Abstract
Novel anti-HIV-lektin familie som viser en streng bindingsspesifisitet for høyt mannoseinnhold glykaner har blitt funnet i lavere organismer. Den bakterielle orthologue er blitt identifisert i genomet til
Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og genet som koder en antatt lectin ble klonet, uttrykt i
Escherichia coli
og renset ved hjelp av ett trinn gelfiltrering. Glycan rekke screening av rekombinante lektin, betegnes PFL, har avdekket at PFL fortrinnsvis gjenkjenner høyt mannoseinnhold glykaner med α1-3 Man som var sterkt eksponert på D2 posisjon. I motsetning til maskering av denne α1-3 Mann med α1-2 Man dramatisk svekket lektin-karbohydrat interaksjoner. Redusere terminal disakkarid, GlcNAc-GlcNAc av høye mannose glykaner var også avgjørende for PFL-binding. PFL viste en potent anti-influensa-virus-aktivitet ved å hemme viruset trer i cellene ved doser på lav nanomolar konsentrasjon. Ved mikromolar konsentrasjon eller høyere, PFL viste cytotoksisitet medfølgende tap av celleadhesjon mot humane magecancerceller MKN28. Celleoverflatemolekyl hvortil PFL bundet ble ko-utfelt med biotinmerket PFL og identifisert som inte α2 av peptid masse fingerprinting ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri. Intriguingly, ved behandling med eksogen PFL, integrin α2 på celleoverflaten gjennomgikk hurtig internalisering til cytoplasma og akkumulert til perinukleært region, sammen med det bundne PFL. Den resulterende tap av celle tilslutning ville utløse en signalveien som induseres anoikis lignende celledød. Disse hendelsene ble effektivt inhibert ved forbehandling av PFL med mannnan, noe som indikerer involveringen av høyt mannoseinnhold glykaner på PFL-indusert celledød som ble utløst av PFL-integrin a2-interaksjoner
relasjon:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High Mannose-Binding Antiviral lektin PFL fra
Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaksjon med α2-Inte. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922
Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 7 mai 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Sato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) (Grant nummer 24790101). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Høye mannose-bindende lektiner som er rettet mot spesifikke glykaner på et virus overflaten er lovende potensielle virus-inaktive midler som kan brukes til forebygging og kontroll av virusinfeksjoner [1], [2]. Tallrike lektiner som spesifikt gjenkjenner høyt mannoseinnhold glykaner er funnet fra forskjellige taksonomi, inkludert bakterier, alger, planter og dyr, og noen av disse har vist seg å oppvise anti-HIV-aktivitet [3]. Vi har nylig funnet en ny anti-HIV lektin familie distribuert i lavere organismer som bakterier, cyanobakterier og marine alger [4]. De viser felles kjennetegn, for eksempel sekvens multiplikasjon av svært konservert N-terminal domene og eksklusive høy mannose oligo anerkjennelser. Noen lektiner i denne familien som cyanobacterial OAA fra
Oscillatoria agardhii product: [4] og røde alger ESA-2 fra
Eucheuma serra product: [5] har vist seg å hemme HIV oppføring i vertsceller med EF
50-årene av lav nanomolar spekter av direkte binding til konvolutten gp120. Videre, en rød alge lektin KAA-2 fra
Kappaphycus alvarezii
, som også tilhører denne familien hemmer infeksjon av ulike influensavirus stammer med EF
50-årene av lave nanomolare nivåer i en stamme-uavhengig måte, gjennom erkjennelsen av høy mannose oligosakkarid på den virale kappe glykoprotein hemagglutinin (HA) [6].
i tillegg til potent antiviral aktivitet, viser ESA-to forskjellige biologiske aktiviteter som mitogene aktivitet for mus og humane lymfocytter og
in vitro
vekstinhibering av tumorceller [7], [8]. Selv om biologiske egenskapene til denne lektin familie er blitt tydelige, egenskapene til bakterielle orthologues fra
Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og
Herpetosiphon aurantiacus
fortsatt gjenstår å avklare.
