Abstract
Bakgrunn
Vi har tidligere rapportert økte nivåer av protein -koblet fucosylation med utvikling av leverkreft og identifisert mange av proteinene som inneholder de endrede sukkerstrukturer. Et slikt protein er alfa-1-antitrypsin (A1AT). For å fremme disse studiene, utførte vi N-bundet glykan analyse på de fem store isoformer av A1AT og gjennomført en omfattende studie av glykosylering av A1AT funnet hos friske kontroller, pasienter med hepatitt C (HCV) indusert levercirrhose, og hos pasienter infisert med HCV med diagnosen leverkreft (HCC).
metodikk /hovedfunnene
Pasienter med levercirrhose og leverkreft hadde økte nivåer av triantennary sukkerholdig ytre arm (α-1, 3) fucosylation. Økninger i kjernen (α-1,6) fucosylation ble kun observert på A1AT fra pasienter med kreft. Vi utførte en lektin fluorofor bundet immunsorbent analyse ved hjelp av
Aleuria Aurantia
lektin (AAL), spesifikk for kjerne og ytre arm fucosylation i over 400 pasienter med leversykdom. AAL-reaktive A1AT var i stand til å detektere HCC med en sensitivitet på 70% og en spesifisitet på 86%, noe som var større enn den som ble observert med den nåværende markør for HCC, alfa-fetoprotein. Glykosylering analyse av falske positiver ble utført; Resultatene indikerte at disse pasientene hadde økning i ytre arm fucosylation men ikke i kjernen fucosylation, noe som tyder på at kjerne fucosylation er kreft spesifikk.
Konklusjon /Betydning
Denne rapporten beskriver trinnvis endring i glykosylering av A1AT med progresjon fra levercirrhose til kreft og identifiserer kjernen fucosylation på A1AT som HCC spesifikk modifisering
Citation. Comunale MA, Rodemich-Betesh L, Hafner J, Wang M, Norton P, Di Bisceglie AM, et al. (2010) Kobling Spesifikk Fucosylation av Alpha-1-antitrypsin i levercirrhose og kreftpasienter: Konsekvenser for en biomarkør for leverkreft. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10,1371 /journal.pone.0012419
Redaktør: Wang-Shick Ryu, Yonsei University, Sør-Korea
mottatt: 15 juni 2010; Godkjent: 22 juli 2010; Publisert: 25 august 2010
Copyright: © 2010 Comunale et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend R01 CA120206-01 fra National Cancer Institute (NCI), gi UO1 CA084951-06 fra NCI Early Forskning Detection Network (EDRN), hepatitt B-stiftelsen, og en bevilgning fra The Commonwealth of Pennsylvania. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Infeksjon med hepatitt B-virus (HBV) eller hepatitt C virus (HCV) er den viktigste etiologi av leverkreft (HCC) [1] – [4]. Både HBV og HCV forårsake akutt og kronisk leverinfeksjoner, og de fleste kronisk infiserte individer forblir symptomfri i mange år [5]. Omtrent 10% til 40% av alle kroniske HBV bærere hvert utvikle leverkreft, og det er anslått at over én million mennesker over hele verden dør på grunn av HBV og HCV-assosiert leverkreft [2], [6], [7]. Faktisk er HBV og HCV-infeksjoner i forbindelse med over 80% av alle tilfeller av HCC over hele verden, og kan være så høyt som 96% i regioner hvor HBV er endemisk [3].
progresjon av leversykdom til leverkreft er primært overvåket ved serumnivåer av onkoføtal-glykoprotein, alfa-fetoprotein (AFP), eller kjernen fucosylated glykoformpopulasjon av AFP, AFP-L3. AFP kan imidlertid fremstilles i mange tilfeller, også i forhold til andre leversykdommer [8] – [10], og er ikke til stede i alle de med HCC [11]. Derfor er bruk av AFP som en primær skjerm for HCC har vært stilt spørsmål [12], og mer følsomme serum biomarkører for HCC er nødvendig.
glykosylering av proteiner er cellespesifikt. Den N-bundet glykosylering av et protein gjenspeiler endringer som skjedde i den cellen hvor den kom [13]. Den glykosylering av det samme proteinet som utskilles fra sykt vev, ondartede celler eller normale celler kan, og ofte gjør, skiller [14]. Vi og andre har observert forandringer i N-bundet glykosylering med utvikling av cirrhose og HCC [15] – [19]. Nærmere bestemt er mengden av kjernen fucosylated N-bundet glykan er avledet fra total proteinpreparater isolert fra serum hos individer kronisk infisert med HCV og fra de med en diagnose av HCC var konsekvent større enn hos friske pasienter og hos pasienter med HCV og «inaktiv «sykdom [19].
