Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er svært aggressiv og er preget av ondartet metastaser . Omtrent 90% av pasientene dør på grunn av omfattende metastaser. Den ekstracellulære matriks (ECM) er en naturlig barriere som kan hindre cellular invasjon og metastasering. Derfor må nedbrytning av ECM finne sted for at utstrakt metastasering skal skje. En disintegrinproteinet og metalloprotease (ADAM) er et multi-domene protease som spiller en viktig rolle i tumorgenese, samt tumorutvikling, invasjon og metastase. Men det har vært noen rapporter om uttrykk og rolle Adams i SCLC. I denne studien, uttrykk og rolle Adams i SCLC spredning, ble invasjon og metastase undersøkt. Totalt 150 SCLC vevsprøver ble undersøkt ved immunhistokjemi for Adams uttrykk. ADAM-12 ble funnet å være rikelig uttrykt på 72,67% av eksemplene og andre Adams ble funnet å bli uttrykt i 10% til 40% av prøvene. ADAM-12 nivåer i serum og urin, fra 70 SCLC pasienter og 40 friske kontrollpersoner, ble også målt ved hjelp av ELISA. ADAM-12 uttrykk var betydelig høyere i SCLC pasienter enn hos friske kontroller og hos pasienter med utbredt sykdom sammenlignet med de med mer begrenset sykdom. Dempe uttrykk for ADAM-12 i H1688 celler ved bruk av spesifikke siRNA betydelig redusert cellulær proliferasjon, invasjon og metastasering. Supplere uttrykk for ADAM-12-L eller -S i H345 celler, betydelig forbedret cellulær proliferasjon, invasjon og metastasering. Dyremodeller med metastatisk SCLC utstilt også økt uttrykk av ADAM-12 sammen med forbedret invasjon og metastasering. I korte trekk, ADAM-12 er en uavhengig prognostisk faktor og diagnostisk markør, og er involvert i spredning, invasjon og metastasering av SCLC
Citation. Shao S, Li Z, Gao W, Yu G, Liu D Pan F (2014) ADAM-12 som en diagnostisk markør for spredning, migrasjon og invasjon i pasienter med småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (1): e85936. doi: 10,1371 /journal.pone.0085936
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan
mottatt: 20 september 2013; Godkjent: 03.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Shao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81302017). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er den mest ondartede av alle lungekrefttilfellene. De fem års overlevelse er bare 3-8% på grunn av den utbredte metastaser i løpet av tidlig stadium og tilbakefall som oppstår når motstand mot behandlinger utvikler [1]. Tidligere har nedbrytning av ekstracellulær matriks (ECM) vært hovedfokus for studier på invasjon og metastasering av SCLC [2], [3]. Matriksmetalloproteinaser (MMP) er påvist i SCLC, og høy uttrykk nivåer av MMP-11 og -14 har blitt identifisert som uavhengige negative prognostiske faktorer i SCLC [4]. Inhibitorer av MMP har blitt brukt klinisk for SCLC pasienter, men viste seg å være ineffektiv og ble ikke bedre av fem-års overlevelse for pasientene [5]. Dette tyder på at nedbrytningen av ECM er en kompleks prosess og det proteaser, annet enn MMPs, bør studeres for å bestemme om andre faktorer spiller en rolle i SCLC.
