Abstract
Formål
Kreft forbundet stromale fibroblaster (kafeer) gjennomgå transkripsjons og fenotypiske endringer som bidrar til tumorprogresjon, men mekanismene som er ansvarlig for disse endringene er ikke godt forstått. Avvikende DNA metylering er en viktig årsak til transkripsjons endringer i kreftceller, men det er ikke kjent hvor viktig DNA metylering endringer skal CAF oppførsel.
Experimental Design
Vi brukte Affymetrix ekson arrays for å sammenligne gener indusert av DNA metylering hemmer 5-aza-dC i dyrkede bukspyttkjertelkreft assosiert fibroblaster, bukspyttkjertelen kontroll fibroblaster og bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
Resultater
Vi fant at bukspyttkjertelen kafeer og kontrollere bukspyttkjertelen fibroblaster var mindre mottakelig for 5-aza-DC-mediert genet reaktive enn kreft i bukspyttkjertelen celler (gjennomsnitt +/- SD av gener indusert ≥5 ganger var 9 ± 10 gener i 10 bukspyttkjertelen CAF kulturer, 17 ± 14 gener i tre kontroll bukspyttkjertelen fibroblast kulturer, og 134 ± 85 gener i 4 bukspyttkjertelkreft cellelinjer). Vi undersøkte forskjellig uttrykt gener mellom kafeer og kontroll fibroblaster for kandidat metylert gener og identifisert disintegrinproteinet og metalloprotease,
ADAM12
som hypomethylated og overexpressed i bukspyttkjertelen CAF linjer og overexpressed i fibroblaster i tilknytning til primær bukspyttkjertelen adenokarsinomer.
Konklusjoner
i forhold til kreft i bukspyttkjertelen celler, er det få gener aktiveres ved DNMT1 hemming i bukspyttkjertelen kafeer tyder disse cellene ikke båtplass mange funksjonelt viktige endringer i DNA metylering. Kafeer kan også være svært lydhør for terapeutisk målretting med DNA metylering hemmere
Citation. Yu J, Walter K, Omura N, Hong S-M, Young A, Li A, et al. (2012) I motsetning til kreft i bukspyttkjertelen celler i bukspyttkjertelen Associated Fibroblaster Vis Minimal Gene Induksjon etter 5-Aza-2′-Deoxycytidine. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10,1371 /journal.pone.0043456
Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA
mottatt: 10 april 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 11.09.2012
Copyright: © Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute tilskudd (CA62924 og RC2148346), og Michael Rolfe Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetiske forandringer i genuttrykk er en grunnleggende funksjon i kreftceller [1]. En av de best karakteriserte epigenetiske forandringer er DNA-metylering. DNA metylering mønstre er arvelig og blir vedlikeholdt etter celledeling hovedsakelig av DNA metyltransferase Dnmt1. Avvikende DNA hypermethylation oppstår ofte på CpG øyer i genet arrangører og er forbundet med en lukket kromatin staten og gen undertrykkelse. Betydelig bevis indikerer at avvikende hypermethylation og genet Slå av tumordempere og andre regulerende gener bidrar til utvikling av bukspyttkjertelen og andre kreftformer [2]. Avvikende hypometylering av normalt denaturert og forstummet gener har også blitt beskrevet i bukspyttkjertelen og andre kreftformer som en årsak til avvikende genet overekspresjon [3], [4].
De mekanismene som er ansvarlig for disse avvikende metylering mønstre i kreft er ikke godt forstått, men mistenkte mekanismene inkluderer overekspresjon av
DNMT1
, akkumulering av DNA metylering endringer med alder [5], [6] og miljømessige påvirkninger [7], endret aktivitet av
de novo
metylering enzymer
DNMT3a Hotell og
DNMT3b product: [8], [9], og muligens fra endret cellulær mikromiljøet som kronisk betennelse [3], [10].
