Abstract
Melanom antigen A (MAGE-A) proteiner utgjør et strukturelt og biokjemisk lignende sub-familien av kreft /testikkel antigener som kommer til uttrykk i mange krefttyper og er tenkt å bidra aktivt til malignitet. MAGE-A proteiner er etablert regulatorer av visse kreftassosierte transkripsjonsfaktorer, inkludert p53, og er aktivatorer av flere ringfingeren avhengig ubiquitin E3 ligaser. Her viser vi at MAGE-A2 forbinder med MDM2, et ubiquitin E3 ligase som formidler ubiquitylation på mer enn 20 underlag, inkludert hovedsakelig p53, MDM2 seg selv, og MDM4, en potent p53 inhibitor og MDM2 partner som er strukturelt beslektet med MDM2. Vi finner at MAGE-A2 samhandler med MDM2 via N-terminal p53-bindende lommen og ringfingeren domenet til MDM2 som er nødvendig for homo /hetero-dimerisering og for E2 ligase samhandling. I samsvar med disse dataene, viser vi at MAGE-A2 er en potent hemmer av E3 ubiquitin ligase aktivitet MDM2, men det har ikke noen vesentlig effekt på p53 omsetning formidlet av MDM2. Påfallende, men fører økt MAGE-A2 uttrykk reduserte ubiquitylation og økte nivåer av MDM4. Tilsvarende stanse av endogen MAGE-A uttrykk avtar MDM4 nivåer på en måte som kan bli reddet av proteasomal inhibitor, bortezomid, og tillatelser økt MDM2 /MDM4 forening. Disse data tyder på at MAGE-A-proteiner kan: (i) å frakople de ubiquitin ligase og nedbrytnings funksjoner av MDM2; (Ii) virker som potente inhibitorer av E3-ligase funksjon; og (iii) regulerer omsetningen av MDM4. Vi finner også en sammenheng mellom tilstedeværelsen av MAGE-A og økt MDM4 nivåer i primær brystkreft, noe som tyder på at MAGE-A avhengig styring av MDM4 nivåer har relevans for kreft klinisk
Citation. Marcar L, Ihrig B, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR, Jordan LB, et al. (2015) MAGE-A Cancer /testikler antigener Hemme MDM2 Ubiquitylation Funksjon og fremme økt nivåer av MDM4. PLoS ONE 10 (5): e0127713. doi: 10,1371 /journal.pone.0127713
Academic Redaktør: Chunhong Yan, Georgia Regents University, USA
mottatt: 22. januar 2015. Godkjent: 17 april 2015; Publisert: 22 mai 2015
Copyright: © 2015 Marcar et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudd tall: 2008NovPR32 og 2001NovPhD07, URL: https://www.breastcancercampaign.org. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
melanom assosierte antigener (MAGE) ble først oppdaget som kreftassosierte antigener i melanompasienter [1], og er nå kjent for å bestå av en super-familien (som omfatter flere underfamilier) på mer enn 60 gener i mennesker [2,3]. Mages er delt inn i to grupper, MAGE-I og MAGE-II, basert på kromosomale plassering av genene og vevsfordeling av deres produkter [2,3]. MAGE-I-proteiner (omfattende sub-familier MAGE-A, -B og -C) er medlemmer av den større familie av kreft /testikkel (CT) antigener som er fysiologisk uttrykt hovedsakelig i bakterieceller, men blir avvikende uttrykt, hovedsakelig gjennom epigenetisk omprogrammering, i et bredt spekter av cancere inkludert de fra bryst, ovarie, lunge, blære og [3,4,5,6]. MAGE-II-proteiner blir mer utbredt uttrykt og er vanligvis ikke forbundet med kreft.