Ved hjelp av fucose spesifikke lektiner å identifisere proteiner som blir fucosylated hos pasienter med leversykdom, vi identifisert mer enn 100 glykoproteiner fra pasienter med HCC og /eller skrumplever som inneholdt økt fucosylation [19 ]. Et av disse proteiner var alfa-1-antitrypsin (A1AT). Vi analyserte N-bundet glykosylering av de fem store isoformer av A1AT og oppdaget, i tillegg til økte nivåer av kjernen fucosylation, betydelige økninger i ytre arm fucosylation med utvikling av leverkreft. Ved hjelp av en lektin-baserte analysen, målte vi denne endringen i over 400 pasienter med leversykdom og fant AAL reaktiv A1AT kunne påvise HCC med en sensitivitet på 70% og en spesifisitet på 86% med en cut-off av 5 relative enheter. Glycan analyse av falske positiver identifisert ytre-arm fucosylation som årsak til falsk positivitet. I motsetning til dette, ble en økning i kjerne fucosylation bare finnes hos pasienter med kreft. Årsakene til denne endringen og den kliniske nytten av denne endringen blir diskutert.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Både Drexel University College of Medicine og Saint Louis University Institutional Review Boards godkjent studieprotokollen, som var i samsvar med de standarder som er fastsatt av Helsinki-deklarasjonen av 1975. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker.
Pasient
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet fra Saint Louis University School of Medicine (Saint Louis, MO). Demografiske og kliniske informasjon sammen med en blodprøve ble tatt fra hver deltaker i et serum separator rør. Prøven ble spunnet i løpet av 2 timer, og serum ble lagret ved -80 ° C inntil testing. Pasientene ble innrullert i Saint Louis University leverkreft Clinic og HCC ble diagnostisert ved hjelp av de samme kriteriene som er fastsatt for HALT-C rettssaken [20]. Deltakerne hadde HCC identifisert ved biopsi, med en ny leverfeil som viser vaskulær ekstrautstyr på en avbildningsfunksjonalitet (ultralyd [US], magnetic resonance imaging [MR], eller computertomografi [CT]) med AFP nivåer 1000 ng /ml, eller av antatt HCC. Deltagerne ble antatt å ha HCC hvis de hadde en diskret hepatisk feil på amerikansk med AFP nivåer 1000 ng /ml, og enten to andre skanner (MR, CT, angiografi) som indikerer malignitet med i det minste en av de følgende egenskaper: hypervascularity, arteriell til portvenen shunter, portal venetrombose nær defekt, svulst i portvenen, eller en annen scan (MR eller CT) viser funksjoner karakteristisk for HCC og enten en økning i størrelse over tid etter første oppdagelsen (minst dobling hvis mindre enn 1 cm) eller en økning i nivået av AFP å 200 ng /ml. Tumor iscenesettelse ble bestemt ved hjelp av United Nettverk for orgel Sharing-modifisert (UNOS) TNM staging system for HCC. For skrumplever gruppen ble pasienter med hepatitt C og biopsi-påvist skrumplever registrert. Alle cirrhose kontroller ble screenet for HCC bruker UL, CT eller MR før innmelding. Pasienter som var HBsAg + (med eller uten HBV DNA ble klassifisert i HBV-gruppen. På tilsvarende måte, pasienter som var HCV-RNA-positive, uten tegn til skrumplever, ble klassifisert i HCV-gruppen. Pasienter med andre ikke-virale leversykdom men uten cirrhose klassifisert i andre leversykdom gruppe (OLD). Styr pasientene var friske pasienter rekruttert av studien til å fungere som kontroller.
