjennom Sigma-Alderich (St. Louis, MO). De ble begge opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-celle vekstmedium (Life Technologies, Carlsbad, CA, 21870076), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, 26140079), 1% L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25030081), 1% Penicillin-streptomycin (Life Technologies, Carlsbad, CA, 15070063). Alle celler ble lagret i 25 cm
2 kolber og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 fuktet luft. Trypsin-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25200072) ble anvendt for å høste cellene fra deres kolbe og fremstille en enkelt cellesuspensjon for Western blot-analyse og revers transkripsjon -. Polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
siRNA transfeksjon
OE33 og OE19 ble sådd i en 6-brønns plate ved en tetthet på 4 x 10
5 24 timer før transfeksjon. Celler ble enten tilført med små interfererende RNA (siRNAs) eller ubehandlet. SiRNA kategoriene benyttes inkludert survivin bestemt siRNA eller negativ kontroll (krafse) (Dharmacon, Lafayette, CO, D-001810-10-05). Hver siRNA løsningen ble fortynnet fra 100 mikrometer lager til 5 mikrometer i RNase-fritt H
2o, deretter fortynnet til 0,25 mikrometer i Opti-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, 31985062). Samtidig ble to ul transfeksjon reagens 4 (Dharmacon, Lafayette, CO, T-2004) per reaksjon fortynnet med 98 ul Opti-MEM. Løsningene ble hver inkubert i 5 minutter ved værelsestemperatur, blandet sammen og inkubert i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur. Den endelige siRNA oppløsning ble fortynnet til 1 ml pr omsetning med Opti-MEM til en sluttkonsentrasjon på 25 ηM. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet luft, med et RPMI media forandring etter 24 timer. Hele cellelysat ble samlet inn på 48 timer for RNA-analyse eller 72 timer for protein analyse.
Pasienter og Tissue Forberedelse
Undersøkelsen ble utført etter å ha innhentet godkjenning fra University of Pittsburgh Institutional Review Board. Pasienter som gjennomgikk esophagectomy for lokaliserte esophageal adenokarsinom fra begynnelsen av 2008 til slutten av 2010 ble inkludert i studien. Førti-syv prøvene ble undersøkt og etter eksklusive plateepitelkarsinom, adenosquamous kreft, og vevsblokker med mindre enn 70% tumor, ble totalt 37 pasientprøver analysert for denne studien. Kliniske data som alder, kjønn, etnisitet, klinisk stadium, vital status, røyking historie, total overlevelse og tid til tilbakefall ble innhentet fra Institutt for Hjerte kirurgi klinisk database. For å sikre pasientens konfidensialitet, ble en ærlig megler system utnyttes til å gi avidentifisert klinisk datasett knyttet til vevsprøver [27]. Friskt frosset vev innstøpt i oktober ble brukt for kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) og Western blot-analyse. Formalinfiksert, ble parafin-embedded (FFPE) vev som brukes for immunhistokjemi.
