Abstract
kreft-testis (CT) familie av antigener er uttrykt i en rekke ondartede svulster. I de fleste tilfeller er det ikke CT antigen som finnes på normale vev med unntak i testikkel, noe som gjør dem ideelle mål for cancer immunoterapi. har ennå ikke blitt rapportert En omfattende analyse av CT antigen uttrykk i prostatakreft. MAGE-C2 /CT-10 er en ny CT antigen. Målet med denne studien var å analysere omfanget og prognostisk betydning av MAGE-C2 /CT10 protein uttrykk i prostatakreft. 348 prostata karsinom fra påfølgende radikale prostatectomies, 29 kastrering-ildfast prostatakreft, 46 metastaser, og 45 godartede hyperplasias ble immunohistochemically analysert for MAGE-C2 /CT10 uttrykk ved hjelp av microarray. Nuclear MAGE-C2 /CT10 uttrykk ble identifisert i bare 3,3% primære prostata karsinom. MAGE-C2 /CT10 protein uttrykk var signifikant hyppigere i metastatisk (16,3% positivitet) og kastrering resistent prostatakreft (17% positivitet; p 0,001). Nuclear MAGE-C2 /CT10 uttrykk ble identifisert som prediktor for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi (p = 0,015), som var uavhengig av preoperativ PSA, Gleason score, tumor stadium, og kirurgisk margin status i multivariat analyse (p 0,05). MAGE-C2 /CT10 uttrykk i prostatakreft korrelerer med graden av malignitet og indikerer en høyere risiko for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi. Videre tyder resultatene MAGE-C2 /CT10 som et potensielt mål for adjuvant og palliativ immunterapi hos pasienter med prostatakreft
Citation. Von Boehmer L, Keller L, Mortezavi A, Provenzano M, Sais G, Hermanns T, et al. (2011) MAGE-C2 /CT10 Protein Expression er en uavhengig prediktor for Regelmessighet i prostatakreft. PLoS ONE 6 (7): e21366. doi: 10,1371 /journal.pone.0021366
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 18 januar 2011; Godkjent: 28 mai 2011; Publisert: 06.07.2011
Copyright: © 2011 von Boehmer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Atlantic Philanthropies (New York, USA), Cancer Research Institute, Science Foundation for Oncology, Hanne Liebermann Foundation (Zürich), den Hartman Müller Foundation (Zürich), Zürich Cancer League (Zürich), og Terry Fox Foundation (Winnipeg, Canada). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Når prostata kreft er lokalisert i prostata, behandling av valget er prostatektomi eller strålebehandling. Men når svulsten tilbakefall eller er allerede metastatisk ved diagnose, er terapi problematisk. Kastrering har vært den viktigste behandlingsalternativ for unconfined sykdom i mer enn 50 år. Men pasientene ofte fremgang etter endokrin behandling [1]. Forekomst av kastrering resistens er assosiert med dårlig prognose og bare palliativ terapi er tilgjengelig i slike avanserte tumorstadier. Immunoterapi rettet mot kreft-testikkel (CT) antigener er lovende nye behandlingsmetoder for avansert lungekreft, eggstokk-kreft og melanom-pasienter [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], men CT antigener, bortsett NY-ESO-1 [10], ikke har vært anvendt som vaksine mål for prostatakreft.
i de fleste tilfeller, CT antigener er bare uttrykkes i bakterieceller av den menneskelige testikler. Hittil har mer enn 100 CT antigener blitt identifisert, som tilhører minst 44 forskjellige familier. CT antigener kartlegging til kromosom X er referert til som CT-X-antigener og skilles fra ikke-X CT antigener som ligger på andre kromosomer [11]. Ekspresjonen av CT-X-antigener varierer mellom ulike tumortyper og er mer utbredt i høyere grad og avansert stadium tumorer [12], [13], [14], [15]. De er oftest uttrykt i melanomer [16], blære [17], [18], lunge [12], eggstokk [19], og levercellekarsinom [20], og er uvanlig i nyrecellekreft [21], tykktarmskreft [22], og hematologiske maligniteter [23].
