Abstract
microRNAs har vært innblandet i regulering av flere cellulære signalveier av tykk- og endetarmskreft (CRC) celler. Selv om nye bevis viser at mikroRNA (MIR) -106a uttrykkes sterkt i primærtumor og avføringsprøver av CRC pasienter; hvorvidt MIR-106a formidler kreft metastase er ukjent. Vi viser her at Mir-106a er sterkt uttrykt i metastatisk CRC celler, og regulerer kreft celle migrasjon og invasjon positivt
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse fenotyper ikke involverer konfunderende påvirkninger på kreftcelle spredning. MiR-106a hemmer uttrykk for
transformerende vekstfaktor-β-reseptoren to plakater (
TGFBR2
), som fører til økt CRC celle migrasjon og invasjon. Viktigere er MIR-106a uttrykk nivåer i grunnskolen CRC korrelert med progresjon klinisk kreft. Disse observasjonene tyder på at Mir-106a hemmer anti-metastatisk mål direkte og resultater i CRC celle migrasjon og invasjon
Citation. Feng B, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et al. (2012) tykktarmskreft migrasjon og invasjon Initiert av mikroRNA-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10,1371 /journal.pone.0043452
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 17 august 2012
Copyright: © Feng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser føre til ca 90% av tykk- og endetarmskreft ( CRC) -relaterte dødelighet, men de underliggende mekanismene er fortsatt i stor grad uklart [1]. Metastase er en kompleks, flere prosesser der CRC celler invadere omkringliggende vev, intravasate inn i blodkar, translocate gjennom systemisk sirkulasjon, ekstravasere inn i parenchyma av fjerne vev (lever og lunger), etablere mikrometastaser, og danne makroskopiske sekundære svulster [2]. I de senere årene har flere studier blitt gjennomført for å undersøke genene og deres produkter som er involvert i metastase [3] -. [7] Hotell
microRNAs (miRRNs) omfatter et evolusjonært bevart klasse av små RNA som kan stillhet genuttrykk post-transcriptionally gjennom sekvensspesifikke interaksjoner med 3-utranslaterte regioner (UTR) av beslektede mRNA mål [8]. Nylig har rollen for mirnas i etableringen og utviklingen av CRC bli avdekket. Større enn 50% av miRNA gener er lokalisert i skjøre kromosomale regioner som er endret i løpet av tumorprogresjon [9], og noen mirnas har blitt identifisert som onkogener eller tumorsuppressorgener i CRC [10] – [14]. I tillegg har expression profilering analyse viste karakteristiske miRNA signaturer som kan forutsi de kliniske resultatene av CRC [15], [16]
MIR-106a. (MiRBase: MIMAT0000103) har vist seg å være sterkt uttrykt i kreft vev og avføringsprøver av CRC pasienter [16] – [18]; imidlertid, er den nøyaktige rollen MIR-106 i CRC ukjent. Vi korrelert derfor MIR-106a med CRC migrasjon og invasjon, i håp om at en slik forening kan gi innsikt i de mekanismer som CRC celler metastasize.
Resultater
MIR-106a er høyt uttrykt i metastatisk CRC Cells
Vi først bestemmes nivåene av MIR-106a uttrykk i en rekke menneskelige CRC celler. Etter avtale med tidligere rapporter [16] – [18], MIR-106a var oppregulert i alle seks menneske CRC-cellelinjer i forhold til spontant udødeliggjort, normale menneskelige kolon epitelceller (NCM640; Fig 1A.). MIR-106a ble mer sterkt uttrykt i mer invasive celler i forhold til celler med mindre invasiv kapasitet (fig. 1A og B). For eksempel nivået av uttrykk for MIR-106a var ni ganger høyere hos de mer invasive SW480 cellelinje enn mindre invasiv HT29 cellelinje.
A, Real-time RT-PCR analyse av MIR-106a ekspresjon i udødeliggjorte, normale humane kolon epitelceller og en rekke av CRC-celler. U6 small nuclear RNA ble anvendt som en intern kontroll. En representant forsøket er vist i tre eksemplarer, og viser linjene standardfeil. B, invasiv muligheten for en serie av CRC-celler bestemt ved Matrigel invasjons analyser. Et representativt forsøk in triplo er vist, sammen med standardfeil. C, Western blot-analyse av N-cadherin, E-cadherin, vimentin, og ZEB1 ekspresjon i CRC-celler. D, kvantitativ analyse med bilde forsterker.
n
= 3,
barer, etter ± SD.