Western Blot analyse
Protein ble samlet inn fra hver cellelinje behandlingsgruppe ved å legge lysis buffer (RIPA buffer som inneholder 0,1% proteasehemmer cocktail mix, 0,1% Halt fosfatase inhibitor cocktail mix og 1% PMSF) og ved hjelp av en celle løfteren. Oppløsningen ble rotert i en time ved 4 ° C for å full lysere cellene, og deretter sentrifugert ved 12 000 g ved 4 ° C i 20 minutter for å separere proteinet. Supernatanten som inneholder proteinet ble samlet og kvantifisert ved hjelp av BCA Pierce analysen (Thermofisher, Rockford, IL, 23227). Trettifem mikrogram av protein fra hver prøve ble denaturert og løses ved 4-20% SDS-PAGE gradient gel (Bio-Rad, Hercules, CA, 161-1159), deretter elektro til en Immobilon-P PVDF nitrocellulose membran (Millipore Corporation , Billerica MA, IPVH08100). Membranen ble blokkert i 5% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS-T ved romtemperatur i en time. Antistoffet av interesse, ble inkubert med membranen ved 4 ° C over natten, etterfulgt av 1,5 time inkubasjon ved romtemperatur i tilsvarende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signa, Boston MA, 7074 eller 7076, 1:3,000) Survivin antistoff ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Tx, sc-47750) ble brukt på 1:200, caspase-3 (Cell Signal, Boston, MA, 9665) ved 1:1,000, kløyvde-PARP (Cell Signal, Boston, MA, 9546) ved 1:2,000 og β-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A1978) ved 1:30,000 ble anvendt som en kontroll lasting. Signaler ble utviklet ved hjelp av en chemiluminescence reagens (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 509049324)
Kvantitativ Reverse Transcription -. Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
Total RNA ble renset fra cellelinjer ved hjelp RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, 74004). I korthet pellets som inneholdt 1 x 10
6-celler ble virvlet i RLT lyseringsbuffer, og RNA ble ekstrahert følge produsentens protokoll ved hjelp av et elueringsvolum på 14 ul. Ved hjelp av et ND-2000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), ble kvaliteten og kvantiteten av RNA vurdert av OD
260/280. Komplementær DNA (cDNA) ble revers transkribert fra 3 ug total RNA ved hjelp av RNA til cDNA ecodry premix i et totalvolum på 20 ul (Clontech, Mountain View, CA, 639 547) i henhold til produsentens protokoll. Reaksjonsbetingelsene var 42 ° C i 60 minutter, etterfulgt av 70 ° C i 10 minutter ved bruk av ABI Prism 7900HT PCR thermocycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). PCR ble utført i et totalvolum på 20 pl ved bruk av 600 ng cDNA, 1 x Taqman PCR universell Mastermix (Invitrogen, Grand Island, NY, 4304437), og 1 x Survivin eller GAPDH primer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA hs03043576_m1 og hs99999905_m1) for hver reaksjon. Syklusparametrene var: en syklus på 95 ° C i ti minutter etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i ett minutt på en StepOne Plus-system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Alle reaksjoner ble kjørt i tekniske duplikater.
Utvinning av total RNA fra Dypfryst vev ble gjort ved hjelp av Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA 74104). Kort sagt ble 10 um OCT seksjoner skåret i RLT buffer, lysert ved anvendelse av en 20 gauge nål butt ende og RNA ble ekstrahert følge produsentens instruksjoner under anvendelse av et elueringsvolum på 50 ul. QRT-PCR ble utført med One-step QRT-PCR Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA 4310299) i henhold til produsentens instruksjoner i et totalt volum på 20 ul bruker 2 ul av vev lysat og 1 x Survivin eller 1 × GAPDH primer ( livet Technologies, Carlsbad, CA hs03043576_m1 og hs99999905_m1) for hver reaksjon. Syklusbetingelser ble benyttet var: 1 syklus med 50 ° C i 30 minutter, 95 ° C i 2 minutter og 50 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 45 sekunder ved bruk av ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Carlsbad, California). Alle reaksjoner ble kjørt i tre paralleller teknisk. Forsterkning tomter for begge prøvekategorier, cellelinjer og ferske frosne vev ble undersøkt med StepOne programvare som følger med StepOne Plus-systemet, for å bestemme syklusen terskel (CT). GAPDH ble anvendt for å normalisere ekspresjonsdata. De 2
-ΔCT metoden ble benyttet for å bestemme survivin kaste uttrykk i svulstvev og CASE.