Interessant, et medlem av CT-antigener,
vises MAGE-A11
å direkte bidra til utvikling av androgen uavhengig prostatatumorvekst ved å stimulere aktiviteten til androgen reseptoren [24].
MAGE-A11
uttrykk er regulert av DNA metylering status: i kastrerings-tilbakevendende prostatakreft,
MAGE-A11
er oppregulert, samkjøre med hypometylering av diskrete CpG områder som grenser til transkripsjonsstart stedet genet, derimot, metylering status for andre regioner av
MAGE-A11
arrangøren CpG island ikke korrelerer med genuttrykk [24]. Videre behandling av prostata celler med decitabine fører oppregulering av
MAGE-A11
uttrykk [24], [25].
Studier analysere mRNA uttrykk [26], [27], [28] , [29], [30] og immunohistokjemiske analyser [31], [32], [33] av flere CT-antigener er blitt utført. Det er bevis for at utvikling NY-ESO-1-ekspresjon i tumor endres fra negativ til positiv i progresjon av sykdommen [34]. I prostata cancer, som er kjent for å være en forholdsvis langsom progresjon sykdom, varierer uttrykk stadium avhengig fra 5% til 30% [29], [31]. Nylig, et antistoff mot MAGE-C2 /CT-10, en ny CT antigen har blitt generert [35]. Den MAGE-C2 /CT-10 genet viser betydelig homologi med MAGE-C1 /CT-7 genet og begge genene kart i umiddelbar nærhet til kromosom Xq27.13. MAGE-C2 /CT-10 ble opprinnelig identifisert i en melanomcellelinje. Inntil nå var MAGE-C2 /CT10 mRNA uttrykk i prostata kreft analysert i noen prostata prøver, bare. I en studie av Prikler et al, 12 kastrering-resistent og åtte hormonfølsomme svulster var CT10 negative. Videre Lucas et al. fant en av ti prostata kreftvev å være CT10 positiv [28], [30].
Vi har rapportert MAGE-C2 /CT-10 i en stor andel av hepatocellulært karsinom (HCC) [20]. Mens testing av MAGE-C2 /CT-10-antistoff i en multi-tumorvev microarray, identifiserte vi MAGE-C2 /CT10 protein-ekspresjon i enkelte tilfeller PCA. Basert på denne observasjonen, utførte vi en omfattende vev microarray basert analyse av PCa. Vi viser at protein ekspresjon av MAGE-C2 /CT10 er funnet i en vesentlig delmengde av prostatakreft, hovedsakelig metastatiske og kastrerings resistente primære svulster. Vi viser videre at MAGE-C2 /CT10 uttrykk ble identifisert som prediktor for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi, uavhengig av kjente risikofaktorer.
Materialer og Metoder
Prostata microarray
i alt 468 formalinfikserte, parafininnstøpte prostata vev ble hentet fra arkivene til institutt for kirurgisk patologi, Universitetet Zürich, Sveits og en vev microarray (TMA) ble konstruert som beskrevet tidligere [36]. Den TMA inkluderte en rekke 348 rad (ikke valgt) radikal prostatektomi eksemplarer med prostatakreft, 29 kastrering resistent prostatakreft prøvene, 18 lymfeknutemetastaser, 28 fjernmetastaser (bein, lunge, urinblæren) og 45 benign prostatahyperplasi prøver. H E-fargede lysbilder av alle prøvene ble vurdert på nytt av erfarne patologer (P.J.W., H. M.) for å identifisere representative områder for TMA bygging. Tumorstadium og Gleason score på kohorten ble tildelt i henhold til International Union Against Cancer (UICC) og WHO /ISUP kriterier [37]. Median oppfølging av kohorten var 71 måneder (0-163). Rådata av vevet microarray har blitt avsatt under (link vil bli sendt). The Zurich cantonal vitenskapelige etisk komité for patologi (KEK) godkjent studien og fravikes behovet for samtykke (Ref. Nr STV-Nr-05/2007).