I denne studien har vi klonet orthologue lektin genet fra
P. fluorescens
Pf0-1 og kodet lektin protein (PFL) ble uttrykt i
Escherichia coli
. Funksjonell PFL ble vellykket renset i high yield og karakterisert i form av sine biologiske aktiviteter som antiviral og anti-tumor aktivitet. Som forutsagt fra intens strukturell likhet av PFL med andre medlemmer av denne familien lektin, PFL oppviste eksklusiv spesifisitet for høyt mannoseinnhold oligosakkarid og potent antiviral aktivitet mot influensavirus. Videre PFL indusert anoikis lignende celledød av magekreft celle MKN28 via interaksjon med celleoverflaten inte α2.
Materialer og metoder
Material
Stab kultur
P. fluorescens
Pf0-1 ble sjenerøst gitt av Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influensavirus og Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler ble sjenerøst gitt av Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan): De influensavirus ble dyrket i chorioallantoic væske av 10 dager gamle kylling egg. MDCK-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin. En magekreft cellelinje, MKN28 ble vennlig levert av Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japan). Cellelinjen ble holdt i RPMI-1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicillin G-natrium og 100 mg /ml streptomycin sulfat. En annen magekreft cellelinje, GCIY, ble kjøpt fra RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) og opprettholdt på samme måte som beskrevet ovenfor. Primær normal menneskelig hepatocytter celle (ACBRI 3716) ble kjøpt fra DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) og vedlikeholdes i CS-C medium kit R (DS Pharma Biomedical).
hemaqqlutinering analysen
Hemagglutineringen analysen ble utført ved bruk av en 2% (v /v) suspensjon av trypsin-behandlet kanin-erytrocytter som tidligere beskrevet [9]. I korthet, kanin innfødt erytrocytt suspensjonen ble behandlet med 0,5% trypsin i saltløsning, og blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 60 min. Etter vasking med saltløsning, ble 2% trypsin-behandlet erytrocytt suspensjon fremstilt i saltvann. Hemaggluineringsaktivitet ble uttrykt som en titer, den resiproke verdi av den høyeste to-ganger fortynning som utviser positiv hemagglutinasjon.
Gene kloning og ekspresjon av lektin PFL
Genomisk DNA fra
P. fluorescens
Pf0-1 ble brukt som en mal for genet kloning av PFL-genet. Til å begynne med en oligonukleotidprimer set, 5′-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 «og 5′-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3′, som hybridiserte med oppstrøms og nedstrøms for PFL kodende region, respektivt, ble anvendt, og PCR ble utført ved å bruke Prime STAR DNA polymerase (TAKARA). Ved hjelp av det amplifiserte PCR-fragment som et templat, ble den påfølgende PCR utført med en forover-primer, 5»-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 «, som hadde CACC ytterligere sekvens til ATG startkodonet av det PFL-genet, og en revers primer, 5»-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 «(TTA, svarende til stoppkodonet av RFL-genet). De amplifiserte fragmentene ble ligert inn i pET101 /D-TOPO ekspresjonsvektor. Den rekombinant plasmid ble forvandlet i
Escherichia coli
top10 celler (Invitrogen). De oppnådde rekombinante kloner ble bekreftet å være en korrekt konstruksjon av DNA-sekvensering. De funksjonelle kloner ble forvandlet i
Escherichia coli
BL21 Star (DE3) celler for induserbar ekspresjon av PFL-genet. IPTG til en sluttkonsentrasjon på 0,8 mM ble tilsatt til den transformerte kulturen for å indusere ekspresjon PFL. Etter 6 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene høstet ved sentrifugering ved 8000 rpm i 20 min.
Rensing av lektin PFL
De høstede bakterielle celler ble resuspendert i 20 mM fosfatbuffer ( pH 7,0) inneholdende 0,15 M NaCl (PBS) og ble avbrutt ved sonikering. Etter sentrifugering ved 8000 rpm i 20 minutter ble en aliquot av supernatanten underkastet Superose 12 kolonne (GE Healthcare) ekvilibrert med PBS. Kolonnen ble eluert med PBS ved en strømningshastighet på 0,8 ml /min ved hjelp av en isokratisk modus. Eluatet ble overvåket ved absorbsjon ved 280 nm og kontrollert for hemagglutinasjon aktivitet, og de aktive fraksjoner ble slått sammen.