A disintegrinproteinet og metalloprotease (ADAM) hører til proteasen familie. Adams kan forringe ECM og kaster den membranbundne forløpere som modulerer celle-celle og celle-matriks-interaksjoner [6]. Adams er delt inn i to grupper: membran forankret ADAM og utskilles typen ADAM. Utskilt typen ADAM inneholder thrombospondin motiver og er også kalt A disintegrin og metallprotease med thrombospondin Motiver (ADAMTS). Adams og ADAMTS kan degradere ECM og kaster forløpere, og dermed fremme invasjon og metastasering. Økt uttrykk av Adams og ADAMTS er påvist i en rekke svulster. ADAM-8, -12, -15 og -28 er høyt uttrykt i ikke-småcellet lungekreft [7], [8], [9], [10], ADAM-9, -12, -17 og -23 er sterkt uttrykt i brystkreft [11], [12], [13], [14] og ADAM-9, -12 og -17 er sterkt uttrykt i leverkreft [15], [16], [17]. ADAMTS4 og ADAMTS5 har blitt rapportert å være involvert i metastatisk prosessen ved å spalte brevican i glioblastomas [18]. Interessant nok var i full-lengde ADAMTS1 funnet å fremme invasjon og metastase ved å belyse heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HB-EGF) og amfiregulin, men ADAMTS1-fragmentet viste en anti-metastatisk funksjon [19]. SCLC er en sterkt aggressiv svulst. Omtrent 90% av pasientene dør som et resultat av omfattende metastasering. Derfor er det viktig at en diagnostisk markør identifiseres, og en prognostisk faktor bli vurdert for SCLC pasienter. For tiden er det ingen effektiv diagnostisk markør for SCLC. Det har vært få studier som undersøker hvilken rolle Adams uttrykk i SCLC, med unntak av ADAM-15 [8]. Basert på den potensielle betydningen av den rollen Adams i å fremme spredning, metastase og angiogenese, rettet vi å vurdere uttrykket nivåer av Adams og deres forhold til klinisk prognose i SCLC for å identifisere en effektiv diagnostisk markør.
i denne studien fant vi at uttrykket av ADAM-12 var høyere i SCLC enn andre Adams via immunhistokjemi (IHC). Univariat og multivariat overlevelse analyse indikerte at ADAM-12 var en uavhengig prognostisk faktor for SCLC pasienter. Ekspresjonsnivået av ADAM-12 i serum og urin var høyere i SCLC pasienter sammenlignet med friske kontroller, så vel som i pasienter med omfattende sykdom sammenlignet med de med begrenset sykdom. Dyremodeller som viser høy metastasering av SCLC hadde også økt uttrykk av ADAM-12 og forbedret invasjon og metastasering. Våre resultater støtter konklusjonen om at svært present ADAM-12 som en uavhengig prognose faktor og diagnostisk markør var involvert i spredning, invasjon og metastasering hos pasienter med SCLC.
Materialer og Metoder
Pasienter og celle linjer
formalinfiksert tumor vevsprøver fra 150 pasienter som lider av SCLC ble hentet fra Binzhou Medical University Hospital, Kina, mellom januar 2008 og desember 2011. av de vevsprøver, 140 ble oppnådd via biopsi og 10 ble oppnådd under operasjonen. Grunnleggende pasientopplysninger ble hentet fra pasientjournaler og er vist i tabell 1.
Fersk serum og urinprøver ble tatt fra 70 pasienter med SCLC fra onkologi avdeling i Binzhou Medical University Hospital, Kina (48 hanner og 22 kvinner med en gjennomsnittsalder på 52,3 ± 11,3 år). Totalt 45 pasienter hadde omfattende sykdom defineres som sykdom som har spredt seg til den kontralaterale lunge eller som har fjernmetastaser) og 25 pasienter hadde begrenset sykdom defineres som sykdom som er begrenset til en lunge, mediastinum, og /eller de regionale lymfeknuter . Alle pasienter frivillig signerte informert samtykke. Alle pasientene ble diagnostisert med SCLC av patologiske biopsiprøver og hadde gjennomgått kjemoterapi og strålebehandling. Totalt 40 friske frivillige (20 menn og 20 kvinner med en gjennomsnittsalder på 38,7 ± 12,1 år) ble også undersøkt. Friske kontroller hadde ingen unormale endringer i blod, lever, hjerte, lunge eller nyre funksjoner. Denne studien ble godkjent av Medical Ethics Committee of Binzhou Medical University, Kina (Permit Number: BY2010008).