immunhistokjemi
FFPE- seksjonene ble immunostained vise survivin uttrykk i EAC svulsten og sammenkoblede squamous epitelceller prøver . Reaktive humant tonsil og ikke-immunserum ble kjørt parallelt som positive og negative kontroller, respektivt. Vevsprøver ble kuttet ved 4 pm på ladede lysbilder og deparaffinized. Platene ble nedsenket i 0,01% Triton X-100 i ti minutter ved romtemperatur, skylt i springvann H
2o, og deretter nedsenket i 10 mM citratbuffer, pH 6,0 ved 95 ° C i 20 minutter for antigen gjenfinning. Blokkering skjedde med 3% H
2o
2 etterfulgt av en vannkran vask. Etter tre vasker av 1 × Tris-bufret saltvann med 0,001% Tween 20 (TBS-T), ble glir videre blokkert i 2,5% normalt hesteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401). Den survivin primære antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc47750) ble påført på 1:50, over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket tre ganger i TBS-T, og deretter inkubert i ImmPress-anti-kanin-reagens (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401) i 30 minutter for å hjelpe til med Survivin uttrykk deteksjon. Igjen ble platene vasket tre ganger i TBS-T, og utviklet ved hjelp ImmPact DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK4105).
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS programvare (IBM, Armonk, NY, versjon 20). En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Innenfor hver vevsprøve, middelverdier av Survivin mRNA uttrykk nivåer (bestemt av to
-ΔCT metode) ble evaluert i både EAC svulstvev (tumor Survivin nivå) og prøver CASE vev (normal survivin nivå). Student t test ble brukt for å sammenligne gjennomsnittlig tumor og normal Survivin nivåer. Mottaker som opererer karakteristikk (ROC) analyse ble brukt for å bestemme om Survivin nivåene kunne brukes til å definere høy og lav risikogrupper for tilbakefall; høy risiko /lav risiko terskler etablert i ROC-analyser ble brukt til å kategorisere pasienter som høy risiko /lav risiko for både CASE vev Survivin nivåer og EAC vev Survivin nivåer. Separate ROC analyser ble gjennomført forutsi tilbakefall fra CASE vev Survivin nivåer og fra EAC vev Survivin nivåer. I begge tilfeller visuell inspeksjon av de fremstilte grafiske tallene ble brukt i forbindelse med oppført Survivin stillingen snittpunkter med tilsvarende følsomhet og (1 minus) spesifisitet for å bestemme optimale terskelverdier for å definere høy og lav risikogrupper.
Angå ROC prosedyre for terskelen besluttsomhet, brukte vi standard metode for visuelt inspisere kurven for å bestemme det punktet nærmest det øverste venstre hjørne av ROC tallet, sammen med inspeksjon av tilsvarende sensitivitet og spesifisitet verdier langs tilgjengelige verdier. Dette ga grunnlag for fastsettelse av hvilken verdi gitt den beste balansen mellom sensitivitet og spesifisitet. Ved inspeksjon av ROC tall, denne inspeksjonen var relativt enkelt for CASE, men var noe mindre oversiktlig for tumorcellenivå. I dette tilfelle ble en verdi valgt som understreket følsomhet på bekostning av spesifisitet, som falske negativer ble bedømt til å være farligere enn det som var falske positiver. Denne stolte mer tungt på de beregnede følsomhet /spesifisitet verdier som det var en ikke-signifikant AUC (areal under kurve) og følgelig ikke visuelt synlig klippepunktet.
Kaplan-Meier kurve ble generert for å bestemme overlevelse basert på høy og lav risiko tilbakefall grupper. En Mantel-Cox Logg Rank Test ble gjennomført for å sammenligne total overlevelse mellom risikogrupper. En Cox modellen ble brukt til å vurdere effektiviteten av survivin nivå innen både saken og EAC vevsprøver i å forutsi dødelighet.
Resultater
Overuttrykte survivin i EAC cellelinjer, menneskelig svulst og CASE vev
survivin mRNA uttrykk var betydelig høyere i tumorprøver sammenlignet med CASE vevsprøver på QRT-PCR-analyse (figur 2A). I gjennomsnitt, tumorprøver viste nivåer av survivin uttrykk 3 × større enn for CASE vev (p. 0,00001 figur 2B). Immunhistokjemi (figur 3) og Western Blot analyse (data ikke vist) også bekreftet survivin uttrykk i både EAC tumor samt CASE
A:. QRT-PCR ble utført for å sammenligne survivin uttrykk mellom svulst og tilstøtende plateepitel epitel vev. B: I gjennomsnitt, tumorprøver viste 3 × større survivin uttrykk enn paret nærliggende vev
Survivin uttrykk ble evaluert gjennom IHC farging, tumorvev og tilstøtende plateepiteldysplasi viste tilstedeværelse av flekker indikerer survivin uttrykk.. Piler representerer positiv farging.