Videre uttrykk for epitel-mesenchymale overgang (EMT) markører (E-cadherin, N- cadherin, vimentin, og ZEB1) ble bestemt ved Western blot-analyse. EMT kan betraktes som en patologisk prosess som bidrar til kreft progresjon, særlig når det gjelder invasjon og metastasering. Som vist på fig. 1C og D, er nivået av ekspresjon av E- og N-cadherin variert mellom syv cellelinjer. E-cadherin ble uttrykt i NCM640 og fem CRC cellelinjer, men ikke SW480, og mer sterkt uttrykt i NCM640, HT29, SW620, og LoVo. N-cadherin, vimentin, og ZEB1 uttrykk var lavere i de fire cellelinjer.
De to CRC cellelinjer, RKO og SW480, som har den høyeste invasjonen potensial, utstilt gående lav uttrykk for E-cadherin og høy uttrykk for N-cadherin, vimentin, og ZEB1.
MIR-106a Starter CRC Cell migrasjon og invasjon
in vitro
neste foretok
in vitro
tap-av-funksjon analyser for å avgjøre hvilken rolle MIR-106a i CRC celle migrasjon og invasjon. MIR-106a ble stille
in vitro
via anti-sense oligonukleotider, da nivåene av uttrykket ble bestemt ved real-time RT-PCR [19]. Vi fant at transfeksjon av MIR-106a anti-sense oligonukleotider i SW480 celler resulterte i 7,3 ganger lavere nivåer av MIR-106a uttrykk (Fig. 2A). Anti-sense inhibitorer av MIR-106a førte til en 2,5 gangers reduksjon i migrering av SW480-celler, som bestemt ved migrasjons assays
in vitro
, i forhold til (fig. 2B) styre oligonukleotider. MIR-106a hemmere forårsaket en 2,7-fold reduksjon i invasiv kapasitet på SW480 celler målt ved invasjon analyser
in vitro
sammenlignet med kontroll oligonukleotider (Fig. 2C). Viktigere, denne reduksjonen kan ikke tilskrives ødeleggelsen av mobilnettet levedyktighet (figur 2D, P . 0,05). Dermed disse observasjonene indikerer at MIR-106a er nødvendig for migrasjon og invasjon av disse mer metastatiske CRC celler
in vitro
, men ikke nødvendig for levedyktighet.
A, Nivåer av MIR-106a uttrykk i SW480 celler etter transfeksjon med hemmere av MIR-106a, som bestemmes av real-time RT-PCR-analyse. Data ble normalisert med U6 liten kjernefysiske RNA. Et representativt eksperiment i tre eksemplarer, sammen med standardfeil er vist. B, Transwell migrasjon analyser av SW480 celler transfektert med hemmere av MIR-106a eller kontroll vektorer. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer og stolpene betegner standardfeil. Også vist er fase-kontrast av SW480 celler migrerer gjennom membraner. C, Matrigel invasjonen analysene av SW480 celler transfektert med oligonukleotider mot Mir-106a eller kontroll oligonukleotider. Et representativt forsøk in triplo, i tillegg til standardfeil er vist. Fase kontrast av SW480 celler invadert gjennom membraner er også vist. D, Trypan blå eksklusjon analyse av SW480 celler med miRNA inhibitorer. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfeil. E, Real-time RT-PCR analyse av MIR-106a uttrykk i HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektorer. U6 small nuclear RNA blir brukt som en intern kontroll. En representant forsøket er vist i tre eksemplarer, og viser linjene standardfeil. F, Migrasjon potensialet NCM640 celler infisert med MIR-106a-uttrykker eller kontroll vektorer, som bestemmes av Transwell migrasjon analyser. Et representativt forsøk in triplo, i tillegg til standardfeil er vist. Fase-kontrast bilder av HT29-celler migrert gjennom membraner er også vist. G, Invasive potensialet i HT29 celler etter MIR-106a transduksjon eller kontroll vektor transduksjon målt ved Matrigel invasjonen analysene. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer og stolpene betegner standardfeil. Også vist er fase-kontrast av HT29 celler invadert gjennom membraner. H, Vekstkurver av HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektor
in vitro
. En representant forsøket er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfeil.
For å avgjøre hvorvidt overekspresjon av MIR-106a dratt trekkfugl og invasiv potensial på ikke-metastatisk eller mindre metastatiske CRC celler, vi klonet genomisk sekvens av det humane MIR-106a-genet inn i en mus stamcelleretrovirus-avledet vektor [20]. Vi brukte de resulterende vektorene for å uttrykke MIR-106a i udødelig NCM640 og HT29 celler med mindre metastatisk potensial. Vellykket transductions av MIR-106a ble konstatert ved real-time RT-PCR (Fig. 2E).