Medlemmer av MAGE-A underfamilien viser slående strukturell og funksjonell likhet til hverandre [3]. Uttrykk for MAGE-A er observert hovedsakelig hos kreftformer som har fått ondartet fenotyper som invasivitet eller metastaser, og korrelerer med dårlig prognose [3]. Merkelig nok, MAGE-A-gener blir ofte co-uttrykte, med de fleste kreftformer som viser nærvær av minst to eller flere av disse antigenene. Nivåene for ekspresjon kan også variere enormt, og kan dermed påvirke den biologiske skjebnen til celler som uttrykker disse proteiner. I samsvar med en kreftfremmende rolle, stimulerer MAGE-A uttrykk cellesyklusprogresjon, migrasjonsrate og invasivitet av dyrkede celler
in vitro
og kan fremme økninger i tumorstørrelse og i antallet og størrelsen av metastatiske foci i dyr modeller [7,8]. Sammen er disse data understøtter ideen om at MAGE-A uttrykk kan bidra til malignitet.
normale funksjonen (e) av MAGE-familien A er fortsatt ukjent, men økende bevis tyder på at disse proteinene modulerer viktige transkripsjonsfaktorer som SKIP , P300, P160 (TIF2) androgen reseptor ER-alfa, og p53 tumor suppressor [3,7,9,10,11,12,13,14,15]. Gjennom samhandling med disse proteinene, MAGE-A kan (og andre MAGE jeg proteiner) regulerer transkripsjons hendelser av ulike mekanismer som rekruttering og målretting av histondeacetylase (HDAC) aktivitet for å hoppe eller p53 [11,13,16], fremme samhandling av androgen reseptoren med P160 og andre ko-aktivator-proteiner [14], eller kobling av co-repressor, KAP1 /TRIM28, til KRAB domene sink finger (KZNF) transkripsjonsfaktorer [8,17,18]. I tillegg til disse effektene, tyder nyere bevis på at en rekke MAGE proteiner (både type I og II) kan fremme ubiquitylation ved å opptre som aktivatorer av RING (veldig interessant nytt gen) finger-type E3 ubiquitin ligaser [8,17,19] . For eksempel kan MAGE-G1 stimulere ubiquitin ligase aktiviteten av NSE1. På samme måte kan interaksjonen av MAGE-C2 med KAP1 (TRIM28) corepressor protein stimulere KAP1 avhengig omsetning av p53 tumor suppressor uavhengig av de store p53 regulator, MDM2 [17]. Denne samlende tema MAGE proteiner som modulatorer av ringfingeren ligaser er understøttet av den observasjon at ni nye MAGE-I bindingspartnere identifisert av TAP-tag /massespektrometri analyse er ringfingeren proteiner [17]. Innenfor MAGE-A familien, foreslår nåværende biokjemiske tegn en høy grad av funksjonell redundans, for eksempel i å regulere p53-funksjon [12,13]. På den annen side, nyere publikasjoner tyder på at det kan være en høy grad av spesifisitet i MAGE /partner interaksjoner, i hvert fall for noen partnere [14,15,17].
p53 fungerer hovedsakelig som en transkripsjonsfaktor som eliminerer kreftceller ved å samordne endringer i genuttrykk, som fører til cellesyklus arrest, alderdom eller apoptose [20]. p53 er regulert primært gjennom sin interaksjon med MDM2, en ring finger-type ubiquitin E3 ligase. MDM2 og p53 operere innenfor en tilbakekoblingssløyfe hvori p53 stimulerer
MDM2
ekspresjon, noe som fører til nedregulering av p53-nivåer ved MDM2. Induksjon og aktivering av p53 ved ulike stress stimuli oppnås ved hjelp av forskjellige, men overlappende mekanismer som hovedsakelig frakople p53 /MDM2 interaksjonen [21]. De viktigste funksjonene i MDM2 protein er: en N-terminal p53 bindende domene der N-terminalen av p53 samhandler med en hydrofob lomme på MDM2; kjernefysiske eksport og import sekvenser som formidler nucleo-cytoplasma skyt av både MDM2 og p53; et sterkt sure og sterkt fosforylert sentral region som er avgjørende for p53-degradering; og en C-terminal RING finger som er nødvendig både for ubiquitylation og degradering av p53. Disse domenene underbygge flere biokjemiske funksjoner i MDM2 som fungerer sekvensielt og samarbeider for å ned-regulere p53 nivåer: disse inkluderer hovedsakelig ubiquitylation, Nucleo-cytoplasma transport, og målretting av p53 til proteasome for degradering. I tillegg kan disse biokjemiske funksjoner reguleres
uavhengig
av hverandre. For eksempel, mens multi-site fosforylering av den sure sentrale domenet MDM2 har ingen påviselig effekt på evnen til å formidle ubiquitylation av p53, disse modifikasjonene spille en avgjørende rolle i å fremme omsetningen av p53 ved å stimulere sammenslutning av MDM2 med flere komponenter proteasome [22,23]. Selv om det kan mediere interaksjon med proteasomet, ved hvilken MDM2 driver den nøyaktige mekanisme (r) p53-degradering er ufullstendig forstått.