ikke-neoplastiske stromale celler i svulsten mikromiljøet gjennomgå også transkripsjons og andre fenotypiske endringer i forhold til normale celler som er tenkt å bidra til tumorprogresjon. Kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom [11] og er godt kjent for sin omfattende desmoplastic stromal reaksjon som omfatter et gjennomsnitt 75% av cellene i tumormassen [12]. Det er mistanke om at stromal komponent bidrar til motstanden i bukspyttkjertel kreft til medisinsk behandling [13], og flere studier implisere forskjeller i stromal atferd med pasienten utfallet i bukspyttkjertelen og andre kreftformer [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Kreft assosiert fibroblaster (kafeer), den dominerende celletype i stromal mikromiljøet, vedta en aktivert fenotype under tumorigenesis, gjennomgår morfologiske, endres i forhold til normale fibroblaster [19] funksjonelle, og genekspresjon. Disse aktiverte kafeer er preget av α-glatt-muskel aktin (α-SMA) uttrykk [20], forbedret kontraktile og sekretorisk evne, og økt syntese av kollagen, ekstracellulære matrix proteiner [21] og vekstfaktorer inkludert epitelial vekstfaktor, platelet- avledede vekstfaktorer (PDGF), basisk fibroblast vekstfaktor, hepatocytt-vekstfaktor, og transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) [22]. Gjennom disse og andre signaler, kafeer samhandle intimt med tumorceller for å fremme deres vekst, og derfor kafeer er av betydelig interesse som et terapeutisk mål. Faktisk nylige strategier for å målrette kafeer omfatte bruk av kinase inhibitor, imatinib for å blokkere stromal PDGF-reseptorer [23], antistoffer for å blokkere vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) avledet fra både kreftceller og kafeer for å hemme tumor angiogenese [24] og bruk av glattes (SMO) hemmere å blokkere tumor stromal Hedgehog signalering og utarme stromale fibroblaster som overuttrykker pinnsvinet (Hh) reseptor Smo [25], [26], [27], [28]. At innledende forsøk med glattes hemmere i bukspyttkjertel kreft ikke viser tegn til nytte streker behovet for grunnleggende studier som undersøker stromale tumor interaksjoner. En annen potensiell fordel for målretting kreft stroma er å bedre tilgjengeligheten av legemiddel til kreft i bukspyttkjertelen celler. For eksempel medikamentet NAB-paclitaxel (Abraxane), en nanopartikkel formulering av paclitaxel, binder seg til Sparc, en stromal matriks-protein ofte sterkt uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen stroma som formidler stromale tumor interaksjoner, for derved potensielt å forbedre legemiddelavlevering til tumoren [29] , [30]. Kliniske studier med Abraxane i bukspyttkjertelkreft lovende og i dyremodeller er det bevis som tyder på at levering av gemcitabin til svulsten er forbedret med Abraxane, og med pinnsvin hemmere [25]. Effekt av gemcitabin /Abraxane legemiddelkombinasjonen fortsatt venter resultatene fra fase 3 kliniske studier.
Påvirkningen av kafeer på kreft vekst har blitt vist i mange studier [31], [32] men de molekylære mekanismene som ligger til grunn CAF fenotype er ikke godt forstått. Selv om en stor innflytelse på kafeer er mistenkt for å være svulsten mikromiljøet inkludert påvirkninger fra kreftcellene selv, kafeer beholde sine tumor-fremme egenskaper
in vitro
etter langvarig cellekultur [33], noe som tyder på at arvelige mekanismer er ansvarlig . Selv om genetiske endringer i kafeer, er blitt beskrevet, har nyere studier som undersøker den mulighet at kafeer gjennomgå klonal genetiske forandringer som ligner på kreftceller ikke funnet bevis for slike endringer [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. I fravær av utbredte genetiske mutasjoner, er det rimelig å anta at epigenetiske mekanismer som DNA metylering, som er mitotisk arvelig, er ansvarlig for stabile genuttrykk endringer i kafeer. Faktisk flere gener involvert i tumor stromal interaksjoner og indusert i kafeer etter coculture med kreftceller, for eksempel
SPARC product: [29], [30],
COX-2 Kjøpe og matrix-metalloproteinaser (MMP) [39] er regulert av DNA metylering. Videre, kafeer utsatt for den samme påvirkninger i svulsten mikromiljøet som er antatt å bidra til metylering forandringer i kreftceller, så som kronisk inflammasjon [34].