Menneskelig SCLC cellelinjer, inkludert H1688, H446 og H345, ble kjøpt fra Shanghai Cell Library of kinesisk Academy of Science. Celler ble dyrket i 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
Immunhistokjemi
parafininnstøpte prøver ble avvokset i dimetylbenzen og hydrert i gradient alkohol. Snittene ble behandlet i henhold til de følgende protokoller: Endogen peroksidase fjernet (inkubasjon i 3% H
2o
2 i 30 min), antigen hentet (ca. 95 ° C i 45 min), blokkering med 10% geiteserum (ved romtemperatur i 30 min), primært antistoff inkubering over natten ved 4 ° C, HRP-konjugert sekundært antistoff inkubering i 30 minutter ved 37 ° C, DAB fargereaksjon, hematoxylin flekker, differensiering, dehydrering og gjennomsiktighet. Fortynning av primære antistoffer var 01:50 for ADAM-8, ADAM-10, ADAM-11 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 1:200 for ADAM-12 (Abgent, Suzhou, Kina), ADAM- 15 og ADAM-17 (R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). To patologer som var blindet for den kliniske diagnose utført flekker score. I tilfelle av et omstridt resultat ble enighet ved diskusjon. En semi-kvantitativ scoring system ble brukt til karakteren prøvene i henhold til prosentandelen av positiv farging: grad 0 (negativ), klasse 1 (svakt positiv, positiv uttrykk var mindre enn 10%), klasse 2 (moderat positiv, positiv uttrykk var mellom 10% og 60%) og klasse 3 (sterk positiv, positiv uttrykk var større enn 60%) [20].
ELISA
Serum og den første urinen av dagen (midten stream) ble oppnådd fra pasienter med SCLC, sentrifugert (1000 g, 30 min) for å samle supernatanten og lagres ved -80 ° C [21]. Serum og urin nivåer av ADAM-12 ble målt ved anvendelse av en ADAM-12-spesifikke ELISA-sett (R
F: 5′-TCCTGTGTCTTCTTGCTGCC-3 «, etter
R: 5′-GCGCACACACCTTAGTTTTTC-3′ for ADAM-12-L;
F: 5′-CCACCCATTCCATCTCCATC-3 «
R: 5′-TTCTGCAAACCCTCAAACC-3’for ADAM-12-S
F: 5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3 «
R: 5’CGCGGCGATATCATCATCCA-3′ for beta-aktin.
Western blotting
Celler ble lysert med SDS lysebuffer som inneholder en proteasehemmer blanding. De kvantitative proteinene ble separert ved SDS-PAGE elektroforese og proteinene ble overført på NC-medlemmer. Medlemmet ble blokkert med 5% fettfri melk for 1 time med svak risting og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C (1:500 for ADAM-12, Abgent, Suzhou, Kina, 1: 3000 for beta-aktin, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), deretter inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 40 minutter ved romtemperatur. Immunoblotanalyse band ble visualisert ved hjelp av ECL-system (Millipore, Billerica, MA, USA) og X-ray film.
Transwell eksperimenter
Transwell eksperimenter ble utført i henhold til produsentens guide (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Matrigel ble fortynnet med media fri serum (1: 2). Et volum på 60 pl gel ble sådd ut i det øvre kammer og størknet ved inkubering ved 37 ° C i 3 timer. 1 x 10
4-celler ble platet inn i kammeret, filtreres inn i det nedre kammer og føres inn i serum. Da cellene ble farget med Giemsa Dye, og antallet celler i 3 felt ble regnet under et lysmikroskop.
Cell syklus analyse
Celler ble sultet i 24 timer ved serum trekning. H1688 og H345 celler ble behandlet. Celler ble oppsamlet, fiksert og inkubert med RNase A (Thermo Scientific) i 30 minutter ved 4 ° C. Deretter ble cellene deretter inkubert med propidiumjodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 30 minutter. DNA-innhold ble detektert via flowcytometri [23].
