Abstract
Bakgrunn
Curcumin hemmer veksten av kreftfaren cellelinjer; derimot, er virkningsmekanismen ikke er godt forstått. Det blir stadig klarere at avvikende aktivering av Notch signalering har vært assosiert med utvikling av spiserørskreft. Her har vi fastslått at curcumin hemmer kreftfaren vekst via en mekanisme formidlet gjennom Notch signalveien.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien, viser vi at curcumin behandling resulterte i en dose og tidsavhengig inhibering av proliferasjon og kolonidannelse i spiserøret kreftcellelinjer. Videre curcumin behandling apoptose gjennom kaspase 3 aktiveringen, bekreftes av en økning i forholdet mellom Bax til BCL2. Cellesyklusanalyse viste at curcumin behandling indusert celledød og ned regulerte cyklin D1-nivåer. Curcumin behandling også resulterte i redusert antall og størrelse på esophagospheres. Videre curcumin behandling førte til redusert Notch-en aktivering, uttrykk for Jagged-en og dens nedstrøms mål Hes-en. Denne reduksjonen i Notch-1-aktivering ble fastslått å være på grunn av den nedregulering av kritiske komponenter av y-sekretase komplekse proteiner som presenilin 1 og Nicastrin. Kombinasjonen av en kjent γ-sekretase inhibitor DAPT og curcumin ytterligere redusert proliferasjon og apoptose i esophageal kreftceller. Til slutt, curcumin behandling ned-regulere uttrykk for Notch-en spesifikk microRNAs MIR-21 og MIR-34a, og oppregulert tumor suppressor la-7a miRNA.
Konklusjon /Betydning
Curcumin er et potent hemmer av esophageal kreft vekst som er rettet mot de Notch-1 aktive y-sekretase komplekse proteiner. Disse dataene tyder på at Notch signale hemming er en ny virkningsmekanisme for curcumin under terapeutisk intervensjon i esophageal kreft
Citation. Subramaniam D, Ponnurangam S, Ramamoorthy P, Standing D, Battafarano RJ, Anant S, et al . (2012) Curcumin induserer celledød i kreftfaren cellene gjennom Moduler Notch signalering. PLoS ONE 7 (2): e30590. doi: 10,1371 /journal.pone.0030590
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 31 oktober 2011; Godkjent: 19 desember 2011; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Subramaniam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av NIH tilskudd. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er den åttende vanligste hendelsen kreft i verden og sjette i kreftdødelighet [1]. I USA, 4-10 i 100.000 personer bukke under for sykdommen per år og den totale forekomsten av sykdommen er høyest hos menn over 50 år [2]. The American Cancer Society (ACS) anslått at i 2011, ville 16,980 amerikanere (13,450 menn og 3,530 kvinner) diagnostisert med spiserørskreft. ACS estimerte også at flertallet av disse personene [14, 710 amerikanere (11,910 menn og 2800 kvinner)] ville dø av spiserørskreft i 2011 [3]. Esophageal adenokarsinom, den viktigste formen for spiserørskreft i USA, er den raskest økende kreft i den vestlige verden. Det er generelt diagnostiseres på et sent stadium, og har en dårlig prognose, med et 5 års overlevelse på mindre enn 10%. Selv om den nåværende behandling omfatter kjemoterapi, strålebehandling, og, om mulig, esophagogastric reseksjon, mange pasienter med esophageal adenokarsinom erfaring progresjon av sykdom til tross for en slik behandling, hvilket antyder at slike svulster er resistente mot standardbehandling.
Fordi konvensjonell terapi , inkludert kirurgisk fjerning, kjemoterapi og strålebehandling er ofte mangelfull i behandling av denne sykdommen, nye behandlingsalternativer er kritisk nødvendig. Til tross for fremvekst av nye målrettede midler og bruk av ulike terapeutiske kombinasjoner, ingen behandling er tilgjengelig som er kurativ i pasienter med fremskreden kreft. Størrelsen av dette problem pålegger å behov for nye terapeutiske midler, spesielt for anvendelse av midler for kjemoprevensjon. Dette er mest attraktive for esophageal adenokarsinom siden en pre-ondartet tilstand -Barrett øsofagus er en godt anerkjent lesjon.