MDM4 (også kjent som MDMX eller HDMX) er en defekt ubiquitin-ligase som er strukturelt beslektet med MDM2 og hemmer p53 gjennom overlappende mekanismer [24,25]. For det første er det en stimulerende partner av MDM2 [26] som er seg selv regulert av MDM2-mediert ubiquitylation [27,28,29]. Videre, som med MDM2 binder p53 til MDM4 hovedsakelig gjennom en N-terminal hydrofob lomme og derved sterisk forhindre interaksjonen av p53 transaktivering domene (TAD1) med den transkripsjonelle maskiner og derved nedregulere p53-mediert transaktivering [30].
p53-funksjon går tapt under utviklingen av en høy andel av cancere av ulike typer ved mutasjon av
TP53
-genet (som koder for p53). I noen kreftformer, imidlertid,
TP53
mutasjonsfrekvens er lavere, men andre mekanismer, slik som endret ekspresjon eller mutasjon av p53-regulatorer (f.eks MDM2, MDM4, ARF) antas å eliminere p53-funksjon [31]. Vi og andre har vist at forskjellige medlemmer av MAGE-familien A, som alle viser slående sekvenslikhet, opptre på en lignende måte og er potente inhibitorer av p53-mediert transkripsjon og apoptose [8,12,13]. To av disse studiene viser at MAGE-A opptrer, i det minste delvis, ved binding til kjernen (setespesifikke DNA-bindende) domene av p53 og regulere dens nedstrøms transkripsjon funksjon [12,13]. MAGE-A kan også regulere p53 acetylering (aktivering) gjennom HDAC3 rekruttering og samspill med PML atom organer [13,16]. Gjennom disse mekanismene MAGE-A kan gi resistens mot legemidler som virker gjennom p53 vei [13]. Interessant, noen [17,32], men ikke alle [12,13], studier tyder på at MAGE proteiner kan regulere p53 nivåer, for eksempel gjennom interaksjon med E3 ligaser som KAP1 (TRIM28) [17]. Imidlertid har dette problemet ikke er løst. Videre gis det nå etablert rolle MAGE-A proteiner som regulatorer av ringfingeren E3 ligaser det er ikke vist om disse proteinene kan påvirke rollen MDM2.
I denne studien viser vi at endogen MAGE -Et proteiner og, via ektopisk uttrykk, MAGE-A2, forbinder med MDM2
uavhengig
av p53. Denne observasjonen bedt oss om å utforske samspillet mellom disse to proteiner i større dybde med tanke på å forstå den funksjonelle betydningen av deres tilknytning. Våre data indikerer at, i tillegg til å regulere p53-funksjon direkte, kan MAGE-A selektivt å påvirke nivåene av MDM4 gjennom interaksjon med MDM2, og støtter ideen om at denne familien av proteiner som regulerer p53-funksjon gjennom flere uavhengige, men komplementære mekaniske arrangementer. Vi etablerer også at MAGE-A proteiner, mens opptrer som stimulatorer for noen ringfingeren typen proteiner [17], kan også oppføre seg som en potent hemmer av MDM2 ringfingeren typen E3 ubiquitin ligase.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, transfections og plasmider
U2OS (menneskelige osteosarkom-avledet) celler og H1299 (human lunge carcinoma-avledet) celler ble oppnådd fra Cancer Research UK depot. Cellene ble testet for p53- og MAGE-A status av western blotting. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine reagens (Invitrogen) som beskrevet av produsenten. Plasmider som benyttes for ekspresjon av humane cDNA var derivater av pcDNA3, og var som følger (med katalognumrene i parentes): villtype p53 i pcDNA3 (DWM715), HA-taggede MAGE-A2 i pcDNA3 (DWM1574), human villtype MDM2 ( etter CMV promoter, DWM1127), MDM2-C464A (DWM1214), HA-merket (N-terminale) human MDM4 (1318), Hans
6 tagget ubiquitin (DWM1432). Glutation S-transferase (GST) -FUSION proteiner ble kodet i derivater av vektoren pGEX-4T. Disse inkluderte et sett av tidligere publiserte MDM2 «mini-protein», hvor overlappende domener av MDM2 er smeltet til GST [33,34] og var som følger: GST alene (DWM223), GST-MP1 (DWM1074), GST-MP2 (DWM1093 ), GST-MP3 (DWM1076), GST-MP4 (DWM1077).