I begge disse to linjene, ektopisk uttrykk for MIR-106a forårsaket en betydelig økning i mobilnettet migrasjon og invasjon ( fig. 2F og 2G). En slik økning kan ikke være på grunn av den økte proliferative priser av disse cellene (figur 2 H, P . 0,05 for dag 0, 2, 4 og 6). Disse observasjonene tyder på at overekspresjon av MIR-106a er tilstrekkelig til å initiere migrasjon og invasjon av CRC celler
in vitro
.
MIR-106a Fremmer CRC Invasion
in vivo
Vi neste fastslått hvorvidt MIR-106a indusert invasjon
in vivo
. For dette formål overuttrykt vi MIR-106a i CRC-celler som er normalt mindre invasiv. Først implantert vi HT29 celler transduced med MIR-106a eller infisert med kontroll vektorer i naken mus subkutant. Mottaker mus vokste bemerkelsesverdig svulster innen 2 uker etter injeksjon, og ble døende i uke 8 etter injeksjon på grunn av svulst byrde når forsøket ble avsluttet.
Ved uke 4 etter implantering, svulster i MIR-106a-overekspresjon HT29 celler og tumorer i kontrollinfiserte celler var lik i størrelse, noe som tyder på at MIR-106a hadde en minimal effekt på primærtumorvekst (fig. 3A). Som forventet, svulster i kontrollceller var ikke-invasiv, vist som tumormasser trange innen fiber kapsler (Fig. 3B, venstre panel). I kontrast, svulster i MIR-106a-overekspresjon celler hadde øyene epiteliale kreftceller invaderende i tilstøtende stromal vev (Fig. 3B, venstre panel). Dermed ektopisk uttrykk for MIR-106a dratt invasiv kapasitet på kreftceller som ellers ikke-invasiv.
A, Vekstkurver av tumorer dannet av HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektorer. Hver data punkt representerer middelverdien ± standardavvik av 3-4 mus. B, haematoxylin og eosin-farget deler av CRC dannet av HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykker eller kontroll vektorer 8 uker etter implantasjon.
TGFBR2
er et direkte mål på MIR-106a
for å forstå mekanismen som MIR-106a indusere kreft celle migrasjon og invasjon, brukte vi to algoritmer (PicTar og TargetScan) for å identifisere mål for menneskelig MIR-106a [21], [22]. Blant 990 mål spådd av TargetScan,
LAMA3 plakater (Gene ID: 3909) og
TGFBR2
gener (Gene ID: 7048) har tidligere vært innblandet i regulering av cellemigrasjon og /eller invasjon [23] – [27].
TGFBR2
er spesielt interessant fordi ekspresjon av
TGFBR2
har vist seg å være tapt progressivt i løpet av ondartet progresjon av forskjellige typer kreft [23], [25], [27], [28 ]. I tillegg har TGFBR2-koder mRNA en 3’UTR element som er komplementær til MIR-106a (fig. 4A).
En spådde dannelsen av duplex mellom menneske
TGFBR2
3’UTR og MIR-106a. B, Real-time RT-PCR analyser av
TGFBR2
i HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektor.
GAPDH
mRNA anvendes som en intern kontroll. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfeil. C, Luciferase aktivitet av villtype
TGFBR2
3’UTR reporter genet i HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektorer. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfeil. D, Luciferase aktivitet av mutant-type
TGFBR2
3’UTR reporter genet i HT29 celler infisert med MIR-106a-uttrykke eller kontroll vektorer. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer. Barer betegne standardfeil.
Ja, overekspresjon av MIR-106a førte til nedbrytning av
TGFBR2
mRNA, målt ved real-time RT-PCR (Fig. 4B). Vi neste fastslått hvorvidt
TGFBR2
er et direkte mål på MIR-106a-mediert hemming av analysering av aktiviteten til en luciferasereportergenet smeltet inn i 3’UTR av villtype
TGFBR2
genet. MIR-106a reduserte aktiviteten av luciferase reporter signifikant (P 0,05, figur 4C.). Hemming av
TGFBR2
formidlet av MIR-106a avhenger av tilstedeværelsen av MIR-106a homologe bindingssteder i 3’UTR av
TGFBR2
genet. Fordi luciferase reporter bærer en mutant
TGFBR2
3’UTR, substitusjon av 4 nukleotider innenfor MIR-106a bindingsseter ble ikke hemmet av MIR-106a ektopisk uttrykk (Fig 4D, P . 0,05). Sammen er disse observasjonene tyder på at
TGFBR2
kan fungere som en direkte mål av MIR-106a-mediert stanse.