todimensjonal (2D) Gel elektroforese
totalt 7 ul av serum ble fortynnet i 330 pl av solubilisering buffer inneholdende 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT, 5 mM tributylfosfin, og en 0,4% blanding av bærer amfolytter (Servalyt pH 2-4, pH 3 -10, pH 9-1, 01:02:01). Prøvene ble vortexet periodisk i 1 time og tilført en 18-cm pH 3-7 NL immobilisert pH-gradient (IPG) bånd (Amersham, Piscataway, NJ, USA) . Gel rehydratisering ble utført i 14 timer ved 50 V og fokusert ved hjelp av IPGPhor (Amersham), isoelektrisk fokusering apparat. etter fokusering, gel strimler ble først redusert og deretter alkyleres i 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mM Tris, pH 6,8, og enten 30 mM DTT eller 75 mM jodacetamid i 10 minutter hver. Den andre dimensjonen ble vedtatt med 8% til 18% akrylamid-0,8% PDA gradient gel på en Protean II xi Cell (Biorad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA) med driftsforhold settes til 20 mA /gel for 20 min og 40 mA /gel i 4 timer. Geler ble fiksert og farget med kolloidalt Coomassie. Geler ble fotografert med Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosystems, Lincoln, Nebraska) og analysert ved hjelp av ikke-lineær Dynamics Progenesis arbeidsstasjon gel bildebehandlingsprogrammer (NonLinear Durham, NC, USA).
Matrix-Assisted Laser desorpsjon /ionisering-Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri
Protein flekker ble fjernet fra kolloidalt Coomassie blå farget gele, avfarget, og fordøyd med trypsin. Gjenvunne peptider ble konsentrert og avsaltet ved hjelp av ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, USA) i henhold til produsentens anvisninger, og forberedt for MALDI-TOF massespektrometri ved å blande 0,5 ml peptid-blanding med 0,5 ml 10 mg /ml α-cyano- 4-hydroxycinnamic syre og 1% maursyre i 50% acetonitril og slik at dråpen for å tørke på den MALDI plate. Peptide masse kartene ble innhentet ved hjelp av en Voyager-DE Pro Mass Spectrometer (Applied Biosystems, Rednings Bioteknologi, Carlsbad, California), som brukes i positiv ion reflectron modus. Proteiner ble identifisert fra peptid masse kart med maskoten online database (www.matrixscience.com) for å søke den nonredundant protein database.
Glycan Analyse
2de gel flekker ble skåret ut og avfarget hjelp 40% metanol 7% eddiksyre. Gelen plugger var dehydrert med acetonitril, ble acetonitrilet fjernet og 25 mM DTT ble tillatt å absorbere inn i pluggen. Pluggen ble oppvarmet til 100 ° C i 5 minutter, fikk avkjøles, og alkylert i mørke i 30 minutter med 75 mm jodacetamid. Gelen pluggene ble vasket ved å bruke to ganger i acetonitril dehydrering og 20 mM ammoniumbikarbonat rehydrering. Etter en endelig dehydratisering, ble gelen pluggene tørket i en speed vac. Peptide:N-glykosidase F (PNGase F) ble fortynnet med 20 mM ammoniumbikarbonat pH 7 og tillatt å adsorbere inn i gelen pluggen. Gelen Pluggen ble deretter dekket med det samme løsning og inkuberes over natten ved 37 ° C. De glykaner ble eluert fra gelen pluggen ved sonikering i Milli-Q vann tre ganger; den elutant ble slått sammen, tørket ned, og merket med en 2AB fargestoff (Ludger, Oxford, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. De glykaner ble deretter renset ved hjelp av papir kromatografi og filtrert ved hjelp av en 0,22-mikrometer sprøyte filter. Fluorescensmerkede glykaner ble deretter analysert ved hjelp av Waters Alliance væskekromatografi system med en normal fase-kolonne (TSK amid 80 kolonner) supplert med en Waters fluorescensdetektor og kvantifisert ved å bruke Millennium Kromatografi Behandling (Waters Corporation, Milford, MA). Den mobile fasen besto av løsningsmiddel A (50 mM ammoniumformiat, pH 4,4) og oppløsningsmiddel B (acetonitril). Gradienten var som følger: lineær gradient fra 20% til 58% oppløsningsmiddel A ved 0,4 ml /minutt i 152 minutter, etterfulgt av en lineær gradient fra 58% til 100% oppløsningsmiddel A for den neste 3 min. Strømningshastigheten ble øket til 1,0 ml /minutt; Kolonnen ble vasket i 100% løsningsmiddel A i 5 min. Etter vasketrinnet ble kolonnen ekvilibrert i 20% oppløsningsmiddel A i 22 minutter i forberedelse for den neste prøven. Sukkerstrukturer ble identifisert ved beregning av glukoseopptak og exoglycosidase fordøyelsen, som beskrevet tidligere [21].