Antistoffer og Western blot analyse
SDS-PAGE og western blotting ble utført ved bruk av standard betingelser. Antistoffer som ble brukt var som følger: 6C1 (pan MAGE-A), og H164 (p21) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. DO1 (p53), 4B2 (MDM2) og SMP14 (MDM2) var fra Moravian bioteknologi. CM1 var en slags gave fra professor Sir D. Lane. Anti-MDM4 antistoffer 8C6 og BL1258 ble hentet fra Millipore og fra Bethyl Laboratories hhv. 12CA5 (HA-tag) var fra Cancer Research UK og 20-33 (aktin) var fra Sigma-Aldrich. HRP (pepperrotperoksidase) -konjugert kanin-anti-mus og geite-anti-kanin sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Dako og Bio-Rad, respektivt. Proteiner ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens i henhold til produsentens instruksjoner (Pierce Biotechnology, Inc.).
GST-pull-down Experiment
GST-merket MDM2 fusjonsproteiner [33,34] (eller GST alene som kontroll) ble bundet til GSH (glutation Sepharose 4B) perler (Amersham) og deretter inkubert med
35S-merket MAGE-A2 (utarbeidet av
in vitro
transkripsjon /oversatt TNT T7 System (Promega )). Etter omfattende vaske perlene, ble immobilisert proteiner eluert i 2 X SDS prøvebuffer og oppdaget av western blotting.
In vitro
rullegardin analyser ved hjelp av biotinylerte peptider
Biotinylated peptider ble kjøpt fra mimotopene og generelt består følgende format: «Biotin-SGSG-peptid-amid». Peptider som representerer den N- og C-termini var henholdsvis: «Amine-peptid-GSG-Biocytin amid» og «Biotin-SGSG-peptid-syre». Streptavidin-agarose-perler (Sigma) ble vasket i PBS inneholdende 0,1% (v /v) Tween-20 før tilsetning av 10 ug biotinylert peptid. Kulene ble inkubert over natten ved 4 ° C og deretter vasket med den samme buffer.
35S-merkede MAGE-A2 (fremstilt ved
in vitro
transkripsjon /translasjon TNT T7 System (Promega)) ble tilsatt til kulene, og inkubert i 2 timer ved 4 ° C. Kulene ble deretter vasket 4 ganger i PBS /Tween-20 og resuspendert i SDS-PAGE prøvebuffer. Ko-utfelling av protein ble løst ved hjelp av SDS-PAGE og detektert ved fluorografi.
Immunoutfelling
Celler ble lysert på is i 30 minutter i IP-buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1% (volum /volum) NP-40, 2 mM EDTA og protease-inhibitor (Roche)), sentrifugeres i 10 min ved 13000 x g og supernatanten fjernet for analyse. Lysatet ble deretter pre-erte med 50 ul suspensjon av protein-G-perler (Sigma) i 30 minutter ved 4 ° C, sentrifugert i 3 minutter ved 2000 x g og kulene ble kastet. Totalt 1-2 ug protein ble inkubert med 2 ug /ml for antistoff over natten ved 4 ° C og immunopresipitert den følgende dag med 50 ul suspensjon av protein-G-perler (Sigma) i 2 timer ved 4 ° C. Bunnfallet ble vasket tre ganger i 5 minutter i IP-buffer ved 4 ° C før tilsetning av SDS-gel-loading buffer og immunoutfelte proteiner ble påvist ved western blot.