Curcumin, en fyto-polyfenoliske pigment utledet fra gurkemeie (
Curcuma longa
), har vist seg å ha flere kreft effekter, inkludert hemming av proliferasjon, induksjon av apoptose, hemming av angiogenese og inhibering av DNA-topoisomerase II [4]. Curcumin induserer også apoptose uavhengig døden som autofagi i esophageal kreftceller [5]. Nyere studier har vist at curcumin fremmer apoptose, øker kjemosensitivitet, og hemmer NF-kB i esophageal adenokarsinom [6] [7].
Notch signalering spiller en avgjørende rolle i utviklingen og homeostase av vev ved å regulere celle- skjebne beslutninger, spredning, differensiering og apoptose. Notch signalveien er innblandet i stamcelleselvfornyelse, celle skjebne besluttsomhet, spredning, differensiering og apoptose [8]. Hakk signale oppregulert i esophageal kreftformer og har vært foreslått som et terapeutisk mål for kreft esophageal [9] [10]. Hakk signalering blir initiert når et hakk ligand samvirker med et hakk transmembrane reseptor på en tilstøtende celler [11] [12]. Denne prosessen starter vanligvis γ-sekretase mediert proteolytiske frigjøring av Notch intracellulære domenet (NiCd), som i sin tur translocates inn i kjernen av celler [13]. NiCd i kjernen samhandler med C promoter-bindende faktor-1 (CBF1) transkripsjonen kofaktor og transaktiverer målet gener, slik som de i hårete og enhancer av split (HMS) og Hes beslektet med YRPW motiv (Hey) familier [ ,,,0],12] [14]. Nyere studier har vist en sammenheng mellom curcumin, Notch og NF-kB. Notch-en signalveien er direkte vist å bli aktivert av NF-kB i orale kreftceller [15]. Videre curcumin-mediert inhibering av Notch-1-aktivering har også ført til nedregulering av NF-kB og dets målgener, inkludert Bcl-2, cyclin D1, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og matriksmetalloproteinase -9 (MMP-9 ) i muntlig plateepitelkarsinom celler [4].
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA som binder til 3 «ikke-translatert område (UTR) av beslektede messenger RNA (mRNA) via fullstendig utfyllende eller ufullkommen baseparings undertrykke oversettelse eller redusere stabiliteten av de bundne mRNAer [16]. Noen mirnas rapporteres som oncomirs som kan fungere enten som onkogener eller tumor suppressors [17]. For eksempel, MIR-21 avtar tumor suppressor Pdcd4 uttrykk og fremmer invasjon, intravasation og metastase i kolorektal kreft [18]. Oppregulering av MIR-21 er sterkt assosiert med både en høy Ki-67 proliferative indeks og nærvær av levermetastaser [19]. MIR-21 også regulert PTEN-avhengige sti og berørte cellevekst, migrasjon og invasjon av leverkreft [20]. Nylig har vi demonstrert mirnas som biomarkører for Barretts øsofagus progresjon. MIR-21 er oppregulert 12.57-fold i spiserørskreft [21]. Et annet viktig miRNA er MIR-34, som er blitt funnet å delta i reguleringen av p53 og Notch baner i samsvar med tumor suppressor aktivitet [22]. En fersk studie viste at det er en krysstale mellom miRNA og Notch signalveier i tumor utvikling og progresjon [23]. Videre Notch signalering og dens regelverk er kritisk viktig ved nivået for post-transkripsjonelle og /eller translasjonelle regulering av gener ved mirnas i glioblastom [24]. På den annen side, la-7a avtar celleproliferasjon og migrasjon av glioblastom og reduserer tumorstørrelse i xenograft modell [25].