lektin-fluorophore bundet immunosorbent assay (FLISA)
fangst antistoff (mus antihuman A1AT , ABD Serotec, Raleigh, NC, USA), ble inkubert med 10 mM natriumperjodat i 1 time ved 4 ° C. Denne behandlingen sikrer at lektinet er ute av stand til å reagere med glykosylering av antistoffet, og påvirker ikke antistoff substratbindende. Et like stort volum av etylenglykol ble tilsatt, og det oksyderte antistoff ble bragt til en konsentrasjon på 10 ug /mL med natriumkarbonat-buffer, pH 9,5. Antistoff (5 pg /brønn) ble tilsatt til platen og, etter inkubasjon, ble vasket med 0,1% Tween 20 mM fosfatbuffret saltvann pH 7,4. Platen ble blokkert over natten med 3% bovint serum albumin /fosfat-bufret saltløsning. For analyse ble 5 ul serum fortynnet i 95 ul blokkerings reagens i heterofile Blokkerings rør
tm (Scantibodies Laboratory, Inc. Santee, CA, USA) og ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble prøvene tilsatt til platene i 2 timer og vasket 5 ganger i lectin inkubasjonsbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20). Fucosylated A1AT ble oppdaget med en biotin konjugert
Aleuria aurantia
lektin (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Bundet lektin ble oppdaget ved hjelp IRDye 800 konjugert streptavidin; signalstyrken ble målt ved hjelp av Odyssey infrarødt avbildningssystem (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). I alle tilfeller ble signalintensitetene i forhold til de signaler som detekteres med kommersielt innkjøpt humant serum (Sigma Chemicals). Lektin-FLISA registrerer mengden av fucosylation til stede på en lik mengde av molekyler som er tatt fra hver pasientprøve, og blir utført på en måte som er uavhengig av den totale mengden av protein i en gitt pasient.
Statistical Analysis
Beskrivende statistikk for iscenesatt pasienter ble sammenlignet med spredningsplott som inkluderte uteliggere. Alle verdier ble rapportert som middelverdier pluss eller minus standardfeil med mindre annet er angitt. Fordi dataene ikke følger typisk Gaussian distribusjon, en nonparametrical test (to-tailed, 95% konfidensintervall, Mann-Whitney test) ble benyttet for å bestemme statistisk forskjell mellom gruppene. For å bestemme den optimale verdien cutoff for hver markør, ble mottakeren opererer karakteristiske kurver konstruert ved hjelp av alle mulige konsentrasjon for hver analyse. Arealet under mottakeren opererer karakteristiske kurve ble laget og sammenlignet som tidligere beskrevet. En tosidig p-verdi på 0,05 ble brukt for å bestemme statistisk signifikans. Alle analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).
Resultater
Nivåer av A1AT og Grad Sialyation hos pasienter med levercirrhose og HCC
Felles sera fra friske pasienter (n = 20), hos pasienter med levercirrhose (n = 20) og pasienter med HCC med en bakgrunn av cirrhose (n = 20) ble løst via 2-D-gel-elektroforese (2DE) (tabell 1). Figur 1A viser en representativ 2-DE normalt humant serum og figurene 1B, 1C og 1D viser et fokus på de 5 isoformene (M1, M2, M4, M6 og M7) av A1AT fra de tre pasientgrupper. Tre store og to mindre A1AT isotypes blir ofte sett når humant serum er isoelektrisk fokusert og kjøre på en 2-D-gel [22], [23] og disse er ikke endret i de tre pasientgrupper. De A1AT konsentrasjoner i hver pasientgruppen var sammenlignbar (Tall 1E-1G) og falt innenfor normale serumkonsentrasjoner. Dette resultatet ble bekreftet ved å analysere A1AT en enzym-bundet immunosorbent analyse (ELISA), hvorved A1AT nivåene var 3,2 mg /ml i kompositten fra friske pasienter, 3,3 mg /ml i kompositten fra pasienter med cirrhose, og 3,3 mg /ml i kompositten fra HCC pasienter.