Dyreforsøk
H1688-celler (en klassisk småcellet lungecancer cellelinje) ble dyrket i 1640 medium og 10
6 celler var administrert subkutant i nakne mus. Tumorstørrelsen ble overvåket hver uke. Når tumordiameter nådde omtrent 1 cm, ble musene avlivet under bedøvelse og tumorer ble skåret ut. Skåret svulster (kalt foreldre celler) ble halvert. Den ene halvdelen ble lagret ved -80 ° C, og den andre ble kuttet i biter, spaltet (0,25% trypsin inkubering i 15 minutter) og filtrert. Filtrerte celler ble dyrket på nytt i normal medium. Tre dager senere ble cellene injisert i immunodefekte mus via halevenen. Ti uker senere ble musene avlivet under bedøvelse. Av de 10 mus som ble injisert, 5 mus hadde synlige svulster (diameter 0,5 cm) i magen lunge og lever og de andre 5 mus hadde ingen synlige svulster. Sammenlignet med tumorer som følge av subkutan injeksjon, tumorer som oppstår ved haleveneinjeksjon hadde høyere nivåer av infiltrering og invasjon [24]. Således, et høyt metastatisk dyremodell simulere tumormetastase hos pasienter som ble vellykket utført. The Medical Ethics Committee of Binzhou Medical University godkjent denne studien (Permit Number: BY2013001).
Statistisk analyse
Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 17.0 programvare. Kaplan-Meier metoden og log-rank test ble brukt for å vurdere univariate overlevelse. Cox regresjon ble brukt for å utføre multivariabel overlevelsesanalyse. En mottaker som opererer egenskaper (ROC) kurve analyse ble utført for å vurdere cut-off for serum og urinnivåer ADAM-12 hos pasienter med SCLC og friske frivillige. Arealet under kurven (AUC) og p-verdier ble evaluert. Uttrykket forskjeller mellom ulike grupper ble analysert ved hjelp av paret
t
test.
P
0,05
ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Uttrykket av Adams i SCLC prøver ved IHC
uttrykk for ADAM-8,. – 10, -11, -12, -15 og -17 ble evaluert ved IHC i 150 SCLC prøver. Nivået på positive uttrykk (score av karakterene 2 og 3) av ADAM-8, -10, -11, -15 og -17 var 31,33% (47/150), 34,66% (52/150), 19,33% (29 /150), henholdsvis 39,33% (59/150) og 10% (15/150), (fig S1). Den positive uttrykk for ADAM-12 var den høyeste på 72,67% (109/150) og den sterke positive uttrykk (grad 3) av ADAM-12 var betydelig større sammenlignet med den andre Adams (
P
0,001 ). Som vist i figur 1, har vi funnet at ADAM-12 ble uttrykt i SCLC og ble lokalisert i cytoplasma, men ikke kjernen. HE farging indikerte at svulsten vevstype hadde typiske SCLC clinicopathological egenskaper (større kjerner og nesten ingen cytoplasma). Vevsprøver som ble inkubert over natten med PBS, i stedet for primært antistoff, ble brukt som negative kontroller. ADAM-12 ble uttrykt betydelig mer i SCLC vevsprøver sammenlignet med ekspresjon av andre Adams (
P
0,001) som indikerer at ADAM-12 kan spille en viktig rolle i prosessen med spredning, invasjon og metastase i SCLC.
ADAM-12 ble påvist i småcellet lungekreft vev ved immunhistokjemi flekker. Fortynningsforholdet av primært antistoff, var 1: 200 for ADAM-12. (A) Normal lungevev; (B) HE farging i SCLC vev; (C) Negativ kontroll (inkubert med PBS i stedet for primært antistoff over natten ved 4 ° C); (D) Farging for ADAM-12 i SCLC vev.