Molekylvekt Bestemmelse av PFL
Molekylvekten av PFL ble bestemt ved MALDI-TOF MS-analyse med en Autoflex massespektrometer (bruker, Japan) etter kalibrering med et peptid masse standard kit (bruker, Japan) bruker sinapinic syre som en matrise.
DNA sekvensanalyse
Nukleotidsekvenser ble bestemt ved dideoksy-kjede-terminator-metoden ved hjelp av en BigDye Terminator Cycle Sequencing versjon 3.1 kit (Applied Biosystems). DNA-sekvensering ble utført ved hjelp av en ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Glycan rekke analyse
PFL var merket med Alexa Fluor 488 i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Eugene, Oregon). Glycan binding spesifisitet PFL ble bestemt av de trykte sukker mikromatriser (versjon 5.0) i henhold til standard prosedyre for CoreH av Consortium for Funksjonelle glycomics (CFG) (https://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Den gjennomsnittlige relative fluorescens i gjentak av seks ble beregnet ved gjennomsnitt fire verdier etter å ha fjernet de høyeste og laveste verdiene for å eliminere noen av de falske treff med svært høye eller lave punkter. De feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet (SEM), og% CV er variasjonskoeffisienten (SD /gjennomsnitt) beregnet som%.
Anti-Influensa aktivitet av PFL
In vitro
anti-influensaaktivitet av PFL ble bestemt ved nøytral rød (NR) fargestoff opptaksanalyse. Forskjellige konsentrasjoner av PFL ble fremstilt med DMEM inneholdende 10 ug /ml trypsin i en 96-brønns mikroplate. Til hver brønn ble det tilsatt virus som en multiplisitet av infeksjon på ca. 0,001 infeksiøse partikler pr celle. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer ble 100 pl NR fargestoff (150 ug /ml i DMEM) tilsatt og ytterligere inkubert i 2 timer. NR fargestoff inkorporert i cellene ble ekstrahert ved tilsetning av 100 ul av 1% eddiksyre /50% etanol. Brønnene ble målt ved 540 nm med en mikroplateleser (1420 multilabel teller, PerkinElmer, MA, USA) som en faktor av overlevende fra viruset cytopatisk effekt.
immunfluorescens Mikros
immunfluorescens farging var utføres for å visualisere inngangs inhibering av influensavirus ved PFL. Kort sagt ble MDCK-celler dyrket på dekkglass infisert med A /Udorn /72 ved en multiplisitet av infeksjon på ca. 0,001 infeksiøse partikler pr celle, i nærvær eller fravær av 200 nM PFL i DMEM inneholdende 10 ug /ml trypsin. Etter 24 timer etter infeksjon ble de infiserte cellene fiksert med 80% aceton i 5 minutter. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med muse-monoklonalt anti-HA-antistoff (HyTest, Turku, Finland) ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff (Anticorps Secondaires, Compiegne, Frankrike) ved 37 ° C i 1 time. Etter ytterligere PBS vasking ble cellene monteres ved hjelp av Vectashield med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og ble observert under et fluorescens-mikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan).
ELISA-analysen
direkte interaksjon av PFL med virale kappe-glykoprotein HA ble analysert ved bruk av en enzymbundet immnosorbent assay (ELISA). PFL (5 ug /ml) i karbonatbuffer (pH 9,6) ble belagt på 96-brønners ELISA-plater (BD Biosciences, Bedford, MA). Brønnene ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST) og blokkert med 3% skummet melk ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBST, varierende konsentrasjoner av influensa HA-vaksine preparat (Astellas, Tokyo, Japan) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBST, ble brønnene inkubert med mus-anti-HA-monoklonalt antistoff (HyTest) ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff (GE Healthcare, UK ) ved 37 ° C i 1 time. Deretter 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin (TMB) substrat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) ble tilsatt. Reaksjonen ble stanset ved hjelp av TMB stopp reagens (Sigma-Aldrich) og absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (1420 multilabel telleren, PerkinElmer).