Immunohistochemistry
uttrykk for MAGE-C2 /CT10 ble analysert immunhistokjemisk som nylig rapportert [20]. Kliniske og patologiske parametre av prostata krefttilfeller som inngår i TMA er oppsummert i tabell S1. Påfølgende 3 mikrometer seksjoner ble kuttet fra TMA blokker og montert på glassplater (Super-Frost Plus, Menzel, Braunschweig, Tyskland). For immunhistokjemisk farging Ventana Benchmark automatiserte farging system (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) og Ventana reagenser ble brukt. Etter deparaffinization i xylen, ble lysbilder rehydrert i avtagende konsentrasjoner av etanol. Endogen peroksidase ble blokkert ved hjelp av Ventana endogen peroxidase blokkere settet etter en skylling med destillert vann. For antigen gjenfinning lysbilder var oppvarmet med celle condition løsning (CC1, Ventana) i henhold til produsentens instruksjoner. For påvisning av MAGE-C2 /CT-10, mAb CT10 # 5 tidligere er generert av vår gruppe [35], for påvisning av MAGE-C1 /CT7, klone CT7-33, DAKO A /S og for NY- ESO-en klone E978, Zymed var ansatt og justert til Ventana Benchmark systemet etter å ha utført titreringer (optimal fortynning 1:100, 1:80, 1:50 henholdsvis). iView-DAB ble brukt som kromogen. Normal testikkelvev ble valgt som intern positiv kontroll for MAGE-C2 /CT10, MAGE-C1 /CT7 og NY-ESO-1 uttrykk. MAGE-C2 /CT10 uttrykk var kjernekraft, MAGE-C1 /CT7 og NY-ESO-1 uttrykk var cytoplasma og kjernekraft. For negative kontroller ble det primære antistoff utelatt. To etterforskere (L.v.B., L.K.) utførte en blindet evaluering av lysbildene for MAGE-C2 /CT10, MAGE-C1 /CT7 og NY-ESO-1 uttrykk. Non-tolkbare resultater, på grunn av mangel på carcinoma vev, tilstedeværelse av nekrose eller knuse gjenstand, ble ekskludert fra analysen. Minst 100 celler ble telt i hvert TMA kjerne. Nuclear MAGE-C2 /CT10 immunoreaktivitet ble evaluert ved anvendelse av en semi-kvantitativ, trinnvise poengsystem: negativ (0% av cellekjerner farget); svak nukleær farging (1-10% av kjerner farget); moderat nukleær farging (11-50% av kjerner farget); sterk nukleær farging (51 til 100% av kjerner farget). Søke etter tidsavgrensninger på en saklig måte er et stort problem i immunhistokjemiske studier som handler om en kontinuerlig avlesning. Median atom CT10 immunoreaktivitets i prostatektomi tilfeller (median 0%) ble valgt som cutoff. Følgelig var positiv atom CT10 immunoreaktivitet definert som nukleær farging på minst 1% av målceller. NY-ESO-1- og CT7- farging er cytoplasmisk eller kjernefysisk, ble immunreaktiviteten evaluert ved anvendelse av en semi-kvantitativ, trinnvise poengsystem: negativ (0% av cellene farget); svak nukleær farging (1-10% av cellene farget); moderat farging (11-50% av cellene farget); sterk farging (51 til 100% av cellene farget). Median NY-ESO-1 og CT7 immunoreaktivitet (median 0%) ble valgt som cutoff. Følgelig ble positiv farging for NY-ESO-1 og CT7 immunoreaktivitets definert som kjernefysisk eller cytoplasmatisk farge i minst 1% av målceller.