Sera fra dammer av friske kontroller (A, B, E) og cirrhose (C, F) og kreft (D, G) pasienter som ble fokusert ved hjelp av IPGPhor 3-7 NL første dimensjonen strimler etterfulgt av SDS-PAGE separasjon på 8% til 18% akrylamidgeler. PI av utvalgte gel flekker er M1 = 4.91, M2 = 4,95, M4 = 5,00, M6 = 5.05, og M7 = 5,10. Paneler E, F og G viser den relative overflod av hver gel spot.
Vi utførte sukker analyse på M1, M2, M4, M6 og M7 isotyper fra bassengene av sera fra normale deltakere og cirrhose og HCC pasienter (Tall 1B-1D) og undersøkt sialysering mønstre av hver isotype. Fig S1 viser en representativ glykan profil for M4 isotypen fra kontrollene. I samsvar med resultatene fra tidligere studier [24], er det dobbeltantenneformede sukker de mest tallrike artene. Figur S1-B viser nivået av sialyated dobbeltantenneformede og triantennary glykan er knyttet til hver isoformer fra hver pasient gruppe. Som S1-B-show, nivået av sialyation på bi-anntennery glykan (A2G2S1 eller A2G2S2) var lik i de ulike pasientgruppene. På samme måte er nivået av sialyation ble ikke forandret på triantennary glykan. Men var det en økning i nivået av tri-sialyated α-1,3 knyttet fucosylated ytre arm fucosylated sukker (A3F (3) 1G3S3) på A1AT fra kreftpasienter, sammenlignet med friske og pasienter med cirrhose. Disse peak er angitt i figur S1 A B med en stjerne.
økte nivåer av Core og Ytre Arm Fucosylation er observert på A1AT fra pasienter med HCC
For å teste om økt nivå av tri-sialyated α-1,3 linked fucosylated ytre arm fucosylated sukker (A3F (3) 1G3S3) var et resultat av en økning i sialyation eller en økning i den totale mengden av foreldre glykan, ble sialsyre fjernet enzymatisk og prøven re-analysert. Figur 2 viser den forenklede desialylert glycoprofile av de fem store isoformene for hver av pasientgruppen etter behandling med neuraminidase (
Arthrobacter ureafaciens
). Tre topper av interesse, som er merket med en stjerne i figur 2, er reproduserbart endret i M1, M2 og M4 isoformer som den syke leveren utvikler seg fra skrumplever til kreft. Sekvensiell exoglycosidase fordøyelse (data ikke vist) viste disse toppene for å bli en kjerne fucosylated dobbeltantenneformede sukker (F (6) A2G2), en triantennary sukker (A3G3), og en triantennary sukker med et enkelt α 1,3 knyttet ytre arm fucose rest ( A3F (3) 1G3). Figur 3A viser en representativ desialylert profil med tilsvarende glykan struktur identifisert for hver topp. Tabell 2 viser en kvantifisering av hver glykan struktur til stede på de fem store isoformene for hver pasient gruppe. Konkrete endringer i glykosylering er observert i A1AT isoformer med progresjon til skrumplever og HCC. På M6, isoformen med svært lite tri og tetra antennary strukturer, den dobbeltantenneformede kjernen fucosylated sukker (F (6) A2G2), representerer 4,48% i normale pasienter, 4,37% hos pasienter med skrumplever, og 7,04% hos pasienter med kreft, en tendens sett på tvers av hver isoformer (Tabell 2, glykan 3). Den prosentvise endring mellom friskt og cirrhose og mellom cirrhose og kreft er gitt i figur 3C, og viser at denne strukturen endres med kreft bare. I M4, de triantennary sukker med en ytre arm fucose rest (A3F (3) 1G3) øker fra 4,34% i normale deltakerne til 6,78% hos pasienter med skrumplever, og 13,18% hos pasienter med skrumplever pluss kreft. Igjen, er denne utviklingen sees i hver av isoformer, med unntak av M6 på grunn av den totale mangel på triantennary strukturer (tabell 2, glykan 8). Den relative økning i hver av disse fucosylated glykan strukturene som en funksjon av sykdom er vist i figur 3B, og viser at disse strukturer endringer i både lever cirrhose og HCC. Økningen i ytre arm fucosylation var også assosiert med en reduksjon i den overordnede N-bundne glykan. Det vil si at økningen i den ytre armen fucosylated triantennary glykan, A3F (3) 1G3, var assosiert med en reduksjon i triantennary glykan A3G3. (Tabell 2, sukker 6).