Heterogeniteten av kafeer fra forskjellige svulster, og til og med innenfor samme tumor [14], [30] antyder også at kafeer har flere kilder som kan bidra til epigenetiske forskjeller. I tillegg til aktivering av hørende fibroblaster i svulsten mikromiljøet, noe kafeer er benmarg avledet mesenchymal forløperceller [40], [41] og kanskje epiteliske eller endotelceller som gjennomgår mesenchymale overgang [21], [42]. Fordi disse differensiering og transdifferensiering prosesser er regulert av epigenetiske mekanismer [43], kafeer avledet fra ulike kilder har forskjellig epigenetisk og transkripsjons profiler i forhold til sine bosatt vev kolleger.
Bare noen få studier har begynt å utforske epigenetiske mekanismer for disse transkripsjons endringer i kafeer. En av de første studiene som gir bevis for DNA metylering forskjeller mellom normale og tumorassosierte stromale celler tok et genom-wide tilnærming ved hjelp av metylering bestemt digital karyotypering (MSDK) for å profilere epitelceller, korg celler og stromale fibroblaster under brysttumorprogresjon [35] . En annen tilnærming som kombinerer laser capture mikrodisseksjon med metylering spesifikk PCR (MSP) av kandidatgener identifisert hyppig arrangøren metylering av
GSTP1 Kjøpe og
RARB2
i prostata tumorassosierte stromale celler i forhold til normal prostata stromal celler [ ,,,0],44]. En tredje tilnærming ved hjelp av metylering følsomme SNP rekke analyse (MSNP) viste brenn gevinster i metylering og global hypometylering i magekreft-forbundet myofibroblasts [36].
En nyttig strategi for å identifisere metylering hendelser er å utføre et gen reaktive skjermen ved hjelp av DNA-metylering hemmere som 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC), som selektivt rettet mot DNMT1 enzym for tømming. Denne fremgangsmåten har fordelen av å identifisere DNA-metylering endringer som regulerer transkripsjon og derfor mer sannsynlig å være funksjonelt viktig. Selv om denne fremgangsmåte har med hell identifisert metylering hendelser i kreftceller fra flere tumortyper, [45] til vår kunnskap om denne fremgangsmåten ikke har vært brukt til å identifisere gener regulert ved metylering i kafeer. For å avgjøre om DNA metylering er like viktige regulatorer av genuttrykk endringer i kafeer som for kreft cellelinjer utførte vi et genom-wide reexpression analyse av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen-assosiert fibroblaster og bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved hjelp av 5-aza-dC.
Materialer og metoder
Culture of Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Primære kulturer av stromale fibroblaster, utpekte kreft assosiert fibroblaster (kafeer) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25, og CAF35 ble etablert fra kirurgisk reseksjon kreft i bukspyttkjertelen vev fra 13 pasienter (6 hanner gjennomsnitt ± standardavvik (SD) alder av 58 ± 7 år) med klinisk sporadisk bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom. Kreft var moderat til dårlig differensiert med en midlere tumorstørrelse på 3,5 cm. Disse primære CAF kulturer ble etablert som tidligere beskrevet [27] som var to hTERT-udødelig kontroll fibroblaster (SC2 og SC3, etablert fra kirurgisk reseksjon ikke-neoplastisk bukspyttkjertelen vev fra 2 kvinner (gjennomsnittsalder, 63 år) [27]. Den foreviget menneskelige bukspyttkjertelen nestin-uttrykke (HPNE) cellelinje ble sjenerøst gitt av Dr. Michel Ouellette (University of Nebraska Medical Center) [46]. Fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer, inkludert A32-1, Panc2.8, Panc3.014 og Panc215 etablert fra primære pankreatiske ductal adenokarsinomer ved vår institusjon og som er beskrevet tidligere [47] ble også brukt i denne studien Alle cellelinjer ble holdt i DMEM (4,5 mg /ml glukose; Invitrogen). inneholdende 10% FBS under standard betingelser, som beskrevet tidligere [48] . Alle studiene ble utført med godkjenning fra Johns Hopkins Utvalget for Clinical Investigation.