tumorcelleproliferasjon ved MTS-analyse
celleproliferasjon ble kvantifisert ved en konvensjonell analyse ved bruk av MTS CellTiter 96 celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison, WI). Celler seeded på 96-brønns mikroplate ble inkubert i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av PFL i passende medium med 10% FBS. Cellene ble deretter inkubert med 20 ul av MTS-reagens i 1 time ved 37 ° C og målt med en mikroplateleser (1420 multilabel telleren, PerkinElmer) ved 490 nm. Effekten av gjær mannan på cytotoxity av PFL, ble bestemt ved å inkubere cellene med 5 uM PFL i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av gjær mannan i RPMI 1640 med 10% FBS i 72 timer, og cellenes levedyktighet ble målt som beskrevet ovenfor.
Isolering av PFL bindingsmolekyl (er) på MKN28 celle
PFL ble merket med biotin ved hjelp av biotin merkingskit (Dojindo molekyl teknologier, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. For å sammenflytende MKN28 cellene på dekkglass, biotinylert-PFL (200 ug) tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking med kald PBS ble cellene skrapet av og lysert i 800 ul av RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natriumdeoksycholat, protease inhibitor cocktail, 0,1% SDS ). Deretter ble 100 pl av biotin-avidin-kuler capture (Adar Biotech, Israel) tilsatt til cellelysat og inkubert over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Kulene ble vasket tre ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fangede proteiner på kulene ble eluert med 50 ul SDS-PAGE prøvebuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% merkaptoetanol, 0,003% bromfenol-blått) i 15 min ved 90 ° C og underkastes SDS-PAGE. Den proteinbånd som er spesifikt for PFL behandling fraksjon ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS etter in-gel spalting med trypsin. Kort sagt ble de CBB farget proteinbånd skåret ut og avfarget med 25 mM ammonium-bikarbonat inneholdende 50% acetonitril. Den reduktive alkylering ble utført med 50 mM TCEP (tris [2-karboksyetyl] fosfin) i 25 mM ammoniumbikarbonat, etterfulgt av inkubering med 50 mM iodoacetoamide i 1 time. Etter dehydrering med acetonitril, ble proteinet i gelen spaltet med 10 ul TPCK-trypsin (100 ug /ml) i 50 mM ammoniumbikarbonat. Fordøyelsen ble renset med Zip tips (Millipore, Japan) og prikket inn en MALDI mål. En ul av matriseoppløsning (α-cyano-4-hydroxycinnapic syre matrisen [Bruker, Japan] i aceton-etanol [01:02]) ble deretter tilsatt til stedet. MALDI-TOF-MS-analyse ble utført ved en Autoflex massespektrometer (Bruker, Japan) etter kalibreringen med et peptid masse standard kit (Bruker, Japan). Peptid massen finger utskrift data ble søkt av Mascot programvare (Matrix Science, Japan).
Cellular lokalisering av PFL og inte α2
MKN28 cellene ble dyrket på Dekk i en seks-brønns plate . Cellene vokser på dekk ble behandlet med 30 ug /ml Alexa488 konjugert-PFL i RPMI 1640 og inkubert i forskjellige tidsperioder. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med 80% aceton i 5 minutter. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med muse-monoklonalt anti-integrin α2 /CD49b antistoff (R Spor 2, renset PFL.
Den utledede aminosyresekvensen til PFL næret to homologe områder, som hver består av de N- og C-terminale halvdeler med 62% sekvensidentitet mellom dem. PFL utstilt høy sekvenshomologi cyanobacterial lektin OAA fra
Oscillatoria agardhii
, rød alge lektin ESA-2 fra
Eucheuma serra
, og bakteriell lectin MBHA fra
Myxococcus xanthus plakater (Fig . 2B), som utgjør en ny anti-HIV-lektin familien. Molekylmassen PFL og OAA var like, 13883,7 og 13924,1, henholdsvis, og begge lektiner var sammensatt av 132 aminosyrer. Både PFL og OAA har en felles eiendom i sin sekvens duplisering men OAA viser høyere grad av intern sekvensidentitet med 75% mellom de to gjentatte domener. I kontrast er ESA-2 og MBHA sammensatt av fire tandem gjentatte homologe områder av 67 aminosyrer. Grader av likhet av OAA, ESA-2 og MBHA med PFL i deres N-terminale deler (hver på 132 rester) av aminosyresekvensene var 62,1, 61,4, og 62,1% for identiske aminosyrer, respektivt.