De store toppene som er endret er merket med en stjerne og er (fra venstre til høyre) en kjerne fucosylated bianntennary sukker (F96) A2G2), en trianntennary N-bundet glykan , og en trianntennary N-bundet glykan med et enkelt ytre arm fukose rest (A3F [3] 3). Prosentinnholdet av hver av disse topper i forskjellige isoformer, og i de ulike pasientgruppene er vist i tabell 2.
(A) Et representativt N-bundet glykan-profil fra en normal kontroll pasient. De 11 store sukkerstrukturer identifisert indikeres og gitt et nummer. Dette nummeret brukes i tabell 2 sammen med struktur navnene gitt. Den relative endringen i nivået av trianntennary N-bundet glykan med et enkelt ytre arm fukose rest (A3F [3] G3) (B) og kjernen fucosylated bianntennary glykan (F [6] A2G2) (C) i normal til cirrhose og cirrhose i HCC er vist som prosent endring. Som denne figuren viser, er økninger i ytre arm fucosylation assosiert med både skrumplever og HCC, mens økt kjerne fucosylation er bare observert med HCC.
Analyse av Fucosylated A1AT av lektin-FLISA i en kohort av 458 pasienter
for ytterligere å undersøke om de endringer i både kjerne og ytre arm fucosylation kan sees hos enkelte pasienter og potensielt brukes som en diagnostisk markør for kreft, analyserte vi en pasient kohort bestående av 458 pasienter for nivå fucosylated A1AT bruke en lektin-FLISA baserte analysen. I denne analysen ble A1AT tatt ved hjelp av et monoklonalt antistoff, og nivået av fucosylation ble bestemt ved bruk av fukose-bindende AAL. AAL gjenkjenner både ytre arm og kjerne fucosylated glykan. Tyve pasienter uten tegn på leversykdom ble benyttet som kontroller; 33 pasienter infisert med HBV hadde en ukjent grad av leverfibrose; 215 pasienter infisert med HCV hadde en ukjent grad av leverfibrose; 65 pasienter hadde skrumplever; 62 pasienter hadde andre leversykdommer; og 63 pasienter hadde leverkreft (tabell 1). Figur 3A viser det relative nivået av fucose lektin-reaktivt A1AT i de seks pasientgrupper. Verdiene er gitt som -doble økning i forhold til nivået i kommersielt innkjøpt «normal» sera. Den midlere og 95% konfidensintervall for gjennomsnittet er vist for hver gruppe. Vi fant en klar statistisk forskjell mellom HCC gruppe og alle andre grupper (P 0,0001), og mellom cirrhose gruppen og kontrollgruppen (p = 0,0173), men ikke mellom hvilke som helst andre grupper (figur 3A). Den midlere nivå av lektin-reaktive A1AT var 1,4 ganger (± 0,80) ovenfor sigma i kontrollgruppen, 1,7-fold (± 0.1.8) i gruppen infisert med HBV, 1,9-ganger (± 1,8) i gruppen infisert med HCV, 2,6 ganger (± 2.3) i gruppen med skrumplever, 2,6 ganger (± 2.0) i gruppen med andre leversykdommer, og 7,70 ganger (± 4,45) i gruppen med HCC. Overraskende, var det ingen forskjell i det midlere nivå av AAL-reaktive A1AT i HCC pasienter i forhold til fasen av HCC (data ikke vist). Det vil si pasienter med stadium 1 HCC, slik det er definert som en enkelt lesjon på mindre enn 2 cm [11], hadde en 9,1 ganger (± 4,70) økning i nivået av AAL reaktiv A1AT mens pasienter med stadium 4 HCC (de med flere lesjoner 6cm i diameter) hadde et gjennomsnitt på 6,7 ganger (± 5,54), som ikke var annerledes enn det som ble observert i fase 1 pasienter (
p
= 0,114)
i denne kohorten, fucosylated. A1AT kunne skille mellom HCC og ikke-HCC tilfeller med et areal under (AUROC) av 0,871 mottakeren operatør kurve. Når man sammenligner bare HCC versus skrumplever, diskriminerende evne var 0,867. Ved hjelp av en cut-off av 5 relative enheter Aal reaktiv A1AT kunne skille HCC fra skrumplever med en sensitivitet på 70% og en spesifisitet på 86%. Når analysert i denne kohorten hadde i motsetning til AFP en AUROC av 0,764 og kunne skille HCC fra skrumplever med en sensitivitet på 59% og en spesifisitet på 93% med en cut-off på 20 ng /ml.