TGFBR2
er en funksjonell Target av MIR-106a
Vi neste fastslått hvorvidt redusert uttrykk for
TGFBR2
genet er nødvendig for induksjon av cellulær migrasjon og invasjon observert etter MIR-106a overekspresjon. Vi overexpressed MIR-106a og en konstruksjon som uttrykker
TGFBR2
konstitutivt. Denne konstruksjonen koder for hele kodende sekvensen til
TGFBR2, etter samtidig mangler 3’UTR element, for således å gi en form for mRNA motstandsdyktig mot MIR-106a mediert inhibering. Bemerkelsesverdig, det resulterende konstitutivt uttrykt
TGFBR2
avskaffet tidligere forhøyet migrering og invasjon initiert av MIR-106a (figur 5A.), Men hadde ingen virkning på cellelevedyktighet (figur 5B, P . 0,05), noe som tyder at
TGFBR2
er faktisk et funksjonelt mål på MIR-106a.
A, Matrigel invasjonen analysene av MIR-106a-omformet eller kontroll-infiserte HT29 celler transient transfektert med
TGFBR2
. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer sammen med standardfeil. B, trypanblått eksklusjon analysen av MIR-106a-uttrykke HT29 celler transduced
TGFBR2
eller kontroll vektor. Vist er et representativt eksperiment i tre eksemplarer, sammen med standardfeil. C, Immunoblotting for
TGFBR2
i HT29 celler transient transfektert med
TGFBR2
siRNA. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer, sammen med standardfeil. D, Sammenligning av økt migrasjon og invasjon potensial mellom HT29 celler transduced med MIR-106a og HT29 celler transient transfektert med
β
siRNA. Et representativt eksperiment er vist i tre eksemplarer. Barer betegne standardfeil.
Vi ønsket også å avklare hvorvidt nedbrytning av
er tilstrekkelig for MIR-106a-mediert økning av migrasjon og invasjon TGFBR2
. Transfeksjon av
TGFBR2
små interfererende RNA (siRNA), noe som resulterte i en 90% reduksjon i nivåene av
TGFBR2
protein (Fig. 5C), førte til en bemerkelsesverdig, men ikke fullstendig induksjon av celle-migrering og invasjon i forhold til induksjon forårsaket av MIR-106a overekspresjon (fig. 5D). Kollektivt,
TGFBR2
ser ut til å være en nødvendig, men ikke tilstrekkelig mål på MIR-106a.
MIR-106a Expression økes i metastatisk Primær CRC
Viktigere, en fersk microarray analyse viste at MIR-106a er blant de mirnas som er høyt uttrykt i primær CRC sammenlignet med normal kolorektal epitelvev [16], [18]. Vi avgjort om MIR-106a uttrykk i metastase-positive tumorer er høyere enn metastasefritt svulster, og om ikke MIR-1061 uttrykk er assosiert med kliniske resultater i CRC pasienter. Vi rekrutterte 28 CRC pasienter som var langtidsmetastasefritt overlevende etter fullstendig kirurgisk reseksjon av primærtumor, og sammenlignet pasienter til en kontroll kohort av pasienter med metastaser ved diagnosetidspunktet eller metastaser i oppfølging ( 60 måneder ) (tabell S1). Videre ble metastasefrie overlevelsesraten av pasienter uten metastaser på diagnose stratifisert basert på MIR-106a uttrykk status. Faktisk, metastase-positive pasienter hadde signifikant høyere nivåer av MIR-106a i sine primære svulster i forhold til pasienter uten metastaser (fig 6A, P . 0,05). Spesielt blant alle disse pasientene, de som hadde lavere nivåer av MIR-106a hadde bedre kliniske resultater (figur 6B,
p
. 0,05). Sammen er disse resultatene indikerer at Mir-106a har en viktig rolle i CRC metastaser.