I denne artikkelen, har vi bestemt effekt av curcumin på esophageal kreftceller og mekanisme mediert gjennom Notch signalveien.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
TE-7, TE-10 er menneskelig og ESO-1 er muse esophageal adenokarsinom kreftceller som var vennligst tilveiebrakt av Dr. Richard J. Battafarano, University of Maryland og dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1% antibiotisk-anti-mykotisk oppløsning (Mediatech Inc, Manassas, VA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Curcumin ble kjøpt fra LKT Laboratories, St. Paul, MN. N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) ble kjøpt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
spredning og apoptose analyser
for å vurdere spredning, celler ble sådd på 96 brønners plater og vokse over natten. Deretter ble cellene behandlet med økende doser av curcumin i 10% FBS inneholdende RPMI 1640. Analyse av celleformering ble utført ved enzymatisk analyse som beskrevet [26]. For apoptose, ble caspase 3/7 aktivitet målt ved hjelp av Apo-en homogen Caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI).
Colony formasjon analysen
Kort, 6 godt rettene ble sådd med 500 levedyktige celler og fikk vokse i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert i nærvær eller fravær av 30 pM curcumin i 24 timer. Curcumin inneholdende medium ble deretter fjernet, og cellene ble vasket i PBS og inkubert i ytterligere 10 d i fullstendig medium. Hver behandling ble utført i triplikat. De oppnådde koloniene ble vasket med PBS og fiksert i 10% formalin i 10 min ved romtemperatur og deretter vasket med PBS etterfulgt av farging med krystallfiolett. Koloniene ble tellet og sammenlignet med ubehandlede celler.
Cell syklusanalyse
Celler ble behandlet med 30 pM av curcumin i 12 og 24 timer, deretter ble cellene trypsinert og suspendert i fosfatbuffret saltløsning ( PBS). Enkeltcellesuspensjoner ble fiksert med 70% etanol i 2 timer, og deretter permeabilisert med PBS inneholdende 1 mg /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) og 2 pg DNase-fri RNase (Sigma-Aldrich) ved romtemperatur. Flowcytometri ble gjort med en FACSCalibur analysator (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), fange 10.000 hendelser for hver prøve. Resultatene ble analysert med ModFit LT ™ programvare (Verity Software House, Topsham, ME).
Real Time Reverse-transkripsjon Polymerase Chain Reaction Analyse
Total RNA isolert fra TE-7 celler ved hjelp TRIZOL reagens ble reverstranskribert med Superscript II revers transkriptase i nærvær av tilfeldige primere hexanucleotide (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA). Komplementære DNA ble deretter anvendt for Real Time PCR ved bruk Jump Taq DNA-polymerase (Sigma-Aldrich) og SYBR grønn flekk nukleinsyre (Molecular Probes, Eugene, OR). Som krysser terskelverdiene for de enkelte gener ble normalisert til p-aktin. Endringer i mRNA uttrykk ble uttrykt som ganger endring i forhold til kontroll. Primerne anvendt i denne undersøkelsen var som følger: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 «og 5′-ATCATTCTCCTCCTCAGCG-3′; Cyclin D1: 5»-AATGACCCCGCACGATTTC-3 «og 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3′; Notch-1: 5»-CACTGTGGGCGGGTCC-3 «og 5′-GTTGTATTGGTTCGGCACCAT-3′; Hes-1 5»-AGGCGGACATTCTGGAAATG-3 «og 5′-CGGTACTTCCCCAGCACACTT-3»; Presenilin-1 5 «ATCATGCTCTTTGTCC-3′ og 5»- TCTTCTGTGAATGGG-3 «; Nicastrin 5»-CAGATTGGCTGCCAGT-3 «og 5′-CTCCAGCAGAACCAT-3».