5-aza-dC behandling og RNA ekstraksjon
celler ble sådd ut i 2 x 10
5 celler per T75 kolbe og behandlet den påfølgende dagen med en mikromol /l 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC, Sigma) [49] for 4 dager i løpet av den eksponentielle vekstfase, med en endring av media og narkotika hver 24 timer. På dag 5 når cellene var nær sammenflytende, ble de vasket med kald PBS og total RNA isolert ved hjelp av en Qiagen kit (Qiagen) eller Mirvana miRNA kit (Ambion), i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [50].
Exon utvalg og valg av gener for validering
Affymetrix Genechip Menneskelig Exon 1.0ST Array plattformen ble brukt til å analysere genuttrykk mønstre i ubehandlet og 5-aza-dC behandlet fibroblaster og kreftcellelinjer, som tidligere beskrevet [27]. Vi er i samsvar med minimum informasjon om en microarray eksperiment retningslinjer og har sendt våre microarray data satt til Gene Expression Omnibus repository (GEO Tiltredelse # GSE20911).
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
1 mikrogram total RNA ble revers transkribert i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Den resulterende cDNA ble forsterket på en ABI 7300 Real-Time PCR termo hjelp SYBR GREEN PCR Master Mix og anbefalte PCR-forhold (Applied Biosystems). Housekeeping genet
GAPDH
ble brukt for normalisering. Primer spesifisitet ble bekreftet ved smelting kurve analyse. Resultatene er uttrykt som normaliserte uttrykk verdier i forhold til den indikerte cellelinje (= 2
-ΔΔCt). Alle PCR-reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Grunning sekvenser er som følger:
Stratifin
RTsense: 5′-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 «;
Stratifin
RTantisense: 5′-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 «;
TKTL1
RTsense: 5′-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 «;
TKTL1
RTantisense: 5′-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 «;
ADAM12
RTsense: 5′-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 «;
ADAM12
RTantisense: 5′-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 «;
GAPDH
RTsense: 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 «;
GAPDH
RTantisense: 5′-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 «.
Bisulfite Sekvense
metylering status av de 5′ CpG øyene kandidat gener ble bestemt av bisulfite sekvensering. Bisulfitt modifikasjon og PCR ble utført som tidligere beskrevet [51]. Bisulfite Modifiserte Sekvensering (BMS) primere var som følger:
TKTL1
BMS frem: 5′-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 «,
TKTL1
BMS omvendt: 5′-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3′, og intern sekvense primer
TKTL1
BMS-Seq: 5′-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 «;
ADAM12
BMS frem: 5′-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 «,
ADAM12
BMS omvendt: 5′-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3′, og intern sekvense primer
ADAM12
BMS-Seq : 5′-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 «. Rensede produkter ble sekvensert ved Johns Hopkins Kjerne Sequencing Facility.
Western blot analyse av DNMT1 Expression
Western blot analyse ble utført ved hjelp av lysatene fra ubehandlet eller 5-aza-DC-behandlet HPNE eller CAF12 celler. En Bradford-analysen ble brukt til å beregne proteinkonsentrasjon, ved bruk av bovint serumalbumin (BSA, Invitrogen) som en standard. Like mengder av protein (40 ug per bane) ble separert ved 4-12% gradient SDS-gel-elektroforese (Invitrogen), overført til nitrocellulosemembraner, og inkubert i blokkeringsløsning (5% melk i TBS med 0,1% Tween 20) i 30 minutter . Membraner ble inkubert i 60 minutter med en anti-DNMT1 polyklonale antistoff (sjenerøst gitt av Dr. Bill Nelson, JHU) ved 1:200 fortynning eller et monoklonalt antistoff mot GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) ved 1:2000 fortynning. Sekundære HRP-linked antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, og Amersham Biosciences) ble påført ved 1:2000 fortynning og proteiner påvises ved hjelp av ECL kit (Amersham Biosciences).
bukspyttkjertelen adenokarsinom microarray og Adam12 Immunohistochemistry
ekspresjon av Adam12 protein ble undersøkt anvendelse av immunhistokjemisk (IHC) merking av formalinfikserte, parafininnstøpte microarray (TMA) ved hjelp av en DAKO Autostainer (DAKO, Carpinteria, CA). Fire TMA inneholdende totalt 72 forskjellige kirurgisk resekterte bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer og tilsvarende normale pankreas vev ble konstruert som tidligere beskrevet [29]. Adam12 IHC-farging ble utført som tidligere beskrevet [29] med et kanin-anti-humant antistoff Adam12 (A2601, Sigma) ved en 1:100 fortynning og en 60 minutters inkuberingstid. Merkingen ble utført ved hjelp av Envision-Splus Detection Kit (DAKO).