falske positiver har økte nivåer av Ytre Arm Fucosylation Mens Kjerne Fucosylation er spesifikk for HCC
Noen pasienter har ikke kreft, men har forhøyede nivåer av lektin-reaktivt A1AT (figur 4A). Fordi vi observerte endringer i ytre arm fucosylation på A1AT fra pasienter med skrumplever, det var av interesse å finne ut om de med falske positive resultater hadde kjerne eller ytre arm fucosylation. Figur 4A viser resultatene av analyse glykan fra renset A1AT fra tre pasienter med cirrhose (av ni) og tre pasienter med stadium 1 eller 2 HCC (ut av ni) og analysert som før. Resultatene fra disse pasienter er vist i figur 4A, og en representant glykan profil av en av disse pasientene er vist i figur 4B, sammen med nivået av 4 store sukkerstrukturer indikert. Som figur 4B viser, i samsvar med de resultatene som er presentert i tabell 2 og i figur 3A-3C, er de tre pasienter med cirrhose har nivåer av kjernen fucosylation (F (6) A2G2) tilsvarende de som ble observert hos friske kontroller. Men disse pasientene har betydelige økninger i ytre arm fucosylation (A3F (3) 1G3), i likhet med de høyeste nivåene hos pasienter med HCC. Det vil si at nivået av den ytre arm fucosylation i disse pasientene varierte fra 10% til 17%, som er lik nivået observert hos pasienter med HCC (13%). I motsetning hadde tre pasienter med HCC som hadde veldig sterke positive resultater fra lektin FLISA test økt kjerne og ytre arm fucosylation. For eksempel, i kjernen fucosylated bianntennary glykan representerte 9,55% på A1AT renset fra pasient H27. På samme måte representerte dette sukker mer enn 9% på A1AT renset fra pasienter H18 og H23. Økninger i ytre arm fucosylation spenner fra 14,03% til 15,97% av de totale sukker på A1AT ble også observert hos disse pasientene. Figur 4D viser resultatene av alle 18 pasienter med en vekt på nivået av den ytre arm (α-1,3) og kjerne (α-1,6) fucosylation. Når du undersøker alle 9 cirrhosepasienter falske positiver gjennomsnittsnivå av kjerne fucosylation var 3,77% ± 0,25 og gjennomsnittlig nivå på ytre arm fucosyalation var 11,88% ± 2,79. I tilfelle av kreft det midlere nivå av kjerne fucosylation var 8,62% ± 1,2 og det midlere nivå av den ytre arm fucosylation var 14,26% ± 1,9. Det var statistisk forskjell mellom nivået av kjernen α-1,6 fucosylation mellom disse ni cirrhose og ni HCC pasienter (p 0,0001), men ikke med α-1,3 bundet fucosylation (p = 0,07). Viktigere, det høyeste nivået av kjerne fucosylation observert i de falske positive cirrhotiske pasienter var 4,01%, tilsvarende det som ble observert hos friske kontroller (3,62%).