(A) stoppkodon TAA er vist som en stjerne. Hvert tall representerer posisjonen til nukleotid. Sekvensen var fullstendig samme som vist i GenBank under aksesjonsnr databaser no. ABA72252. (B) Oppstilling av aminosyresekvenser av PFL og andre homologe lektiner av anti-HIV-lektin familien. Cyanobacterial lektin; OAA fra
Oscillatoria agardhii plakater (SwissProt tiltredelse ingen P84330.), Red alge lectin; ESA-2 fra
Eucheuma serra plakater (SwissProt tiltredelse ingen P84331.), Bakteriell lectin; MBHA fra
Myxococcus xanthus plakater (GenBank tiltredelse no. M13831). Identiske aminosyrer blant fire lektiner er innrammet.
Karbohydrat-bindende spesifisitet av PFL
For å bestemme karbohydratbindende spesifisitet PFL, ble sukker rekke analyse utført på Consortium for Funksjonelle glycomics ved hjelp av trykt matrise versjon 5.0. Av de 611 slags oligosakkarider som ble testet, PFL (10 ug /ml) viste eksklusiv spesifisitet for høyt mannoseinnhold typen glykaner som vist i fig. 3. Hele listen over oligosakkarid testet og resultatene kan bli funnet på Internett på (https://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).
Glycan bindende spesifisitet PFL ble bestemt av den trykte sukker mikromatriser v5.0 henhold til standard prosedyre for CoreH av Consortium for Funksjonelle glycomics. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik. RFU verdi representerer de relative fluorescensenheter. Ved sukkerrekkedata ble oppnådd med 10 pg /ml Alexa488-PFL.
PFL sterkt bundet til M6-glykan (216) og M8 glykan (212), som begge har en eksponert α1-3 mann på D2 arm, med tilsvarende nivåer av høye RFU verdier, 43471 og 40759, henholdsvis. I motsetning til maskering av denne α1-3 Mann med α1-2 Man dramatisk svekket samspillet mellom PFL og glykaner. Dette var mest tydelig ved en sammenligning av M6 glykan (216) og M7 glykan (211), hvor den ytterligere α1-2 Man at D2 arm redusert binding potens omtrent til 53%. På lignende måte ble binding potens av PFL til M9 glykan (213) ble redusert (RFU = 8535) sammenlignet med dens motstykke M8 glykan (212) som mangler D2 terminal α1-2 Man, som viser bare 21% av styrken. Interessant, fjernelse av den reduserende terminale disakkarid, GlcNAc-GlcNAc av høyt mannoseinnhold glykaner mye drastisk redusert PFL-binding. For eksempel ble det PFL bindende styrke nesten fullstendig opphevet til glykaner 316 og 317 som ikke har noen GlcNAc GlcNAc-sekvens, mens de motstykke glykaner 212 og 213, henholdsvis, oppviste mye høyere potens. Betydningen av terminal-GlcNAc GlcNAc ble ytterligere bekreftet ved sammenligning av glykaner 217 og 315, selv om graden av svekkelse av PFL-binding var begrenset. Dette lektin var blottet for monosakkarid-bindende inkludert mannose. Videre PFL interagerer ikke med Man α1-6 Man (314) og mannotriose (214), som er bestanddeler av den forgrenede del av høyt mannoseinnhold glykaner. Pentasakkarid kjernen av N-glykan (50) ble ikke anerkjent av PFL men fucosylated motstykke (485) vises svak interaksjon (RFU = 746). Disse oligosakkarid bindings profiler av PFL var tett lik de OAA, ESA-2 og KAA-2 som hører til en ny anti-HIV-lektin familie i lavere organismer [4] – [6].