Statistical Analysis
Beskrivende statistiske verdier og plott ble generert ved hjelp av Microsoft Excel-pakken eller Partek® Genomics Suite ™ V6.3 beta . Den robuste multichip Average (RMA) metoden ble brukt til å normalisere den rå intensitet målinger av alle probe sett. Genekspresjon verdier ble deretter oppnådd ved hjelp av en-trinns Tukey s biweight metode. Toveis ANOVA ble gjort for å identifisere vesentlige uttrykk endringer mellom ubehandlet og 5-aza-DC-behandlede fibroblaster eller kreft cellelinjer, eller mellom kafeer og kontroll fibroblaster. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
P
0,05, og verdiene rapportert er midler ± SD
Resultater
Globalt genuttrykk analyse av menneskelige bukspyttkjertelen fibroblaster og kreftcellelinjer behandles. med 5-aza-dC
Vi etablerte primære bukspyttkjertelen CAF kulturer og kontroll fibroblast kulturer som tidligere beskrevet [38]. Ved hjelp av global genekspresjon profilering, vi tidligere identifisert genekspresjon forskjeller i bukspyttkjertelen kafeer i forhold til kontroll fibroblaster [27]. Hierarkisk gruppering av genekspresjonsprofiler fra ubehandlede CAF og kontroll fibroblaster er gitt i Figur S1. Mistanke om at disse endringer i genekspresjon ble delvis medieres av forandringer i DNA-metylering, sammenlignet vi genekspresjonsprofiler fra CAF og kontroll fibroblastkulturer før og etter behandling med 5-aza-dC ved å bruke Affymetrix ekson Arrays (ST 1,0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25, og CAF35 for kafeer, HPNE, SC2, og SC3 for kontroll fibroblast celler, henholdsvis)
Vi først bekreftet 5-aza-dC uttømming. av den Dnmt1 enzymet ved Western blot. 5-aza-dC behandling av HPNE og CAF12 celler resulterte i uttømming av Dnmt1 protein ved 1 uM konsentrasjoner, men ikke GAPDH kontroll-protein (figur 1). For ytterligere å undersøke effekten av 5-aza-dc konsentrasjoner, sammenlignet vi antall gener som induseres ved 1 pM og 10 pM av 5-aza-dC i ytterligere to kafeer, CAF19 og CAF35, og fant ingen stor forskjell i antallet gener induserte mellom disse medikamentkonsentrasjoner (data ikke vist). Vi har derfor brukt 1 uM konsentrasjoner av 5-aza-dC å behandle hver CAF. Vi behandlet CAF-celler i 4 dager, da dette var tilstrekkelig varighet for celleproliferasjon. Lengre behandlinger (i 5-7 dager) resulterte ofte i kafeer vokser til konfluens (data ikke vist). I samsvar med dette, utførte vi sprednings analyser på CAF19 på ulike 5-aza-DC konsentrasjoner (0 um, en um, 5 mikrometer, 10 um, og 20 mikrometer) og funnet ut at veksten var ikke signifikant påvirket ved en mikrometer konsentrasjon vi ansatt (Figur S2).
DNMT1 protein er oppbrukt (i forhold til GAPDH) i 5-aza-dC behandlet HPNE og CAF12 celler.
Etter å sammenligne uttrykk profiler av hver CAF før og etter fem-aza-dC behandling, må vi først identifisert gener som ble oppregulert ved en samlet fold-endring gjennomsnitt ≥2.0 i alle de ti 5-aza-DC-behandlede kafeer i forhold til ubehandlede kafeer. Vi valgte en 2-fold cut-off som mer beskjedne forskjeller i RNA ble ansett som mer sannsynlig å være relatert til eksperimentell variasjon. Siden vi var interessert i å identifisere gener forstummet i kafeer hvis uttrykk ble indusert av 5-aza-fm, deretter ekskludert vi undergruppe av gener som ble uttrykt i ubehandlede kafeer. Dette kriteriet identifisert 42 kandidatgener (tabell 1).