Ubiquitylation assay
ubiquitylation assay er avhengig av transfeksjon av cellene med et plasmid som koder for His-tagget ubiquitin etterfulgt av innsamling og rensing av ubiquitylated proteiner fra celleekstrakter ved hjelp av nikkel-agarose perler. Denne analysen er blitt beskrevet i betydelig detalj andre steder [35]. De rensede ubiquitylated proteiner ble analysert ved western blotting
Gene stanse ved hjelp av siRNA
MAGE-A uttrykk ble stille ved bruk av to uavhengige tidligere publiserte siRNA oligonukleotider [12,13]. MAGE-A siRNA (1) [13] og MAGE-A siRNA (2) [12] er rettet mot to forskjellige sekvenser felles for hver av de Mage-A familiemedlemmer unntatt Mage-A10 og er som følger:
MAGE- En Oligo 1 [13] 5′-AACCAGCUAUGUGAAAGUC-3 «
MAGE-A Oligo 2 [12] 5′-UCACAAAGGCAGAAAUGCU-3′
ikke-tie Oligo (kontroll) 5′ CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 «
siRNA oligonukleotider ble produsert av Dharmacon og ble innført i cellene ved revers transfeksjon hjelp RNAiMAX (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon.
Pasienter, Samtykke og Immunohistochemistry (IHC)
kohort brukt i denne studien (TMA24) har blitt rapportert tidligere [36,37] og består av primære, tidligere ubehandlet brystkreft fra 225 uselektert pre- og postmenopausale kvinner (i alderen 28-89, median 62 år) behandlet ved Tayside universitetssykehusene, Skottland fra 1997 til 2002. Oppkjøp av prøver og utarbeidelse av svulsten microarray (TMA) har blitt beskrevet andre steder [36,37]. Studien fikk etisk godkjenning fra både Tayside Forskning og etisk komité (Ref. 07 /S1402 /90) og Tayside Tissue Bank Committee (Ref. TR000236). Generisk, skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient før vev oppkjøp og før operasjonen ble gjennomført, en prosess som er godkjent av den forskningsetiske komité for bruk av overflødig vev ikke påkrevd for diagnostiske formål og for venøs blodprøvetaking som skal brukes i forskning .
Avsnitt fra TMA blokk (nominelt 4 mikrometer tykke) ble utarbeidet og behandlet som beskrevet tidligere [37]. Antistoffer som er spesifikke for proteiner som brukes i undersøkelsen var: 6C1 (pan-MAGE-A); og BL1258 (MDM4).
TMA-ledelsen til MAGE-A og MDM4 ble utført av en spesialist bryst patolog (LBJ) ved hjelp av Quick metoden [38] for intensitet og andelen av celler farget med den aktuelle antistoff .
Resultater
MAGE-A proteiner samhandle med MDM2 i dyrkede celler
for å finne ut om MAGE-A proteiner samhandle direkte med MDM2 uavhengig av p53, co-immunoprecipitation av endogent uttrykte proteiner ble utført ved anvendelse av H1299-celler (som ikke uttrykker p53). Som en kontroll, ble forsøkene også gjort i villtype p53-uttrykkende celler som U2OS vi og andre har anvendt tidligere for MAGE-A /p53-interaksjonsstudier [12,13,16]; begge disse linjer uttrykker flere detekterbare medlemmer av MAGE-familien A (S1 Fig). I samsvar med denne observasjonen pan-MAGE-A antistoff, 6C1, oppdaget flere nært migrere band tilsvarende ulike MAGE-A familiemedlemmer i celleekstrakter (Fig 1A, lavere panel). Immunpresipitasjon av MAGE-A bruker 6C1 resulterte i co-immunoprecipitation av MDM2 (fig 1A, øvre panel). I et gjensidig analyse, ble MAGE-A-proteiner funnet å være til stede i immunutfellinger fra MDM2 fra de samme ekstraktene ved hjelp av antistoffer, 4B2 og SMP14 (nedre panel). Co-immunoprecipitation ble også utført ved bruk U2OS celler (som uttrykker villtype p53) med tilsvarende funn. De tregere-trekkende MDM2 proteiner sett til co-immunpresipitatet med MAGE-A i begge cellelinjer tyder på at MAGE-A proteiner kan fortrinnsvis samhandle med en post-translatorisk modifisert form (r) av MDM2. På samme måte kan tregere-trekkende band av MAGE-A tyder på at modifiserte MAGE-A proteiner fortrinnsvis forbinder med MDM2 eller alternativt at MDM2 kollegaer fortrinnsvis med spesifikke MAGE-A familiemedlemmer. Vi har definitive svar på disse punktene i dag. MAGE-A-proteiner var ikke detekterbare i MDM4 immunutfelninger heller ikke, gjensidig, gjorde MDM4 co-immunpresipitatet når den anti-MAGE-A-antistoff ble anvendt (data ikke vist). Disse dataene antyder spesifisitet med MAGE-A /MDM2 interaksjon. I sammendraget, disse dataene indikerer at MDM2 og MAGE-A førsteamanuensis i et mobiltelefon sammenheng.