Statistiske analyser av vev microarray data
SPSS versjon 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt for statistiske analyser. P-verdier 0,05 ble betraktet som signifikant. Ved flere tester den Bonferroni-Holm prosedyre ble brukt. Beredskaps tabellen analyse og tosidig Fishers eksakte tester ble brukt til å studere statistiske sammenhenger mellom clinicopathological og immunhistokjemiske data. For sammenligning av to uavhengige utvalg den ikke-parametriske Mann-Whitney U-testen ble beregnet. Tid til PSA tilbakefall (cut off≥0.1 ng /ml) ble valgt som klinisk synspunkt slutt. Tilbakefall overlevelse (RFS) kurvene ble beregnet av Kaplan-Meier metoden med betydning evaluert av tosidige log-rang statistikk. Pasientene ble sensurert på tidspunktet for deres siste tumor-fri klinisk oppfølging besøk. Pasienter som ikke nådde PSA nadir ( 0,1 ng /ml) etter operasjonen ble ekskludert. En trinnvis multivariabel Cox regresjonsmodell ble justert, testing uavhengig prognostisk relevansen av MAGE-C2 /CT10 immunoreaktivitets. Proporsjonalitets forutsetning for alle variabler ble vurdert med log-negativ-logg overlevelse fordelingsfunksjoner. Statistiske betraktninger angående prøvestørrelsen er angitt i figur 1. Beregninger ble utført ved bruk av de respektive modellene av programvaren PASS 2008 (NCSS, Kaysville, UT).
MAGE-C2 /CT10 ekspresjon kunne observeres hos 11 av 341 (3,2%) prostatektomi prøver. Forekomsten av MAGE-C2 /CT10 uttrykk bør doble risikoen for tilbakefall i løpet av PSA følge opp, noe som resulterer i en fareforhold på omtrent 2,0. Følgelig vil den tilgjengelige prøvestørrelse på 341 analyserbare pasienter være tilstrekkelig til å detektere en forskjell om PSA tilbakefall med en betydning av p 0,05 og en kraft på ca. 86%. For høyere hazard ratio (2.4, 2.8, 3.2) ble en statistisk styrke på ca 99% beregnet.
Resultater
MAGE-C2 /CT10 uttrykk i normal og ondartet prostatavevet
Omfattende kliniske og histopatologiske data er gitt i tabell S1. Totalt kan 456 av 468 kjerner (97,4%) vurderes for MAGE-C2 /CT10 immunoreaktivitets. Et representativt MAGE-C2 /CT10 fargingsmønster er vist i figur 2A-C. MAGE-C2 /CT10 uttrykk ble ikke påvist i prostatahyperplasi. Organ-begrenset kreft viste atom MAGE-C2 /CT10 uttrykk i 3,3% (11/330) tilfeller, mens metastatisk og kastrering resistent sykdom var positive i 16,3% (7/36) og 17% (5/23) av tilfellene, henholdsvis . Nuclear MAGE-C2 /CT10 flekker gradvis økt fra prostatahyperplasi til prostata-begrenset kreft til metastatisk og kastrering resistent sykdom (figur 3; p 0,001). Som vist i fig S1, kan differensial CT10 uttrykk mellom normalt og neoplastisk vev observeres: andelen av CT10 positivitet betydelig økt fra benign prostatahyperplasi til organ begrenset prostatakreft til kastrering motstandsdyktig prostatakreft og metastatisk sykdom, inkludert lymfeknute og benmetastaser. Som tidligere beskrevet [1], er nevroendokrine differensiering mer utbredt i kastrering motstandsdyktig prostatakreft. Imidlertid kan ingen koekspresjon av CT10 og nevroendokrine markører som synaptophysin og kromogranin oppdages (figur S2). Ingen sammenheng mellom atom MAGE-C2 /CT10 uttrykk og alder ved diagnose, Gleason score, tumor stadium, lymfeknutestatus, kirurgisk margin status eller preoperativ PSA nivåer ble funnet (tabell 1). Interessant, CT10 ble betydelig co-uttrykkes med andre CT antigener, som NY-ESO-1 og CT7 (fig 2D-I.)