miRNA analyse
Totalt miRNA ble isolert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Ambion Inc, Grand Island, New York) . Total miRNA isolert fra TE-7-celler ble utsatt for revers transkripsjon med Superscript ™ II RNase H-revers transkriptase og tilfeldige hexanucleotide primere (Invitrogen). CDNA ble senere brukt til å utføre Real-time PCR ved SYBR kjemi (SYBR® Grønn I; molekylære prober) for først og
la-7a
transkripsjon bruker spesifikke primere og Jumpstart Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich, St. . Louis, MO). Overfarten terskelverdien vurderes av Real time PCR ble kjent for
pri-la-7a
miRNA og normalisert med
U6
pri-miRNA. Endringene i pri-miRNA ble uttrykt som ganger endring i forhold til kontroll med ± SEM verdi. Primere som brukes er:
pri-U6
: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 «og 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3»,
pri-la-7a
: 5′-GAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAA-3 «, 5»-AAAGCTAGGAGGCTGTACA-3 «. Pri-MIR-34 et 5»-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3 «og 5′- GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3′, pri-MIR-21.: 5»-GCTTATCAGACTGATGTTGACTG-3 «og 5′-CAGCCCATCGACTGGTG-3»
Western blot-analyse
Cellelysater ble underkastet polyakrylamidgel-elektroforese og blottet på Immobilon-P polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA). Notch-en, caspase 3, ble BCL2 og Bax antistoffer kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Cyclin D1, Notch-en, Jagged-en, Hes-en og Actin antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, California). Presenilin 1, 2, ble Nicastrin, APH1 og Pen2 antistoffer fra GenScript Inc (Piscataway, NJ) og spesifikke proteiner oppdaget av den forbedrede chemiluminescence system (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
spheroid analysen
for dannelsen av sfæroider, ble cellene dyrket i RPMI 1640 (Mediatech) supplert med 20 ng /ml bFGF (Invitrogen) 10 ml pr 500 ml 50X B27 supplement (Invitrogen) EGF 20 ng /ml (Invitrogen) og antibiotika og antimykotiske løsning. Celler ble utsådd ved lav tetthet (5000 celler /ml) i 6 også dårlig feste platene. Cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av curcumin (0-50 uM). Etter 7 dager kulene ble fotografert.
immunfluorescens farging
Cellene ble platet over natten på cover-slips på seks brønns plater. Etter behandling med 30 uM av curcumin i 24 timer, ble cellene deretter fiksert med paraformaldehyd i 15 minutter, renset med PBS og inkubert med 2% bovint serumalbumin i PBS i 30 min. Cellene ble deretter inkubert over natten med anti-Notch-1, anti-taggete-1, anti-Hes-1, anti-presenilin 1 og anti-Nicastrin antistoff, respektivt. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med Cy-3-konjugert sekundært antistoff i 30 minutter og vasket med PBS. Celle bilder ble observert under et fluorescerende mikroskop.
Statistisk analyse
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Data ble analysert ved anvendelse av en uparet 2-tailed t-test.
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Curcumin hemmer kreftfaren cellevekst
Vi bestemte effekten av curcumin på esophageal cancer celleproliferasjon i en rekke forskjellige dyrkede cellelinjer (TE-7, TE-10 og ESO-1). Curcumin undertrykte betydelig spredning av esophageal kreft cellelinjer TE-7, TE-10 og Eso-1 i dose og tidsavhengig måte. Denne anti-spredning effekt på tumorceller ble observert i løpet av en 24 timers periode, som fortsatte å øke i løpet av de neste 72 timer (figur 1A). For å bestemme langtidsvirkningen av curcumin behandling, ble cellene behandlet med 30 uM curcumin i 24 timer, hvoretter cellene ble tillatt å vokse i normal media. Curcumin behandling trykkes kolonidannelse i alle spiserørskreft cellelinjer (figur 1B), noe som tyder på at curcumin effekt på tumorcellene var irreversibel. Cyclin D1 er en cellesyklusregulerende proteiner som regulerer G1 til S-fase overgang av cellesyklusen, og fungerer som en kofaktor for flere transkripsjonsfaktorer i en rekke cellelinjer. Dette cyclin danner et kompleks med, og fungerer som regulatorisk subenhet av CDK4 og CDK6, hvis aktivitet er nødvendig for G1 /S overgang. Cyclin D1 overekspresjon har vært knyttet til utvikling og progresjon av kreft [27]. Curcumin behandling inhiberte cyklin D1 mRNA og protein ekspresjon tyder på at det hemmer kreftcelle-proliferasjon. På den annen side, ble ekspresjon av p21-protein økes (figur 1C og D).