Anti- influensa virus aktivitet av PFL
Anti-influensavirus aktivitet av PFL ble evaluert med to influensavirus stammer, A /Udorn /72 (H3N2) og A /Beijing /262/95 (H1N1) ved NR farveopptaks analyse. PFL effektivt hemmet cytopatisk effekt forårsaket av både influensa virusstammer, med EF
50-årene av 19,4 ± 1,5 nM, og 4,5 ± 0,4 nM (Fig. 4A). For å bekrefte at PFL hemmet den første trinn av influensavirus adgang inn i cellene, fordeling av virale antigener i infiserte celler ble observert i nærvær eller fravær av PFL ved hjelp av immunfluorescens-mikroskopi. Fig. 4B viser fordelingen av virusantigen etter 24 timer etter infeksjon med A /Udorn /72 detektert av spesifikke anti-hemagglutinin-antistoff. PFL effektivt hemmet influensavirus adgang inn i cellene, mens virus var i stand til å trenge inn i og replikere i vertscellene i fravær av PFL. En galaktose spesifikk lektin PNA fra
Arachis hypogaea
unnlatt å hemme virus inntreden i cellene. Disse resultatene tyder på nærvær av høyt mannoseinnhold glykaner på den virusoverflaten ved posisjonen kritisk for virus inntreden i celler. For å teste om PFL ville direkte binde seg til viral konvolutt glykoprotein HA, ble en ELISA-analyse utført med kommersielt tilgjengelig vaksine preparat som inneholder HA fra A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), og B /Brisbane /60/08 som en hovedkomponent. Som vist i fig. 4C, ble det observert doseavhengig binding av HA til PFL.
(A) Anti-influensaaktivitet av PFL i MDCK-celler infisert med to influensavirusstammer. Celleviabilitet etter inkubasjon i 48 timer med influensavirus i nærvær av varierende konsentrasjoner av PFL ble analysert ved anvendelse av NR fargestoff opptaksanalyse. Prosent inhibering av infeksjon er uttrykt som gjennomsnittsverdien av duplikate bestemmelser. Åpne sirkler, A /Beijing /262/95 (H1N1); lukkede sirkler, A /Udorn /72 (H3N2). (B) Hemming av influensavirus inntreden i MDCK celler ved PFL. MDCK-celler ble infisert med A /Udorn /72 (H3N2) i nærvær eller fravær av 200 nM PFL. Etter 24-timers infeksjon, ble cellene fiksert med 80% aceton i 5 minutter. Virale antigener i infiserte celler ble detektert ved det spesifikke antistoff mot virale kappe-glykoprotein (HA) og FITC-konjugert andre antistoff under et fluorescens mikroskop. Kjerner i cellene ble farget med DAPI (200 × forstørrelse). (C) Direkte binding av PFL til viral konvolutt glykoprotein HA. Interaksjon mellom PFL og virus HA ble analysert ved en ELISA. PFL ble immobilisert på en 96-brønner plate og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av en influensavaksine som inneholdt HA fra A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), og B /Brisbane /60 /08. Brønnene ble inkubert med muse-anti-HA-monoklonalt antistoff i 1 time ved 37 ° C, etterfulgt av med HRP-konjugert andre antistoff i 1 time ved 37 ° C. HRP-substrat, TMB, ble deretter tilsatt til brønnene, og absorbansen ved 450 nm ble målt. Figuren viser resultatene av et eksperiment som ble kopiert minst to ganger med samme resultat.