For ytterligere å bekrefte 5-aza-dC mediert genet induksjon vi utførte QRT-PCR på genet
Stratifin plakater (14- 3-3 sigma) og
Transketolase-lignende protein 1 product: (
TKTL1
) fordi deres uttrykk er regulert av metylering i andre celletyper og ekson rekke analyse identifisert sitt uttrykk som induseres av 5- aza-dC [52] [53]. I samsvar med den ekson rekke resultat,
stratifin product: (
SFN
) mRNA nivåer var lave eller ikke målbare i alle ubehandlede fibroblaster (kafeer og kontroll fibroblaster), og økt uttrykk av
SFN
mRNA ble påvist i de fleste av de 5-aza-dC behandlede fibroblaster (fig. 2 A og B). Vi observerte nær komplett metylering av
SFN
promoter-regionen i alle kafeer ved bisulfit sekvensering (data ikke vist). Tilsvarende
TKTL1
mRNA-nivåene var upåviselig i nesten alle ubehandlede fibroblaster unntatt SC2 celler og økt ekspresjon av
TKTL1
ble påvist i de fleste av de 5-aza-dC behandlede fibroblaster (fig. 2 C). I samsvar med dette, fant vi bevis for metylering av 5 «CPGs av
TKTL1
i fibroblaster etter MSP (data ikke vist). Bisulfite sekvensering av 18 CpG områder oppstrøms av
TKTL1
transkripsjon start hotellet (Fig. 2 D) viste at alle eller de fleste CpG områder var fullt metylert i ikke-uttrykk fibroblast linjer, HPNE og SC3 og i CAF19 og CAF25 (fig. 2 E). I kontrast til
TKTL1
-expressing linje, SC2, manglet metylering av mange av disse områdene, som støtter en rolle for DNA metylering i reguleringen av
TKTL1
uttrykk. Vi har også identifisert oppregulering av
DAZL Hotell og
ANXA3 plakater (data ikke vist), gener tidligere rapportert å bli indusert av 5-aza-dC [36],
NDN
rapportert å være trykt [54], og
MT1G
, rapporteres å være metylert i andre kreftformer [55].
(A) Affymetrix ekson rekke analyse av
SFN
mRNA-ekspresjon i fem pankreas kafeer før (grønn) og etter (rød) 5-aza-dC behandling. (B) og (C) Kvantitativ RT-PCR analyse av
SFN Hotell og
TKTL1
mRNA uttrykk i forhold til
GAPDH
mRNA i bukspyttkjertelen fibroblast kulturer før (blå søyler) og etter (røde søyler) 5-aza-dC behandling. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Dataene er hjelp av tre uavhengige forsøk; barer er SD verdier. (D) Top:
TKTL1
genet struktur og distribusjon av CpG dinukleotider. Korte vertikale stolper representerer CpG nettsteder. Pilen peker transkripsjonen start stedet. Under: Bisulfite genomisk sekvensanalyse i bukspyttkjertelen kafeer og kontroll fibroblaster. Åpne sirkler representerer unmethylated CpG nettsider, heldekkende sorte sirkler metylert CpG områder, og klekket sirkler delvis denaturert CpG nettsteder. (E) Bisulfite sekvense kromatogrammene av
TKTL1
promoter i bukspyttkjertelen CAF (CAF19) og kontroll fibroblast linjer (HPNE og SC2). Piler peker cytosinrester.
Vi undersøkte RNA profiler for å finne ut om det var noen differensial svar på 5-aza-dc i kafeer i forhold til å kontrollere fibroblaster. Trettifem av de 42 gener som induseres i kafeer av 5-aza-dc (tabell 1) ble også indusert i en eller flere av styre pankreas fibroblast linjer som tyder på at få, om noen gener som er selektivt og konsistent oppregulert ved 5-aza-dC i kafeer.