ADAM-12 er en uavhengig prognostisk faktor i SCLC pasienter
Siden ADAM-12 var høyt uttrykt i SCLC, vi undersøkt forholdet mellom ADAM-12 og sykdomsprognosen. Alle pasientene hadde akseptert systemisk terapi og 15 av 150 pasienter var fortsatt i live i januar 2013 (påmeldingsfristens utløp av studien). Gjennomsnittlig overlevelse for pasientene var 12,59 måneder og to års overlevelse var 16%. I henhold til IHC fargeresultater, ble de med karakterer 0 og 1 anses for å være i den negative gruppe og de med karakterene 2 og 3 ble ansett å være i den positive gruppe. Univariat overlevelse analyse viste at de betydelige kliniske faktorer som påvirket overlevelse var omfattende sykdom (
P
0,001). Verken røyking (
P
= 0,882), kjønn (
P
= 0,396) var en betydelig prognostisk faktor og heller ikke var nivåene av ADAM-8 (
P
= 0,903), ADAM-10 (
P
= 0,075), ADAM-11 (
P
= 0,317), ADAM-15 (
P
= 0,349) eller ADAM-17 (
P
= 0,427). Men ADAM-12 (
P
= 0,022) var en betydelig negativ prognostisk faktor (figur 2). Multivariat overlevelsesanalyse ble utført for å vurdere den prognostiske påvirkning av forskjellige faktorer. Resultatene var i overensstemmelse med den univariate overlevelsesanalyse. Klinisk stadium (
P
= 0,001, HR = 2,003, 95% KI: 1,330 til 3,015) og nivå av ADAM-12 uttrykk (
P
= 0,049, HR = 0,443, 95% KI : 0,197 til 0,995) var signifikante uavhengige prognostiske faktorer (tabell 2) og ADAM-12 ble nært knyttet til klinisk stadium (
P
0,001). Kliniske kjennetegn ved pasienter som var positive for ADAM-12 ble sammenlignet med de som var negative for ADAM-12 for ytterligere å klargjøre rollen som ADAM-12 som en selvstendig prognostisk faktor i SCLC. Resultatene viste at patologisk stadium var statistisk signifikant (
P
= 0,037), mens andre faktorer som alder ( 65 i forhold til ≥ 65,
P
= 0,325), kjønn (
P
= 0,975), røyking (
P
= 0,743) og tumorstørrelse (
P
= 0,511) var ikke signifikant.
Pasient overlevelse ble oppnås ved oppfølging. Univariat overlevelse analyse ble utført for å vurdere hvorvidt ADAM-8, -10, -11, -12, -15 og -17 kan anses som uavhengige prognostiske faktorer. Resultatet viste ADAM-12 å være en uavhengig og negativ faktor (
P
= 0,022).
serum og urin ADAM-12 nivåer i SCLC pasienter
IHC-farging viste ADAM-12 å være sterkt uttrykt i slim sekreter, med unntak av SCLC-celler (Figur 3A). Vi deretter utledet at ADAM-12 ble sannsynlig utskilt i blodet og utskilles gjennom urinen. Dermed har vi undersøkt nivåene av ADAM-12 i serum og urin av SCLC pasienter. Serum og urin fra 70 SCLC pasienter og 40 friske frivillige ble oppsamlet, sentrifugert og lagret ved -80 ° C. En Elisa kit ble brukt til å oppdage uttrykk for ADAM-12. ROC-kurver gir en høyere AUC av 0,899 (
P
0,001, 95% KI: 0,842 til 0,956) for 346 pg /ml i serum ADAM-12 nivå fra SCLC pasienter (figur 3B) enn normale kontroller (en AUC på 0,847 for 105 pg /ml), og en høyere AUC av 0,979 (
P
0,001, 95% KI: 0,959 til 0,999) for 258 pg /ml i urin ADAM-12 nivå fra SCLC pasienter (figur 3C) enn normale kontroller (en AUC fra 0,869 til 92 pg /ml). Serumet ADAM-12 nivået var signifikant høyere hos SCLC pasienter enn hos friske frivillige (502 ± 234
vs
180 ± 92 pg /ml,
P
0,001) og hos pasienter med omfattende sykdom sammenlignet med de med begrenset sykdom (586 ± 205
vs
317 ± 185 pg /ml) (Figur 3D). Urinen ADAM 12 nivå var i overensstemmelse med serum nivå og var høyere hos SCLC pasienter enn hos friske frivillige (404 ± 247
vs
128 ± 50 pg /ml) og hos pasienter med utbredt sykdom sammenlignet med pasienter med begrenset sykdom (477 ± 201
vs
303 ± 152 pg /ml) (Figur 3E). Dette indikerer at Adam-12-nivåer i serum og urin er korrelert med SCLC progresjon og at ADAM-12 kan anses for å være en diagnostisk markør for SCLC sykdommen siden ekspresjon av ADAM-12 økte med utvikling og progresjon av sykdom.