PFL indusert celledød av human magekreft celle MKN28
In vitro
anti-tumor effekt av PFL på magekreft celle MKN28 ble evaluert ved konvensjonell MTS-analyse. Som vist på fig. 5A (venstre panel), viste PFL en doseavhengig effekt på proliferasjonen av MKN28 celle. Ved 72 timer etter PFL-behandling, ble cellenes levedyktighet signifikant redusert ved doser på 0,5 pM eller høyere. I motsetning til dette, ved de lave doser av 0,1-0,3 uM, celleproliferasjon ble svakt stimulert. PFL-indusert celledød av MKN28 celler ble fulgt av et tap av celleadhesjon til bunnen av kulturplaten, som vist i fig. 5B hvor vrengte klynge av celler ble observert som brunaktige linjer. PFL-indusert celledød ble effektivt inhibert i nærvær av gjær mannan, et glykoprotein som bærer høyt mannoseinnhold oligosakkarider (Fig. 5A, høyre panel). Dette indikerer høy mannose glykaner på MKN28 cellene er involvere i PFL-indusert cellesignalisering som til slutt fører til celledød. I motsetning til normale menneskelige hepatocytter celler (ACBRI 3716) var relativt motstandsdyktig mot PFL behandling sammenlignet med MKN28 celler (figur 5A, venstre panel.)
(A) Cytotoksisitet av PFL på MKN28 celler (venstre panel, svart. sirkler) og effekten av gjær mannan på cytotoksisitet av PFL (høyre panel). Humane MKN28 celler ble inkubert med varierende konsentrasjoner av PFL i 72 timer. Ved slutten av inkubasjonen ble celleoverlevelsesgrad bestemmes ved MTS metoder. Cytotoksisiteten er uttrykt som prosentandel av celleoverlevelsesgrad sammenlignet med kontrollen. Figuren viser resultatene av ett eksperiment som ble replikert i det minste to ganger med lignende resultater. Effekt av gjær mannan på PFL cytotoksisitet ble bestemt etter inkubering av cellene med MKN28 5 uM PFL i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av gjær mannan i 72 timer. Som en referanse, er effekten av PFL på normale humane hepatocytter celler (ACBRI 3716) vist (venstre panel, hvite firkanter) (B) Mikroskopisk bilde av kontroll (til venstre) og PFL-behandlet (høyre) MKN28 celler. Cellene ble inkubert i 72 timer i nærvær eller fravær av 5 uM PFL og ble observert under et lys-mikroskopi.
Isolering av PFL-bindingsmolekyl (er) på human magekreftcelle MKN28
for å møte den molekylære mekanismen som PFL induserer celledød av MKN28 cellen, celleoverflatemolekyl (e) som PFL bundet ble undersøkt. Biotinylert PFL ble inkubert i 2 timer med MKN28 celler og cellene ble lysert med RIPA-buffer inneholdende 0,1% SDS. Celleoverflatemolekyl (er) som biotin-bundet PFL ble ko-utfelt med avidinbelagte kuler. Proteinene som er fanget på kulene ble deretter eluert med SDS-PAGE-prøvebuffer og analysert på SDS-PAGE (Fig. 6A). Selv om flere ikke-spesifikke bånd ble påvist, observerte vi et 150 kDa bånd som spesifikt påvist i PFL behandlede fraksjon. Dette bånd ble ytterligere underkastet in-gel fordøyelse av trypsin, etterfulgt av MALDI-TOF massespektrometrisk analyse. Det oppnådde peptid masse fingerprinting data (Fig. 6B) ble gjennomsøkt for databasen, og proteinet ble identifisert som inte α2, med sannsynlighets basert score på 57 (p 0,05).
MKN28-celler ble behandlet med biotin- PFL (200 ug) og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter lysering av cellen med RIPA-buffer inneholdende 0,1% SDS, proteiner som er bundet til biotin-PFL ble utfelt med avidinbelagte kuler. Fangede proteiner på kulene ble eluert med SDS-PAGE prøvebuffer ved inkubering i 15 minutter ved 90 ° C og underkastet SDS-PAGE (A). 150 kDa proteinbånd spesifikt eluert fra PFL fraksjon ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS etter in-gel spalting med trypsin. De peptid massen finger utskrift av data (B) ble søkt av Mascot programvare.
Cellular lokalisering av eksogent tilsatt PFL og inte α2
Den atferd av PFL selv og inte α2 på behandling med PFL ble undersøkt ved hjelp av en confocal fluorescerende mikroskop. I dette eksperimentet, fluorescent-merkede PFL (Alexa488-PFL) ble brukt til å spore PFL lokalisering. Som vist på fig.