DAZL
var den mest indusert genet i fire kafeer (CAF12, CAF15, CAF16, og CAF19) og var blant de ti beste genene indusert i to kafeer (CAF18 og CAF22) og en kontroll fibroblast (HPNE) ( data ikke vist). Vi utførte hierarkisk gruppering av gener som induseres av 5-aza-dC i kafeer og kontroll fibroblaster for å bestemme om det var observerbare forskjeller i den samlede mønstre av genet respons på 5-aza-dC, men det var ingen opphopning av fibroblast-klasse (figur S3). Fem av de syv kafeer gruppert sammen, de to andre kafeer clustering med kontroll fibroblaster.
Ytterligere bevis for denne mangelen av gener forstummet av DNA metylering i kafeer kommer fra å vurdere genene underexpressed i kafeer. Vi identifiserte gener som ble underexpressed med gjennomsnittlig ≥4.0 ganger i alt kafeer i forhold til bukspyttkjertelen kontroll fibroblaster (tabell S2). Spesielt var det ingen overlapping mellom denne liste av 86 underexpressed gener og gener som induseres av en middelverdi av to-ganger med 5-aza-st i kafeer (tabell 1). Disse dataene indikerer at få om noen gener konsekvent underexpressed i kafeer er brakt til taushet av DNA metylering.
Identifikasjon av kandidatgener for hypometylering analyse
Vi har tidligere identifisert 200 gener, for eksempel
Smo
, oppregulert i bukspyttkjertelen kafeer i forhold til bukspyttkjertelen kontroll fibroblaster [27]. Å identifisere kandidat hypomethylated gener i kafeer, fusjonerte vi denne listen av gener overuttrykt i bukspyttkjertelen kafeer med en liste over 581 gener indusert av ≥3.0 fold i minst én fibroblast cellelinje ved 5-aza-dC behandling. Dette kriteriet identifisert 49 kandidatgener (Tabell S1) noen som kan reguleres ved metylering, og potensielt hypomethylated i bukspyttkjertelen kafeer i forhold til kontroll fibroblaster.
5-aza-dC behandling av menneskelige bukspyttkjertelen kafeer, kontroll fibroblaster og kreft cellelinjer
neste sammenlignet svarene av kafeer og kontroll fibroblaster til 5-aza-dC med svarene fra bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Vi genererte en individuell gen liste for hver fibroblast-linje eller cellelinje, og deretter telles det totale antall gener som induseres av ≥5-fold i hver linje (figur 3). Vi deretter sammenlignet med gjennomsnittlig antall gener indusert av ≥5 ganger med 5-aza-dC i de ti kafeer, de tre kontroll fibroblast linjer, og de 4 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Signifikant færre gener ble indusert av 5-aza-st i kafeer enn i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (
P
= 0,0009). Antallet gener indusert av ≥5 ganger blant de ti kafeer var bare 9 ± 10 gener (gjennomsnitt +/- standardavvik) sammenlignet med 17 ± 14 gener indusert av ≥5 ganger i de tre bukspyttkjertelen kontroll fibroblaster og 123 ± 86 gener indusert av ≥5 ganger i de 4 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (figur 3). Det var ingen signifikant forskjell i antall gener som induseres ved ≥5.0 fold i kafeer og i pankreas kontroll fibroblaster. For å sikre at vi hadde valgt en rimelig fold-endring cutoff for sammenligning, vi også sammenlignet antall gener indusert av ≥3 ganger. Tilsvarende forskjeller ble også observert: Antall gener indusert ≥3 ganger med 5-aza-DC ble 83 ± 47 gener indusert i kontroll fibroblaster og 48 ± 42 gener indusert i kafeer og 430 ± 271 gener i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (
P
= 0,0006 for kafeer i forhold til kreftcellelinjer). Det var ingen signifikante forskjeller relatert til pasientens alder eller kjønn i antall gener indusert av 5-aza-dC.
Et gjennomsnitt på 123 ± 86 gener ble indusert fem ganger eller mer ved 5-aza-dC behandling i fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer, 9 ± 10 gener i ti bukspyttkjertelen kafeer (
P
= 0,0009) og 17 ± 14 gener i tre kontroll bukspyttkjertelen fibroblast linjer.