(A) H1299 celler (venstre hånd paneler) eller U2OS celler (høyre hånd paneler) ble lysert og immunoprecipitation ble gjennomført ved hjelp antistoffer mot MAGE-A (6C1), MDM2 (SMP14 pluss 4B2) eller, som kontroll, en ikke-spesifikk murin IgG. Blottene ble probet for tilstedeværelse av MDM2 (toppfeltene) eller MAGE-A (bunnplater). Posisjonene av antistoff tunge kjeder (HC) og lette kjeder (LC) er angitt i den nedre paneler. (B) GST-pull-down analyser ble utført hvori
35S-radiomerket MAGE-A2 ble fanget på glutation-Sepharose 4B kuler ved hjelp av GST knyttet til full lengde MDM2 eller fire mini-proteiner (betegnet MP1, -2, -3 og -4) som representerer overlappende områder av MDM2 [33,34]. Den ko-utfelling av MAGE-A2 ble påvist ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av fluorografi (øvre panel). Den midterste panel viser tilstedeværelsen av GST-MDM2 proteiner etter binding til glutation perlene. Det nederste panel er et skjematisk riss som viser full lengde MDM2 sammen med de overlappende regionene omfattet innenfor mini-proteiner. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
MAGE-A proteiner samhandle med MDM2
in vitro
For å avgjøre om MDM2 og MAGE-A samhandle
in vitro
, GST rullegardin eksperimenter ble utført ved anvendelse av en serie av GST-fusjonsproteiner som omfatter GST-full lengde humant MDM2 sammen med en tidligere publisert serie av GST-fusjonsproteiner er knyttet til overlappende domener av MDM2 [33, 34]. Dataene (fig 1b) bekrefter at
35S-merket
in vitro
-translated MAGE-A2 samhandler med MDM2 og ikke med GST del av fusjonsproteinet i rullegardin analyse. (MAGE-A2 ble valgt for denne analysen, fordi det er et godt karakterisert regulator av p53 bane som utfører like godt når sammenlignet med andre MAGE-A-proteiner (-A1 og -A6) i sin evne til å blokkere p53-funksjon [12,13 ].) dataene viser også at MAGE-A2 interagerer sterkt med de N-terminale 110 aminosyrer av MDM2 og den C-terminale område som omfatter aminosyrene 279-491. Det er en svak interaksjon med MDM2 aminosyrer 108-207 men svært lite sammenheng med aminosyrer 203-282 består hovedsakelig viktig syrlig domenet.
For å utforske videre området (e) av samhandling, evne til MDM2 aminosyresekvenser til co-utfelling
35S-merket
in vitro
-translated MAGE-A2 ble målt i PEPSCAN analyser. Disse analyser anvendes en respektiv serie av 15-mer biotyinylated peptider bundet til streptavidin-perler, hvert peptid overlapper med det neste i serie med 5 eller flere aminosyrer, og som omfatter henholdsvis hele det menneskelige MDM2 aminosyresekvens (S2 Fig). Vi har tidligere brukt en lignende tilnærming for å bestemme områder for samhandling av MAGE-A2 i p53 [12]. Dataene fra denne analysen identifisere flere peptider som i samspill med MAGE-A2 (Fig 2A og oppsummert i figur 2B). Det er to sterkt samvirkende peptider som representerer N-terminale aminosyrer (51-65 og spesielt 91-105) og tre peptider som representerer sekvenser innenfor den C-terminale ende av MDM2 (451-465, 461-475 og 481-491). Dataene også markere svakere samhandling på peptider tilsvarende aminosyrer 151-165 og 171-185 som inneholder henholdsvis de to etablerte kjernelokaliserings sekvenser i MDM2. Svake men påvisbare interaksjoner ble oppdaget på 191-205, 291-305 og 311-325. Påfallende, disse dataene er i utmerket avtale med GST pull-down eksperimenter (Fig 1b). (De fem store samvirkende peptider i de N- og C-terminale regioner av MDM2 er vist på linje med de tilsvarende sekvenser i MDM4 i S3 fig. Disse linjer markerer en rekke betydelige forskjeller i aminosyresekvensene i det minste fire av peptidene, spesielt peptid svarende til aminosyrene 91-105 av MDM2 som viste den største grad av interaksjon (figur 2A). Disse forskjellene i sekvens kan forklare hvorfor MDM4 kunne ikke ko-immunopresipitert med anti-MAGE-A-antistoff (fig 1) .)