En (Fig. 4). Radikal prostatektomi prøven (Gleason 4 + 3 ), B: Bone metastasering av prostatakreft, C: Bone metastasering av prostatakreft, D: radikal prostatektomi prøven (Gleason 4 + 3), E: Kastrering resistent prostatakreft (Gleason 5 + 5), F: Palliativ transuretral reseksjon av prostatakreft (Gleason 4 + 5), G: Bone metastasering av prostatakreft, H: Palliativ transuretral reseksjon av prostata kreft (Gleason 5 + 4), i: Kastrering resistent prostatakreft (Gleason 5 + 4). Original forstørrelse: 200 ×; Forstørrelse bar: 20 mikrometer
BPH. Benign prostatahyperplasi; ADCA: orgel-begrenset adenokarsinom i prostata; MTS: prostatakreft metastase; CRPC. Kastrering resistent prostatakreft
MAGE-C2 /CT10 og prognose
Pasienter med MAGE-C2 /CT10 positiv prostatakreft ble sammenlignet med negativ saker om RFS av univariate Cox regresjonsanalyse (tabell 2). MAGE-C2 /CT10 ekspresjon var signifikant assosiert med kortere RFS (p = 0,015; figur 5). Pasienter med MAGE-C2 /CT10 positive tumorer hadde en median RFS av 51 måneder (95% konfidensintervall 17-86 måneder) sammenlignet med 116 måneder (95% konfidensintervall 107-125 mnd) for pasienter med MAGE-C2 /CT10 negative svulster . Foruten uttrykk for MAGE-C2 /CT10, økt Gleason score (p 0,001), tumorstadium (p 0,001), kirurgiske marginer (p 0,001) og preoperativ PSA-nivå (p 0,001) var signifikant assosiert med kortere RFS tid .
i en multivariat analyse ble en Cox regresjonsmodell utviklet for vurdering av RFS rate. Kjennetegn på variabler er vist i tabell 3. Bare MAGE-C2 /CT10 uttrykk, Gleason score, tumor stadium, kirurgisk margin status og preoperativ PSA nivåer ble vurdert. Alle variabler, inkludert MAGE-C2 /CT10 uttrykket (p = 0,03), forble signifikant. Hazard ratio for MAGE-C2 /CT10 uttrykk var 2,770 (95% konfidensintervall 1,106 til 6,934).
Diskusjoner
I denne studien har vi analysert tilstedeværelse av MAGE- C2 /CT10 protein i et representativt kohort av pasienter med prostatakreft og fant MAGE-C2 /CT10 å være ofte uttrykt i avansert prostatakreft; dvs. i metastatisk og kastrering-resistent sykdom. Videre har vi identifisert kjernefysisk MAGE-C2 /CT10 uttrykk som en prediktor for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi, som var uavhengig av de godt etablerte prediktive faktorer, inkludert preoperativ PSA, Gleason score, tumor stadium, og kirurgisk margin status.
Vi oppdaget atom MAGE-C2 /CT10 positivitet i 16,3% og 17% av pasienter med metastatisk og kastrering resistent sykdom henholdsvis, men bare i 3,3% av orgel begrenset PCa. Dette funnet er av klinisk betydning, fordi en undergruppe av pasienter med avansert, kastrering motstandsdyktig PCa kan vurderes for immunterapi i fremtiden. Tidligere studier har vist at MAGE-C2 /CT10 er i stand til å indusere spesifikke immunresponser i det autologe verten. Cytotoksiske T-lymfocytter som er rettet mot MAGE /CT-10-epitoper har blitt funnet i melanompasienter og antistoffer rettet mot MAGE-C2 /CT-10 ble påvist i melanoma og pasienter [38], [39], [40], [12], [41].
MAGE-C2 /CT10 tilhører MAGE-familien av CT antigener [42]. I en fersk undersøkelse, Yang et al. viste at MAGE-C2 kan virke som ko-repressor av p53 ved binding til KAP1 styrke undertrykkelse av p53. Disse resultater antyder at MAGE-C2 bidrar til utvikling av maligniteter ved å tilveiebringe en overlevelsesfordel [43]. MAGE genekspresjon epigenetiske trykt av promoter region metylering i de fleste celler, men faktorene som styrer MAGE-genpromoteren metylering har ikke blitt fullt ut identifisert. Yang et al. har vist at MAGE genekspresjon epigenetiske styres av KIT tyrosinkinase [44]. Forstå faktorene som styrer MAGE genekspresjon kan tillate mer effektive terapeutiske strategier rettet MAGE antigener [45], [46], [47].