Hemming av survivin i EAC cellelinjer ga økt apoptose
siRNA rettet mot survivin resulterte i redusert uttrykk av survivin i OE19 og OE33 cellelinjer sammenlignet med kontroller på QRT-PCR (figur 4A). Tilsvarende siRNA inkubering resulterte i nedregulering av Survivin ekspresjon i begge cellelinjene for Western Blot-analyse. Nedgangen i Survivin ekspresjon resulterte i oppregulering av nedstrøms apoptotiske protein, spaltes PARP. Spaltes kaspase 3 ble forbrukt ved reaksjon med PARP, noe som resulterer i oppregulering av spaltet PARP (figur 4B).
OE19 og OE33 EAC cellelinjer ble transfektert med siRNA og Survivin ekspresjon ble analysert mellom kontroll og transfekterte cellelinjer. Begge cellelinjer transfektert med siRNA viste tydelig hemning og nedregulering av Survivin uttrykk. B: Western blot av siRNA hemming av survivin i EAC cellelinje. siRNA ble inkubert med OE19 og OE33 cellelinjer for å hemme Survivin uttrykk. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Survivin ble nedregulert, mens nedstrøms apoptotiske proteiner spaltes caspase 3 og kløyvet PARP ble oppregulert. Oppregulering av nedstrøms apoptotiske proteiner indikerer apoptose skjer gjennom inkubasjon med siRNA.
Kliniske implikasjoner av survivin overekspresjon
Tretti-sju EAC pasienter som gjennomgikk esophagectomy for lokaliserte esophageal adenokarsinom ble inkludert i studien (tabell 1). Prøvene består tretti menn (81%) og sju kvinner (19%) med aldre, fra 44 til 90 år (gjennomsnitt = 62,76, SD = 10,94). Stage fordeling av studiekohorten basert på den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) stadieinndeling bekreftet 6 pasienter med stadium I sykdom, 13 med stadium II og 18 pasienter med stadium III sykdom (tabell 2). Syv pasienter fikk neo-adjuvant behandling og atten pasienter fikk adjuvant kjemoterapi etter operasjonen. To pasienter i neo-adjuvant gruppen fikk samtidig chemo-stråling og flertallet av pasientene fikk platina /fluorouracil basert kombinasjon kjemoterapi (tabell 3). På en gjennomsnittlig oppfølging av 12.06 måneder, tretten pasienter utviklet tilbakefall, 12 pasienter med fjernmetastaser og en pasient der data ikke ble rapportert. Av de 12 pasienter med fjernmetastaser, tre hadde også lokalt residiv. Ti pasienter (77%) døde på tidspunktet for langsiktig oppfølging.
ROC analyse indikerte at en terskel som er større enn eller lik 2,85 for middel Survivin mRNA uttrykk i CASE var indikasjon på en økt risiko for fjernmetastaser med en følsomhet på 0,77, spesifisitet på 0,83, og en AUC på 0,73 (p. 0,05 PPV = 0,71, NPV = 0,87) (figur 5). Dermed pasienter som viser gjennomsnittlig survivin uttrykk på 2,85 eller høyere i CASE ble klassifisert i høyrisikogruppen og de med uttrykk nivåer på mindre enn 2,85 ble kategorisert i den lave risikogruppe. Til tross for en normal histologisk utseende, Survivin overekspresjon i tilfelle viste seg å være en indikator på fjernmetastaser. Survivin uttrykk i svulstvev korrelerte ikke med tilbakefall. Kategorisering i høy og lav risikogruppene ved hjelp av en terskel
svulst
survivin uttrykk for 3,66 ikke forutsi tilbakefall (p = 0,55), men spår en økning i oddsen for å dø av EAC (beskrevet senere).
sannsynligheten for fjernmetastaser ble bestemt for survivin nivåer i menneskelig EAC svulsten og tilstøtende plateepitel epitelvev. En økt survivin nivå i tilstøtende plateepitel epitelvev var fast bestemt på å være en risikofaktor for fjernmetastaser (p = 0,02).
Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert for høy og lav risikogrupper basert på CASE survivin uttrykk. Høyrisikogruppen påvist en sammenheng med økt dødelighet, selv om sammenhengen ikke nådde signifikans (p = 0,12, figur 6). Kaplan-Meier analyse for svulst Survivin høy og lav risikogruppene ga lignende resultater (p = 0,11).
Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert for høy og lav risikogrupper basert på tilstøtende plateepitel epitel survivin CASE-uttrykket. Høyrisikogruppen påvist en sammenheng med økt dødelighet, selv om sammenhengen ikke nådde betydning. Kaplan-Meier analyse for svulst Survivin høy og lav risikogruppene ga lignende resultater (p = 0,11).
En Cox modellen ble brukt til å vurdere effektiviteten av survivin nivå innen både CASE og EAC svulst vevsprøver i forutsi dødelighet. Andre risikofaktorer vurderes var alder ved esophagectomy, tobakksbruk (i pakker per år), alkoholforbruk, og en historie med Barretts øsofagus (tabell 4). Røyking var assosiert med en høyere dødsrate (p = 0,06) med oddsen for dødelighet er 1.018 større for hver pakke per år røykte. Survivin ekspresjon i tumorvevet var assosiert med øket risiko for død (p = 0,05). Sannsynligheten for en pasient i høyrisiko svulst survivin gruppen opplever døden var 5.23 ganger større enn for en pasient kategorisert i lav risikogruppen (p 0,05)
Diskusjon
.
studier har vist høyere nivåer av survivin i metaplastiske søyle epitel og dysplastisk Barretts epitel i forhold til squamous vev og dermed støtter hypotesen om at oppregulering av dette genet er sannsynligvis en tidlig begivenhet foregående utvikling av adenokarsinom [12]. Rapporter har også støttet survivin som en potensiell biomarkør i esophageal plateepitelkarsinom [28], men det er motstridende bevis om sin prognostisk rolle i esophageal adenokarsinom [29]. I en studie av Rosato og kolleger, Survivin uttrykk hadde ingen prognostisk verdi for pasienter med EAC. [9] Målet med denne studien var å vurdere rollen til denne anti-apoptotiske genet i større dybde i esophageal adenokarsinom og CASE tar hensyn svulst heterogenitet samt uttrykk for genetiske endringer før histologisk manifestasjon av svulst fenotype i tilstøtende epitel .
Analyse av menneskelig vev ved hjelp av IHC, Western blot, og QRT-PCR bekreftet oppregulering av survivin i EAC svulstvev enn CASE. Våre resultater etablert at økt survivin uttrykk i EAC svulstvev er en risikofaktor for død med høy risiko tumor survivin gruppen er fem ganger større sannsynlighet for å dø enn dem som er kategorisert i lav-risiko Survivin gruppe. Det er mulig at jo høyere ekspresjon i EAC tumorvevet kan være knyttet til aggressivitet av tumoren (dvs. forverring cellulær feilregulering), derav korrelere med dødelighet. Men basert på vår utvalgsstørrelse, er denne studien trolig underpowered og større serie av pasienter ville være nødvendig for å studere disse assosiasjonene videre.