(A) Adam-12-farging var sterkt positive i slim sekreter (regionen er indikert med pil). (B, C) En ROC-kurve ble utført for å vurdere cut-off for pasienter med SCLC og friske frivillige; ROC = mottaker operasjonelle egenskaper. (D, E) Uttrykket nivåer av ADAM-12 i serum og urin fra SCLC pasienter og friske kontrollpersoner ble oppdaget ved hjelp av en ELISA kit. **
P
0,01, SCLC pasienter
vs
normale kontroller, SCLC pasienter med utbredt sykdom
vs
begrenset sykdom
ADAM-12 berørte metastasering og spredning i H1688 celler
Som vist fig. 1, 2 og 3, ADAM-12 er en selvstendig prognostisk faktor som kan være nyttig som en diagnostisk markør i SCLC. Vi deretter utforsket rollen som ADAM-12 i spredning, invasjon og metastasering i SCLC. Først, vi har oppdaget uttrykk for ADAM-12 i SCLC cellelinjer (H1688, H446 og H345) og funnet ut at ADAM-12 ble mer høyt uttrykt i H1688 og H446 celler sammenlignet med H345 cellelinje (Figur 4A). I en studie på brystkreft, ble ADAM-12 rapportert å ha to transkripsjons former (membran-forankret ADAM-12-L og utskilt typen ADAM-12-S) som spiller forskjellige roller [22]. På grunn av sekvenslikhet, kan forskjellige sirnas den målrettede ADAM-12-L og Adam-12-S, henholdsvis ikke utformes slik siRNA ble brukt til å målrette ADAM-12. Ekspresjonen av ADAM-12 ble signifikant redusert i den spesifikke siRNA-gruppen sammenlignet med den ubehandlede og egge siRNA grupper (Figur 4B). Når det var forstyrrelser for ekspresjon av ADAM-12 i H1688-celler, ble cellene indusert av serum filtrering av kammeret membranen betydelig redusert (figur 4C) og cellesyklus ble arrestert i G0-G1 fase (figur 4D). Roy
et al
rapportert at ADAM-12-L forfremmet cellulær proliferasjon og at ADAM-12-S fremmet cellulær migrasjon i brystkreft [22]. I vår forskning, ble cellulær proliferasjon og migrasjon betydelig hemmet etter stanse uttrykk for ADAM-12 ved spesifikk siRNA i H1688 cellelinje, som viser at ADAM-12 er assosiert med mobilnettet spredning, invasjon og metastasering. For å klargjøre rollene til ADAM-12-L og -S i cellulær proliferasjon og migrasjon, ble et eksperiment designet og utført som beskrevet nedenfor.