(A) Curcumin inhiberer proliferasjon av esophageal kreftceller. Celler ble inkubert med økende doser av curcumin (0-50 uM) i opptil 72 timer og analysert for celleproliferasjon. Curcumin behandling resulterte i en betydelig dose- og tidsavhengig reduksjon i celleformering i alle tre celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. (B) Curcumin hemmer kolonidannelse. Spiserørskreft-celler ble inkubert med 30 pM av curcumin i 24 timer og fikk vokse til kolonier i 10 dager. Inkubasjon med curcumin hemmer kolonidannelse. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Cyclin D1 er en cellesyklus regulatorisk protein og som er involvert i cellesyklus-stans. RNA fra TE-7 inkubert med 30 mikrometer curcumin ble utsatt for Real Time PCR for cyclin D1 mRNA uttrykk. Curcumin behandling hemmer betydelig cyclin D1 mRNA uttrykket (* p 0,05). (D) Lysater fra TE-7 inkubert med 30 pM curcumin ble analysert ved western blotting for cyklin D1-ekspresjonsnivåer ved bruk av mus anti-cyclin D1 antistoff. Curcumin behandling hemmer cyclin D1 protein uttrykk.
Curcumin induserer celledød ved apoptose
Gitt effekten av curcumin på undertrykkelse av spredning og kolonidannelse, neste fastsatte vi om curcumin påvirker cellesyklus progresjon. Behandling med curcumin vesentlig indusert celledød av TE-7-celler i løpet av 12 timer og kontinuerlig økes til 24 timer (figur 2A). Slike tilsvarende økninger i celledød har blitt observert i andre celletyper [28]. Curcumin er kjent for å indusere apoptose i forskjellige kreftceller. De caspases er en familie av proteiner kjent for gjennomføring av apoptose. Kaspase-3 og kaspase-7 er viktige effektor molekyler som er kjent for å indusere apoptose i forskjellige kreftceller ved å forsterke signalet fra initiator kaspaser, som for eksempel caspase-8 eller caspase-10. Økt aktivering av effektor kaspase-3 og kaspase-7 ble observert i løpet av 24 timer i TE-7-cellelinjen ble behandlet med curcumin noe som tyder på induksjon av apoptose (figur 2B). Western blot analyser av TE-7 cellelysater viser en signifikant reduksjon i procaspase-3 i curcumin behandlede tumorceller (figur 2C). Ytterligere bekreftelse på at cellene ble gjennomgår apoptose ble oppnådd ved western blot analyser for anti-apoptotiske BCL2 og BclxL og pro-apoptotiske Bax proteiner. Curcumin behandling hemmet uttrykk for BCL2 og BclxL og økt Bax proteinnivåer. Disse data tyder på at curcumin er en potent induser av apoptose i esophageal kreftceller (figur 2D).
(A) Cell syklus analyse av curcumin behandlede celler. TE-7-celler ble behandlet med 30 pM av curcumin i 12 og 24 timer, undersøkes ved hjelp av strømningscytometri følgende propidiumjodidfarging for DNA-innhold. Curcumin behandling fører til økt antall døde celler. Grafer er representative for data samlet inn fra tre eksperimenter. (B) Curcumin induserer caspase-3, en apoptose mekler. TE-7 celler inkubert med 30 pM av curcumin ble analysert for apoptose av caspase-3 og 7-aktivering. Curcumin behandling økt antall celler som gjennomgår apoptose sammenlignet med ubehandlede kontroller (* p 0,05). (C) Lysater fra TE-7-celler inkubert med 30 pM av curcumin ble analysert ved western blotting for caspase-3-proteinnivåer ved å bruke kanin anti-kaspase-3 antistoff. Curcumin behandling resulterte i redusert procaspase-3. (D) Lysates fra TE-7 celler inkubert med 30 mikrometer av curcumin ble analysert ved western blotting for BCL2, BclxL, og Bax proteiner. Curcumin reduserer uttrykk for anti-apoptotiske proteiner BCL2 og BclxL, mens økt uttrykk av pro-apoptotiske proteiner i behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler.