(A) PEPSCAN assays (pull-down forsøk) ble utført, hvor en serie av 15-mer biotinylerte peptider (nummerert 1-49) overlapper med 5 eller flere aminosyrer, og som representerer hele MDM2 amino- -sekvens ble koblet til streptavidin-sepharosekuler og brukes til å fange
35S-merket in vitro-translatert MAGE-A2. Den ko-utfelling av MAGE-A2 ble påvist ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av fluorografi. Kontrollen rullegardin (venstre panel nederst) var et peptid som representerer BoxIV /V-regionen av p53 som vi tidligere har etablert binder meget tett til MAGE-A2 [12]. (B) Skjematisk viser de områder representert ved de samvirkende peptider i rullegardin analysen. Sterke og svake bindingssetene er angitt i sammenheng med viktige funksjonelle områder innenfor proteinet MDM2. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Modellen viser en dimer av MDM2 ringfinger, basert på den publiserte 3D-struktur (Protein dataene Bank sjonsnummer: 2HDP). De to identiske subenheter i dimeren er representert i grått og lys blå henholdsvis. Bildet på høyre side ble oppnådd ved å rotere 3D-strukturen ved ca. 90 ° mot høyre i horisontalplanet. Plasseringen av MAGE-A2-bindende peptider som er vist på en underenhet: aminosyrene 456-470 er representert i rødt, mens aminosyrene 486-491 er vist i lys oransje
MDM2 C-terminal. peptider som MAGE-A2 binder ligger innenfor ringfingeren domene som er avgjørende for homo-dimerisering og hetero dimerisering med MDM4. Denne regionen spiller også en avgjørende rolle i å kommunisere med, og i mediering av den overføring av ubiquitin fra, E2 ligaser til substrater [39,40,41,42,43]. Dessuten, når sett i sammenheng med 3D-strukturen til MDM2 RING, ligge disse peptidsekvenser sammenstilt på overflaten av ringen som er blitt foreslått å formidle kontakt med E2 ligase, UbcH5 ([39,40,42], fig 2C). I tillegg inneholder de flere aminosyrer som har blitt demonstrert av mutagenese analyse for å spille en avgjørende rolle i MDM2 avhengig p53 ubiquitylation og auto-ubiquitylation [39,40,41,42,43]. Bindingen av MAGE-A2 til dette området antyder at det kan påvirke MDM2-avhengige ubiquitylation, muligens på en inhiberende måte.
MAGE-A2 samvirker med den N-terminale ende av MDM2
in vitro
på en lignende måte som p53
Ytterligere undersøkelse av foreningen av MAGE-A2 med den N-terminale ende av MDM2 viste at de to samvirkende peptider som representerer henholdsvis på hver side av den hydrofobe grove som er ansvarlig for formidling av interaksjonen med det N-terminale domenet til p53. Posisjonene av disse peptidene i krystallstrukturen av MDM2 N-terminale område [44] er uthevet i rødt og magenta henholdsvis i figur 3A. Aminosyrer i begge disse områder er nødvendige for p53-binding [44] tyder enten på at MAGE-A2 kan interagere med MDM2 på en måte lik den til p53, eller at det kan påvirke p53 /MDM2 interaksjon. For å bestemme hvorvidt MAGE-A2 binder seg til den N-terminale ende av MDM2 i en cellulær sammenheng, ble de «MP1» MDM2 mini-protein (som omfatter aminosyrene 1-110 av MDM2) uttrykt som en fusjon med grønt fluorescerende protein (GFP, fig 3B) sammen med MAGE-A2 på H1299-celler. Som en positiv kontroll ble p53 uttrykt i stedet for GFP-MP1. Co-immunpresipitasjonsanalyse (Fig 3C) bekreftet at både MAGE-A2 og p53 kontroll var i stand til å assosiere med GFP-MP1 (MDM2) i de dyrkede celler. Det ble ikke observert krets når GFP mangler MP1 forlengelsen ble anvendt.