I tillegg uttrykk for survivin i CASE var ikke helt fraværende, som ville være forventet for terminalt differensiert normal skjellepitel [10], [11]. Vurderer bevis som viser oppregulering av dette genet i pre-maligne metaplastiske og dysplastisk søyle epitel, våre data tyder på at survivin overekspresjon kan være et tidlig genetisk hendelse inntreffer i histologisk normalt vises plateepiteldysplasi før utvikling av metaplasi og transformasjon til adenokarsinom. Selv om mucosa ved siden av tumoren opprettholder skvamøs differensiering, havner det overekspresjon av denne anti-apoptotiske genet som kan være en potensiell driver av tumorigenesis. Alternativt kan det bli postulert at basert på sammenhengen med tilbakefall, kan Survivin uttrykk i tilfelle være tenkt som den molekylære tilsvarer en positiv margin og /eller en prediktor for fjernmetastaser. Hvis forhøyede Survivin nivåer i tilfelle representerer molekylære bevis for at nærliggende vev viser tegn til malignitet, kan prognosen være verre enn det spådd av pTNM klassifiseringssystemet. Det kan bli postulert at det faktum at det ikke var en økning i dødeligheten hos pasienter med forhøyede Survivin nivåer i tilfelle kunne representerer en type II feil sekundært til den lille utvalgsstørrelsen. Større studier kan bidra til å avklare disse assosiasjonene
Det faktum at survivin uttrykk i tumor ikke korrelerer med tilbakefall kan være fra det faktum at disse pasientene hadde dødd før tilbakefall kunne ha blitt dokumentert.; denne antagelsen understøttes av det faktum at det var flere pasienter med langt fremskreden sykdom stadium i høyrisiko tumor uttrykk gruppe. Dessuten, som dokumentert fra tidligere studier, oppviser hver tumor betydelig heterogenitet med intra-tumor variasjoner i somatiske mutasjoner, allelisk sammensetning, tumor suppressor og onkogen dysregulering [30]. Det overvekt av flere unike kloner i samplet svulstvev kan føre til inkonsistente resultater når du utfører molekylær profilering av en gitt kreft. I denne studien ganger endring i survivin mRNA var svært variabel i svulstvev i forhold til saken, og dette kan reflektere svulst heterogenitet og gi en potensiell forklaring på manglende samsvar med svulst gjentakelse. CASE demonstrerte mer konsekvent nivåer og er kanskje et bedre underlag for evaluering av survivin som en prognostisk markør hos pasienter med EAC. Disse dataene understreker behovet for en felles innsats for å banken og analysere kreft ved histologisk normalt vises vev for molekylær profilering i EAC og kanskje andre svulster.
Cell line analyse i denne studien bekreftet klar hemming av Survivin gjennom transfeksjon med siRNA. Survivin ble effektivt downregulated og spaltet caspase 3 ble forbrukt i reaksjonen som fører til oppregulering av spaltet PARP, noe som indikerer at inhibering av Survivin fører til aktivering av apoptotiske reaksjonsvei. Som Survivin ikke blir uttrykt i normalt vev, er det potensielt et ideelt mål for nye midler [10], [11]. Derfor effektiv hemming gjennom siRNA med nedstrøms aktivering av apoptose støtter gyldigheten av fremtidige kliniske studier i EAC vurdere effektiviteten av en roman agent som bruker siRNA eller andre hemmende veier [10].
I konklusjonen dette studiet støtter oppregulering av survivin som en potensiell tidlig genetisk endring i EAC forekommer i normal vises CASE. Survivin uttrykk innenfor EAC vev var en signifikant prediktor for dødelighet, mens uttrykket nivå av survivin i CASE var en mer pålitelig prediktor for svulst gjentakelse. I tillegg viste også vi at hemming av survivin i EAC cellelinjer fører til oppregulering av apoptose støtte videre evaluering av terapeutiske strategier rettet mot denne markøren.
De begrensninger i studien omfatter den lille utvalgsstørrelse og en relativt kortere følge opp. Videre studier med større utvalgsstørrelser og lengre oppfølging kan bidra til å avklare noen av de foreninger registrert i studier på survivin uttrykk i EAC og CASE. Dette vil også bidra til å kontrollere for flere faktorer som påvirker tilbakefall og overlevelse hos pasienter med EAC.
Takk
Dr. James D. Luketich for hans støtte av studien.