(A) uttrykk for ADAM-12 var høyere i H1688 og H446 celler sammenlignet med H345-celler ved Western blotting. (B) mRNA og protein uttrykk for ADAM-12 ble betydelig redusert når ADAM-12 uttrykk ble brakt til taushet av en bestemt siRNA rettet mot ADAM-12 (ADAM-12i) sammenlignet med ubehandlet (Mock) og egge siRNA (NCI) i H1688 celler , **
P
0,01. (C) Cellene indusert av serum filtreringskammeret membran ble betydelig redusert i ADAM-12i gruppen sammenlignet med modell og NCI grupper i H1688 celler, **
P
0,01. (D) cellesyklusen ble betydelig arrestert i G0-G1 fase i ADAM-12i gruppe. Mock: ubehandlede celler; NCI: cellene ble behandlet med egge siRNA. ADAM-12i. Cellene ble behandlet med siRNA rettet mot ADAM-12
ADAM-12-L fremmer spredning og ADAM-12-S fremmer invasjon
Som vist figur 4, når ADAM-12 uttrykk ble stille, ble cellulær proliferasjon og migrasjon vesentlig hemmet i H1688 celler. ADAM-12 uttrykk var lavere i H345 celler sammenlignet med H1688 og H446 celler (figur 3A). H345-celler ble deretter transient transfektert med ekspresjonsvektoren Adam-12-L (H345-L) eller -S (H345-S). Transfeksjonseffektiviteten ble vurdert ved sanntids-PCR, siden det ikke var noen spesifikke antistoff rettet mot ADAM-12-L eller -S. MRNA uttrykk for ADAM-12-L og -S ble betydelig økt etter transfeksjon (figur 5A). Det var ingen signifikant forskjell mellom H345-L-celler indusert ved filtrering gjennom kammeret membranen og uekte (normal kontroll) eller negative kontroller (pcDNA3.1). Imidlertid ble de motstridende resultater i H345-S-celler. Etter å transfektere med ADAM-12-S ble H345-celler indusert av serum filtrering gjennom kammeret membranen betydelig økt, noe som indikerer at Adam-12-S, ikke ADAM-12-L, spiller en viktig rolle i SCLC invasjon og metastasering (figur 5B ). I mellomtiden, cellesyklus analyse viste at H345-L-celler inngått S faser, men at H345-S-celler var ikke signifikant forskjellig sammenlignet med negative kontrollceller (figur 5C). Dette indikerte at ADAM-12-L kan fremme celleproliferasjon og ADAM-12-S kan fremme celle invasjon og metastasering, som er konsistent med Roopali resultat [22].
(a) mRNA uttrykk for ADAM- 12-L og -S ble påvist ved sanntids-PCR i H345-celler transfektert med ekspresjonsvektoren Adam-12-L og -S, **
P
0,01. Mock: ubehandlet gruppe; pcDNA3.1: negativ gruppe. 12-L: tilført med pcDNA3.1-ADAM-12-L; 12-S: tilført med pcDNA3.1-ADAM-12-S. (B) De celler indusert av filtreringskammeret membranen var ikke signifikant forskjellige i H345-celler transfektert med pcDNA3.1-ADAM-12-L (kalt H345-L), men cellene var signifikant økt i H345-celler transfektert med pcDNA3. 1-ADAM-12-S (kalt H345-S), *
P
0,05. (C) Adam-12-L-celler indusert til å gå fra den G0-G1 fase inn i S-fasen, men ADAM-12-S hadde ingen innvirkning på cellulær proliferasjon i H345-celler.