(A) Strukturen av den N-terminale ende (p53-bindende domene) av MDM2 (1YCR) som viser posisjonene til MAGE-A2-bindende peptider 51 -65 (rød) og 91-105 (magenta). Ryggraden er vist i grønt. Plasseringen av de aminosyrene i flankene av hver av disse peptidene er vist. (B) Skjematisk viser strukturen av GST-MDM2 mini-protein, MP1, anvendt i dette eksperimentet. En versjon som GST ble erstattet av GFP og ble anvendt for dyrket celle ekspresjon og immunoutfellingsanalyse. (C) co-immunoutfellingsanalyse ble utført etter ekspresjon av GFP-MP1 (eller GFP alene som kontroll) i H1299-celler sammen med MAGE-A2 eller p53 (som positiv kontroll). (D) GST-pull-down analyser ble utført hvori
35S-radiomerket MAGE-A2, eller
35S-radiomerket p53 som kontroll, ble fanget på glutation-Sepharose 4B kuler ved hjelp av GST knyttet til MDM2 mini-protein, MP1, som omfatter aminosyrer 1-110 inkludert det hydrofobe p53-bindende kløft. Foreningen av MAGE-A2 eller p53 ble målt i nærvær av økende konsentrasjoner av Nutlin-3a. De ko-utfelling av MAGE-A2 og p53-proteiner ble påvist ved SDS-PAGE etterfulgt av fluorografi. Merk at
in vitro
transkripsjon /translasjon av p53 gir opphav til to polypeptider. (E) Kvantifisering av rullegardin eksperiment følgende densitometry. I alle tilfeller er dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
å teste ideen om at p53 og MAGE-A2 binder til MDM2 på en lignende måte, ble GST rullegardin eksperimenter utført
in vitro
for å bestemme hvorvidt den konkurrerende inhibitor, Nutlin-3a, som etterligner p53 og binder tett innenfor den hydrofobe spor i MDM2 som utgjør p53-bindingssetet, kan blokkere interaksjonen av MAGE-A2 med MDM2 [45] . Dataene viser at økende konsentrasjoner av Nutlin-3a gjør faktisk forhindre MAGE-A2 fra binding til N-terminalen av MDM2 (figur 3D og 3E). Interaksjonen av p53 med MDM2, som ble målt i det samme eksperimentet som en kontroll, ble også inhibert av progressivt økende konsentrasjoner av Nutlin-3a (figur 3D og 3E). IC
50 Verdiene for dissosiasjon av p53 og MAGE-A2 henholdsvis fra MDM2 var 18 uM og 10 uM indikerer at p53 binder til dette området forholdsvis bedre enn MAGE-A2. Merkelig nok, høyere nivåer av Nutlin-3a faktisk reverseres inhibering og stimulert binding av MAGE-A2 til MDM2, en effekt som ikke forekomme med p53. Én mulig forklaring av denne effekt er at før binding av p53 (eller en analog p53) kan påvirke den etterfølgende binding av MAGE-A2.
MAGE-A2-blokkene MDM2-mediert ubiquitylation i dyrkede celler, men påvirker ikke p53 omsetningen
For å finne ut om faktisk MAGE-A proteiner kan fungere som MDM2 regulatorer, en etablert cellekulturbasert ubiquitylation analysen ble brukt [35] der H1299 celler ble ko-transfektert med plasmider som uttrykker villtypehumant p53 , MDM2, Hans-merket ubiquitin, og økende mengder av MAGE-A2. Ved 36 timer etter transfeksjon ble cellene lysert i 6 M guanidinium-buffer, forhold som hindrer deubiquitylation av proteiner og forstyrre eventuelle ikke-kovalente protein-protein-interaksjoner. Den His-merkede ubiquitylated proteiner ble renset ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av Ni
2 + -agarose kuler, deretter eluert senere og analysert ved Western blotting med anti-p53-antistoff, DO-1. Dataene (fig 4A, øvre panel) bekreftet at MDM2 var i stand til å ubiquitylate p53 i denne analysen, og enda viktigere, redusere p53 nivåer. Spesielt, p53 ble ikke ubiquitylated av MAGE-A2 alene (sammenlign spor 1, 2 og 3).