Differensial metylering av kandidaten hypomethylated genet ADAM12
Vår analyse av gener selektivt oppregulert ved 5-aza-st i kafeer ga ingen gener som er kjent for å være regulert av DNA metylering som påvirker stromal fibroblast atferd. Vi undersøkte også våre lister over genene forskjellig uttrykt i kafeer i forhold til å kontrollere bukspyttkjertelen fibroblaster for kandidater som påvirker tumor /stromale interaksjoner. En kandidat overexpressed i kafeer var
ADAM12
.
ADAM12 plakater (en metalloprotease disintegrinproteinet og 12), en regulator av celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger, er overuttrykt i kreft-assosiert fibroblaster, og er involvert i tumorprogresjon [56]. Vi først bekreftet oppregulering av
ADAM12
mRNA i kafeer i forhold til kontroll fibroblaster ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. I samsvar med vår ekson rekke resultat (Fig. 4a),
ADAM12
mRNA ble sterkt overuttrykt i bukspyttkjertelen kontroll fibroblast utledet fra en pankreatitt prøven (SC3) og ni kafeer i forhold til kontroll fibroblaster HPNE og SC2 (Fig. 4b).
(A) Affymetrix ekson rekke analyse av
ADAM12
mRNA uttrykk i bukspyttkjertelen kafeer og kontroll fibroblaster. (B) Kvantitativ RT-PCR analyse av
ADAM12
mRNA uttrykk i bukspyttkjertelen kafeer og kontroll fibroblaster etter normalisering til
GAPDH
nivåer. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Dataene er hjelp av tre uavhengige forsøk; barer er SD verdier.
For å finne ut om
ADAM12
ble forskjellig metylert i kafeer i forhold til å kontrollere fibroblaster, vi utførte bisulfite sekvensering av
ADAM12
genet promoter i 9 kafeer og 3 kontrollpunkt fibroblast linjer. Vi forsterket en 481-bp region oppstrøms for
ADAM12
transkripsjon start nettsted som inneholder 38 CpG områder (figur 5a). Bisulfitt-sekvensering viste at 29 av 38 (76%) CpG-områdene var fullt metylert i styre fibroblast-linje HPNE (figur 5b). Derimot, seks av ni kafeer (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, og CAF22) var helt (100%) unmethylated på alle CpG områder. De resterende kafeer var delvis metylert på 2-7 av 38 CpG sider og fullt unmethylated på alle andre CPGs (figur 5a). Styre fibroblaster SC2 og SC3 var fullt metylert ved CPGs nær 5′-enden av den sekvensert regionen og delvis denaturert ved CPGs nær 3′-enden av dette området. De var fullt unmethylated på alle andre CPGs. Dermed var det relative hypometylering på flere CPGs mellom fibroblaster som uttrykte
ADAM12 Hotell og de som ikke gjorde det, impliserer avvik hypometylering av
ADAM12
som en mekanisme for sin overekspresjon i bukspyttkjertelen kafeer i forhold til kontroll bukspyttkjertelen fibroblaster
(A) Top:.
ADAM12
genet struktur og distribusjon av CpG dinukleotider. Korte vertikale stolper representerer CpG nettsteder. Pilen peker transkripsjonen start stedet. Under: Bisulfite genomisk sekvensanalyse i bukspyttkjertelen kafeer og kontroll fibroblaster. Åpne sirkler representerer unmethylated CpG nettsider, heldekkende sorte sirkler metylert CpG områder, og klekket sirkler delvis denaturert CpG nettsteder. (B) Bisulfite sekvense kromatogrammene av
ADAM12
promoter i bukspyttkjertelen CAF (CAF19) og kontroll fibroblast linje (HPNE). Piler peker cytosinrester.
For å finne ut om Adam12 protein ble overuttrykt i stroma av primære bukspyttkjertelen adenokarsinomer, vi utført immunhistokjemi på microarray. Mens Adam12 protein uttrykk ikke ble påvist i fibroblaster rundt normal bukspyttkjertelen duct (figur 6b), kafeer av primære bukspyttkjertelen adenokarsinomer var positive for Adam12 protein uttrykk (figur 6c).