Ekspresjon av ADAM-12 ble økt når tumorinvasjon og metastase ble forsterket
Tidligere forskning [22] hadde rapportert at ADAM-12-L forfremmet celleproliferasjon og ADAM-12-S fremmet celle invasjon og metastasering i en dyremodell; vi bekreftet denne konklusjonen på cellenivå. Imidlertid har det ikke vært noen rapporter om hvorvidt uttrykk for ADAM-12 er økt når tumorinvasjon og metastasering er forbedret. Som vist i figur 3, ble serum og urin ADAM-12 nivåer signifikant økt i pasienter med omfattende sykdom sammenlignet med de med begrenset sykdom, noe som tyder på at ekspresjon av ADAM-12 blir øket med utviklingen av sykdommen. For å bekrefte denne konklusjonen, ble den svært metastatiske dyremodell som simulerer tumormetastase konstruert som beskrevet i fremgangsmåtene (figur 6A). Det var en større forandring i morfologien av de metastatiske celler sammenlignet med foreldreceller fra denne modellen. Metastatisk cellestørrelse var mindre, cytoplasma flekken ble shoaled, ble den kjernefysiske flekken dypere, celletettheten tynnet og cellen kompakte svekket (figur 6B). Uttrykket av ADAM-12 ble påvist i foreldre og metastatiske celler. MRNA uttrykk for ADAM-12-L var ikke annerledes mellom foreldre og metastatiske celler, men ADAM-12-S mRNA var betydelig høyere i metastatiske celler (figur 6C). Dette indikerer at Adam-12-S, ikke ADAM-12-L, spiller en viktig rolle i invasjon og metastase. ADAM-12 protein ble oppdaget av IHC og Western blot. Resultatet viste at ADAM-12 var åpenbart mer i metastatiske celler sammenlignet med parentale celler (figur 6D).
(A) Et sterkt metastatisk dyremodell ble konstruert, 1 x 10
6-celler ble administrert subkutant og de subkutane svulster (foreldre celler) ble injisert inn i nakne mus via halevenen til å danne metastatiske svulster (metastatiske celler). ble observert (B) Morfologiske forskjeller mellom foreldre celler og metastatiske celler via hematoxylin og eosin (HE) farging. Sammenlignet med foreldre celler, metastatiske celler var mindre, hadde shoaled cytoplasma flekker, dypere nukleær farging, tynnere celletetthet og svakere celle kompakt. (C) Det var ingen forskjell i ADAM-12-L mRNA uttrykk mellom foreldre og metastatiske celler, men ADAM-12-S mRNA var betydelig høyere i metastatiske celler, *
P
0,05. (D) ADAM-12 protein ekspresjon ble betydelig økt i metastatiske celler ved IHC og western blotting. P1-P5 viser de fem subkutane svulster og M1-M5 viser de fem metastatiske svulster.
Diskusjoner
Det er mer enn 30 Adams som tilhører metalloproteinase familien. De kommuniserer med integriner for å formidle celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-interaksjoner [25], felle et stort antall transmembrane proteiner, degraderer ECM og aktivere Notch og EGFR-trasé for å fremme celleproliferasjon, invasjon og metastase [6].
hoved~~POS=TRUNC i SCLC er rask vekst og omfattende metastase i tidlig stadium. I dag finnes det ingen effektiv diagnostisk markør for å hjelpe til ved diagnostisering av SCLC, spesielt under den tidlige fasen. Denne studien er designet for å vurdere uttrykk for Adams i SCLC og for å finne en nyttig diagnostisk markør. Frem til nå hadde bare uttrykk for ADAM-15 blitt oppdaget og uttrykk for andre Adams hadde vært bare seldomly rapportert i SCLC [8]. I vår forskning, vi har oppdaget ADAM-8, -10, -11, -12 og -17, og funnet ut at ADAM-12 ble mer høyt uttrykt sammenlignet med andre Adams i SCLC kliniske prøver.
ADAM-12 er sterkt uttrykt i en rekke kreftformer, inkludert brystkreft, [12], [14], [26], leverkreft [16], magekreft [26], [27], tykktarmskreft [26] og nervesystemet kreft [28]. I denne studien, univariat og multivariat overlevelse analyse indikerte at ADAM-12 er sannsynligvis en uavhengig prognostisk faktor indikerer dårligere overlevelse hos pasienter med SCLC. Selv om ADAM-12 er overuttrykt i mange tumorer, har ADAM-12 som en spesifikk diagnostisk markør bare blitt brukt for brystkreft [22].