Mens vår studie bekrefter tidligere studier rapporterer lav forekomst av CT antigener i organ-begrenset prostatakreft, den økte MAGE-C2 /CT10 antigen uttrykk i avansert PCa var en uventet nytt funn. Også CT antigen ekspresjon har ennå ikke blitt analysert i større kohort av PCA pasienter. Så vidt vi vet, har bare 30 svulster blitt analysert for MAGE-C2 /CT10 mRNA uttrykk tidligere: positivitet ble rapportert hos 1/10 og 0/20 tumorprøver [30], [32]. I andre svulster, ble MAGE-C2 /CT10 protein tidligere identifisert i 34% -48% av hepatocellulært karsinom [20], [48], i 43% av myelomatose [49], i 20% av høy klasse uroteliale karsinom av urinblæren [18], i 20% av hode og nakke kreft [28], og i 43% av melanomer, henholdsvis. Den rapporterte 5% prevalens av MAGE-C2 /CT-10 uttrykk i kolorektal kreft [50] kan sammenlignes med vår funn av sjeldne MAGE-C2 /CT-10 uttrykk i primær PCa. En dårlig overlevelse ble observert i avansert MAGE-C2 /CT-10-positive urothelial karsinom i urinblæren, men MAGE-C2 /CT-10 uttrykk hadde ingen prognostisk effekt i HCC.
Viktigere vår studie identifisert MAGE-C2 /CT-10 som en uavhengig prediktor for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi, noe som gir en potensiell grunnlag for bedre forutsigelse og behandling stratifisering av pasienter med PCa. Den utbredte bruken av serum prostata-spesifikt antigen (PSA) screening har ført til identifisering av et økende antall asymptomatiske lav-trinns svulster hos yngre menn [51], [52]. En ennå ubesvart viktig kliniske spørsmål er om disse pasientene trenger behandling og i så fall hvor aggressivt bør dette potensialet behandlingen være. Pasienter med lokalisert sykdom blir fortrinnsvis behandles med enten radikal prostatektomi eller strålebehandling, både med kurativ hensikt [53], [54]. Foreløpig er prognostication og behandling stratifisering ved diagnosetidspunktet basert på klinisk stadium, biopsi Gleason grad, og serum PSA nivåer. I saker som behandles etter radikal prostatektomi, kan prognosen være raffinert ved hjelp av patologisk stadium og Gleason grad. Men disse prognostiske indikatorer ikke nøyaktig forutsi klinisk utfall for den enkelte pasient. Forbedret markørene er nødvendig for å avgjøre hvilke pasienter som er i faresonen, og bør derfor behandles mer aggressivt. MAGE-C2 /CT-10 bør legges til listen over forslag prognostiske tumorprogresjon markører, inkludert MUC1 [55], AZGP1 [55], EZH2 [56], E2F3 [57], Ki67 [58], [59], og CD10 [60].
i konklusjonen, våre data gi bevis på at MAGE-C2 /CT-10 kan være en kandidat for adjuvant og palliativ vaksinasjon i en undergruppe av pasienter med avansert prostatakreft. I tillegg indikerer MAGE-C2 /CT-10 uttrykk i tidlige kreftstadier en høyere risiko for biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Differential CT10 uttrykk mellom normalt og neoplastisk vev: andelen av CT10 positivitet per vevet microarray kjernen betydelig økt fra benign prostatahyperplasi til organ begrenset prostatakreft til kastrering resistent prostatakreft og metastatisk sykdom, inkludert lymfeknute og skjelettmetastaser
. doi: 10,1371 /journal.pone.0021366.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Hele deler av CT10 positiv beinmetastaser fra to pasienter ble farget for kromogranin (CRGA) og synaptophysin, to neuroendokrine markører. Ingen koekspresjon av CT10 og nevroendokrine markører kunne påvises
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021366.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Clinicopathological egenskaper og resultatene av immunhistokjemi for pasienter som fikk radikal prostatektomi
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0021366.s003
(XLS)
bekreftelser
Forfatterne vil takke Martina Storz, Susanne Dettwiler og Silvia Behnke for utmerket teknisk assistanse.