Curcumin hemmer esophagosphere dannelsen
Gitt at curcumin hemmer colonosphere formasjon i tykktarm kreft celler og påvirker Notch signalveien proteiner. Vi Deretter ble virkningene av curcumin for spiserørskreft celle sfæroide formasjonen. Curcumin behandling inhiberte signifikant esophagosphere formasjon på en doseavhengig måte i både TE-7 og TE-10-celler (figur 3A). Den kuler størrelse, tallene ble regnet. Curcumin behandling redusert både primær og sekundær spheroid dannelse (figur 3B og C).
(A) TE-7 og TE celler ble dyrket i lavtheft plater og behandlet med økende konsentrasjoner av curcumin (0-50 mm) og utført for den sfæroide analysen. Etter en uke ble sfæroidene fotografert. (B) spheroid ble talt opp og utført søylediagram. Curcumin behandling betydelig hemmet esophageal kreftceller kuler (* p 0,05). (C) De primære sfæroider ble samlet opp og separert til enkeltceller og sådd ut. Curcumin behandling inhiberte signifikant esophageal kreftceller sekundære kuler (* p 0,05).
Curcumin hemmer Notch aktivering ved downregulating den γ-sekretase kompleks
Notch-1 er et cellemembranassosiert protein. Ligand inngrep fører til det intracellulære domenet av den transmembrane reseptor hakk (NiCd) for å bli spaltet fra membranen på grunn av virkningen av den γ-sekretase kompleks. NICD translocates til kjernen, der den knyttes til en familie av DNA-bindende proteiner for å aktivere transkripsjon av Notch målgener som hårete og enhancer-of-split 1 (
Hes1
) [29]. Vi bestemte effekten av curcumin på Notch-en, sin ligand taggete-en og Hes-1 i TE-7 celler. Curcumin behandling signifikant nedregulert Notch-en og dens ligand Jagged-en og nedstrøms target proteiner Hes-en både mRNA og proteinnivå (Figur 4A og B). Proteinnivåer ble bekreftet ved immun-fluorescens farging, hvor ble det observert signifikant lavere nivåer av kjernefysisk Notch-1 og cytoplasmisk taggete-1 i curcumin behandlede celler (figur 4C).
(A) i sanntid revers transkripsjon -PCR-analyse av totalt RNA fra TE-7 celler etter 30 uM av curcumin behandling i 24 timer viste reduksjon i ekspresjon av Notch-1, dets ligand taggete-1 og dets mål-genet Hes-1 mRNA (* p 0,05). (B) lysater fra curcumin behandling forårsaket signifikant reduksjon i ekspresjonen av spaltede Notch-1, dets ligand taggete-1 og dets målgenet Hes-1 proteinnivåene i TE-7-celler. (C) TE-7-celler behandlet med 30 pM av curcumin i 24 timer ble utsatt for immuno-fluorescent farging ved anvendelse av anti-Notch-1, anti-Ujevne-1 og anti-Hes-1-antistoffer. Curcumin behandling resulterte i lavere nivåer av Notch-1 protein i cellekjernen og redusert Jagged-en og Hes-1 uttrykk i TE-7 celler.
neste fastsatte den mekanismen som curcumin påvirker hakk en aktivering. γ-sekretase er et multi-proteinkompleks inneholdende en intramembran spalte protease. Komplekset har en voksende liste av proteiner underlag, inkludert de Notch reseptorer. De fire komponentene i γ-sekretase kompleks, presenilin 1, er Nicastrin, Pen2, og Aph1 alt tenkt å være vesentlig for aktivitet [13] [30] [31]. Det katalytiske domene ligger innenfor presenilin, mens Nicastrin har blitt foreslått for å være kritisk for substrat gjenkjennelse [32]. Curcumin behandling resulterte i nedregulering i ekspresjonen av y-sekretase komplekse proteiner, presenilin 1 og 2, Nicastrin, APH1 og PEN2 (figur 5A, B og C). Disse dataene tyder på at curcumin mediert nedregulering av den Notch signalveien skjer dels ved hemning av den γ-sekretase-komplekset.