(A) Graden av lektin-reaktivt A1AT hos pasienter med HCC, HBV-infeksjon, hepatitt C-smitte, eller andre leversykdommer (OLD) og kontroller. Den heltrukne linje representerer gjennomsnittsverdien. X-aksen representerer den pasientgruppen. Y-aksen viser den -doble økning lectin-reaktive A1AT sammenlignet med den i kommersielt innkjøpt serum. (B) Glycan analyse av A1AT isoform M4 fra pasient 21. (C) Kvantifisering av sukker analyse fra tre cirrhosepasienter (01,21 og 27) og tre pasienter med stadium 1 eller 2 HCC (HCC-23, HCC 27 og HCC 18 ). Nivåene av 4 store sukkerstrukturer vises. Som denne figuren viser, i cirrhose falske positiver, det er en økning i ytre arm, men ikke kjernen fucosylation. I overensstemmelse med data som er vist i figurene 2 og 3 ble økninger i kjernen fucosylation på AAT kun observert fra pasienter med HCC. (D) Scatter tomt på nivået av α-1,3 eller a 1,6 knyttet fucose fra 9 cirrhosepasienter falske positiver og 9 pasienter med stadium 1 eller 2 HCC.
Diskusjoner
Nye rapporter har antydet at økt kjerne og ytre arm fucosylation kunne observeres etter glycomic analyse av enten total humant serum eller serum utarmet med hensyn til immunglobulin [18], [19], [25]. Vi undersøkte glykosylering av et enkelt protein, A1AT, som en funksjon av levercirrhose og leverkreft. For å oppnå dette, fant vi noen endringer som var i samsvar med våre tidligere funn for eksempel en økning i kjerne fucosylation samt endringer i ytre arm fucosylation.
Observasjonen at endringer i både kjerne og ytre arm fucosylation oppstår kan gi ledetråder til den molekylære grunnlaget for denne endringen. Det vil si, selv om de nøyaktige mekanismer for økt kjerne fucosylation i HCC er ikke kjent, de er antatt å involvere en økning i både nivået av enzymet og de substrater som er involvert i kjernen fucosylation [17].
Det er også mulig at disse markørene reflektere noen endring i Golgi-apparatet. Nyere rapporter har antydet at, i forhold til leveren, er involvert i protein sortering til gallen [26] den fucosylation av proteiner. Således er det tenkelig at utseendet på fucosylated proteiner i serumet kan reflektere en felles mangel på protein sortering. Det er interessant å merke seg at glykosylering av A1AT i serum hos pasienter med leverkreft (figur 2, 3 og 4) er lik den som er observert i gallen av friske individer [26].
Det er også interessant å merke seg at lektin reaktivitet var større enn den totale endringen observert i fucosylation. For eksempel, pasient 27 hadde enten kjerne eller ytre arm fucose på 22,82% av hans eller hennes N-koblede glykaner. I motsetning til dette A1AT fra en frisk person hadde fukose (kjerne eller den ytre arm) på 9% av de N-bundne glykaner. Derfor bruker lektin FLISA, vi burde ha observert nærmere en 2,5-dobling og ikke den 11-gangers økning som ble oppnådd. Denne forskjellen kan være en gjenstand av lektin-FLISA, resultatet av andre proteiner knyttet til A1AT, økt eller endret O-glykosylering, eller økt tilgjengelighet av lectin til fucose rester. Alle disse mulige scenarier er under etterforskning.
Det er også viktig å merke seg at økt ytre arm fucosylation ble observert både hos pasienter med cirrhose og hos pasienter med HCC. Dette funn antyder at den ytre arm fucosylation var ikke spesifikk for kreft, men snarere er sannsynligvis assosiert med inflammasjon, først fra levercirrhose og deretter fra tilstedeværelsen av HCC lesjon. Faktisk, kan nivået av den ytre arm fucosylation være en mer spesifikk markør for inflammasjon og kan forutsis kreftutvikling [27], [28]. I motsetning til dette, er en økning i kjerne fucosylation kun observert i pasienter med HCC, hvilket antyder at denne endringen er kreft spesifikk.
I figur 4A viser, har mange pasienter i de ikke-HCC grupper forhøyede nivåer av lektin-reaktive AAL . Analyse av tre pasienter med forhøyede AAL nivåer fra skrumplever gruppe indikerte at de hadde endringer først og fremst i ytre arm fucosylation, ikke i kjerne fucosylation. For dette formål, kan kjernen fucosylation være et mer konkret mål for påvisning av kreft [29].