(A) i sanntid revers transkripsjon-PCR-analyse av totalt RNA fra undervis- ning 7-celler etter 30 uM av curcumin behandling i 24 timer viste reduksjon i ekspresjon av presenilin 1 og Nicastrin mRNA (* p 0,05). (B) lysater fra curcumin behandling forårsaket signifikant reduksjon i ekspresjonen av y-sekretase komplekse proteiner presenilin 1 og 2, Nicastrin, APH1 og Pen2 proteinnivåene i TE-7-celler. (C) TE-7-celler behandlet med 30 pM av curcumin i 24 timer ble utsatt for immuno-fluorescent farging ved anvendelse av anti-presenilin 1 og anti-Nicastrin antistoffer. Curcumin behandling resulterte i lavere nivåer av presenilin en og Nicastrin uttrykk i TE-7cells.
Kombinasjon av curcumin og γ-sekretase kompleks hemmer DAPT videre påvirker kreftfaren vekst
Behandling med kombinasjon av curcumin og γ-sekretase kompleks inhibitor (GSI) DAPT videre hemmer Notch-en target proteiner Hes-en og cyclin D1 uttrykk (Figur 6A). Vi utførte kombinasjon av curcumin med en γ-sekretase kompleks inhibitor DAPT på spredning og apoptose. Kombinasjonen av curcumin og DAPT behandlingen videre hemmer proliferasjonen og induserer apoptose i TE-7-celler (figur 6B og C). Lignende resultater ble observert i TE-10 celler (data ikke vist).
(A) TE celler behandlet med DAPT (50 uM) og curcumin (30 uM) alene og i kombinasjon i 24 timer. Lysater ble analysert ved western blotting. Hes-1 og syklin D1-proteiner ble ytterligere redusert med kombinasjonen av de to forbindelsene. (B) TE celler behandlet med DAPT (50 uM) og curcumin (30 uM) alene og i kombinasjon i 48 timer. Celleproliferasjon ble signifikant hemmet etter behandling med kombinasjonen av DAPT og curcumin i forhold til hverandre curcumin alene ved hjelp av heksosaminidase enzymanalyse (*
P
0,05). (C) Apoptose ble signifikant indusert etter behandling med kombinasjonen av DAPT og curcumin i forhold til hverandre curcumin alene ved hjelp av Apo-en Homogen Caspase-3/7 Assay kit (*
P
0,05).
Curcumin hemmer oncomir miRNA og øker tumor suppressor miRNA i esophageal kreftceller
Curcumin endrer mikroRNA uttrykk i tykktarmen [33] bukspyttkjertel [34], bryst [35], blære [36] og lunge [37] kreftceller. Nylig har vi vist at mirnas som biomarkører for Barretts øsofagus progresjon og Mir-21 er oppregulert 12.57 fold i spiserørskreft [21]. Vi neste fastsatte effektene av curcumin på oncomir miRNA og tumor suppressor miRNA esophageal kreftceller. Curcumin behandling signifikant nedregulert MIR-21 og MIR-34a uttrykk mens upregulating la-7a miRNA uttrykket (Figur 7A og B).
(A) i sanntid revers transkripsjon-PCR analyse av total miRNA fra undervis- ning 7-celler etter 30 uM av curcumin behandling i 24 timer. Curcumin behandling signifikant hemmer oncomiR miRNA uttrykk i TE-7 celler (*
P
0,05). (B) Curcumin behandling signifikant oppregulert tumor suppressor la-7a miRNA uttrykk i TE-7 celler.
Diskusjoner
Esophageal kreft er en av de sjette viktigste årsakene til kreft relaterte dødsfall i den vestlige verden. Totale forekomsten av sykdommen er høyest i menn over 50 år [2]. Spiserørskreft blir vanligvis diagnostisert på et sent stadium, og har en dårlig prognose, med et 5 års overlevelse på mindre enn 10%. Den betydelige sykelighet, toksisitet og dårlige responsrate på dagens kjemoterapiregimer har ført til søk for mindre giftige alternative behandlingsformer. Vi og andre har vist at curcumin undertrykker proliferasjonen og induserer apoptose i en rekke tumorceller, deriblant bukspyttkjertel, bryst, tykktarm, oral, lunge, melanom, myelom, leukemi, og prostatakarsinom. Tidligere studier har vist at curcumin undertrykker spredning og øker apoptose i esophageal kreftceller [5] [6] [38] [39].
De data som presenteres i denne artikkelen viser at curcumin selektivt hemmer spredning av esophageal kreftceller, undertrykker dannelsen av esophageal kreftcellekolonier, fremmer cellesyklus og apoptose, hemmer esophagosphere formasjon, ned regulerer hakk signalering og dets y-sekretase komplekse proteiner, og også hemmer oncomir miRNA uttrykk og induserer tumor suppressor miRNA uttrykk. Disse resultatene er videre presentert i det skjematiske diagrammet i figur 8. Våre resultater viser at curcumin effektivt kan undertrykke celledeling i løpet av 24 timer. Videre er de hemmende effekter på tumorceller synes å opprettholdes og irreversible etter 24 timers behandling. Våre data med cyklin D1 er interessant ved at det var en reduksjon i dens ekspresjon ved 24 timer. Dette burde ha resultert i celler som gjennomgår G0-G1 arrest siden protein er ansvarlig for progresjon gjennom G0-G1 /S fase overgang [40]. Lignende curcumin-indusert G0 /G1 arrest har også vist seg å forekomme i andre kreftcelletyper, inkludert tykktarm og mage kreft, og i mantle celle lymfom [28] [41]. Faktisk ble det observert en betydelig økning i døde celler i esophageal kreftcellene selv ved 12 timer etter inkubering med curcumin, som deretter ført til celledød.
Vårt studier viser at curcumin inhiberer ekspresjon av taggete-1 og Notch-1 reseptoren. Curcumin hemmer også y-sekretase komplekse proteiner, for derved å inhibere spaltning av Notch-reseptor. Som et resultat, er det hakk intracellulære domenet (NiCd) ikke frigjøres og derfor ikke translocate til kjernen for å aktivere den nedstrøms målgener c-myc og cyclin D1. Dette resulterer i hemning av celleproliferasjon og stamcelle regenerering, mens samtidig induksjon av apoptose.
I foreliggende studie har vi også funnet at curcumin ned regulerer Notch signalisering gjennom inhibering av den γ-sekretase kompleks. Curcumin hemmer Notch-1 og dets ligand taggete-1 i esophageal kreftceller. Vi fant også at curcumin hemmet uttrykk for Notch-en nedstrøms mål
Hes-en
. Nylig er det blitt rapportert at hakk reaksjonsveien spiller avgjørende roller i prosesser av tumorcelle-proliferasjon, apoptose og stamcelle vedlikehold, og er nært forbundet med tumorgenese i esophageal kreftceller [42]. Derfor kan curcumin formidlet hemming av cellevekst delvis mediert via inaktivering av Notch-1-aktivitet. Dette ble ytterligere bekreftet ved kombinasjonen av en GSI og curcumin, noe som ytterligere inhibert proliferasjon og apoptose. På tilsvarende måte, kombinasjonen av curcumin med en GSI ytterligere inhiberte Hes-1 og cyclin D1 uttrykk. Imidlertid er Notch-1 ikke er den eneste vei aktive i spiserørskreft som mange andre cellulære veier er aktivert [7] [39]. Det ville være interessant å fastslå om curcumin er like potent ved inhibering av andre signaloverføringsveier. I tillegg vil det være av interesse å bestemme hvorvidt ektopisk ekspresjon av Notch nedstrøms målgener som Hes-1 og c-myc i tilstanden av Notch knockdown eller redning beskytter mot curcumin-mediert celledød.
Notch signale er nødvendig for stamcelleselvfornyelse og opprettholdelse av stemness [43]. En metode som vanligvis brukes til å demonstrere stemness er fremveksten av kuler i ultra-lave bindende vev kultur retter.