A, Nivåer av MIR-106a uttrykk i grunnskolen CRC med eller uten metastaser. Det var en signifikant forskjell i MIR-106a-ekspresjon i disse to gruppene. B, Kaplan-Meier metastase overlevelse for 28 CRC pasienter uten metastaser ved diagnose, stratifisert basert på nivåene av MIR-106a uttrykk i deres primære svulster. Aχ
2 test ble brukt for statistisk analyse og en P . 0,05 ble betraktet som signifikant
Diskusjoner
Den nåværende arbeid identifisert MIR-106a som et pro-metastase miRNA ledende til fremme av migrasjon og invasjon av CRC celler. Reduksjon av denne miRNA i CRC celler som ellers er metastatisk redusert trekkfugl og invasiv potensialet i CRC celler. I motsetning til dette, oppregulering av MIR-106a i CRC-celler med mindre migrering og invasjon potensielt økt cellulær migrering og invasjon. Vi viste at Mir-106a ikke vesentlig påvirke proliferative forekomst av CRC celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Slike bevis tyder på at Mir-106a kan bare spille en rolle i CRC celle invasjon.
Interessant, men fra samme pasient, SW480 og SW620 celler hadde ulike invasjon potensial og MIR-106a uttrykk (Fig. 1A og B ). Det er mulig at dette funn var fordi SW480 celler er fra en primær kreft som gjennomgår EMT og SW620-celler er fra en sekundær cancer. Nedgangen i uttrykket for ZEB1 i SW620 celler sammenlignet med SW480 celler kan føre til restaurering av E-cadherin nivåer og indusere en omvendt prosess med EMT eller mesenchymale-epitelial overgang (MET) [29], der MIR-106a kan spille en rollen som en oppstrøms eller nedstrøms faktor på ZEB1.
Våre funn rapporterer for første gang at som et mål gen av MIR-106a,
TGFBR2
kan bli negativt regulert av MIR-106a på transkripsjonsnivået via binding av 3’UTR av
TGFBR2
mRNA i CRC.
TGFBR2
er en stor TGF-β signalmolekyl ofte funnet å være en av de gener endret i kreft. TGF-β signalveien spiller en rolle kompleks, som fortsatt er kontroversielt, i ondartet utviklingen av tumorer. Det er blitt vist at TGF-β kan indusere EMT og fremme tumorcelle-invasjon [30], mens en annen studie har vist at redusert
TGFBR2
ekspresjon er assosiert med aggressive trekk ved leverkreft [25]. I CRC kan TGF-β indusere vekst inhibisjon av kreftceller, og
TGFBR2
var en tumor suppressor protein som er nødvendig for TGF-β signalering [31]. Denne studien viste at nedregulering av
TGFBR2
øker cellulær migrasjon og invasjon av HT29 (Fig. 2G og 5D). Derfor kan TGF-β signale være en viktig tilnærming ved hvilken mirnas regulere utviklingen av svulster. En fersk studie rapporterte at MIR-17~92, aktiveres av c-myc, demper den TGFfi signalveien, og dermed stimulere angiogenese og tumorcellevekst [32]. Selv
TGFBR2
ser ut til å være en nødvendig, men ikke tilstrekkelig mål på MIR-106a i den aktuelle studien, forholdet mellom MIR-106a og TGF-β signale fortjener videre studier.
Clinicopathologic analyse ytterligere demonstrert forbindelsen mellom MIR-106a og metastasering. Langsiktige overlevende uten metastaser hadde signifikant lavere nivåer av MIR-106a i sine primære svulster i forhold til pasienter med tilbakefall av sykdommen, og lavere nivåer av MIR-106a antyder en høyere metastase overlevelse rate (Fig. 6). Dette funnet støtter sterkt forestillingen om at overekspresjon av MIR-106a er nært involvert i metastasering av CRC.
I konklusjonen, viste vi at uttrykket av MIR-106a var positivt korrelert med migrasjon og invasjon potensialet i CRC celler, og nedregulering av
TGFBR2
, som en av de målgener for MIR-106a, vil kunne øke celle migrasjon og invasjon.
Enda viktigere, nivåene av MIR-106a uttrykk i primære CRC er korrelert med kreft progresjon klinisk, noe som tyder på at Mir-106a kan representere et nytt mål for terapeutisk intervensjon for å forebygge CRC metastaser.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Den foreviget menneskelige kolon epitel cellelinje, NCM640, var en gave fra JQ Zhang og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS HT29, SW480, Løvø, SW1116, og SW480 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket under forhold i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA Isolation og mirnas Analyser
Total RNA fra dyrkede celler ble ekstrahert med Mirvana Isolation Kit (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA). mirnas ble utført med Mirvana QRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) sammen med QRT-PCT primersett (4395280, Ambion) i samsvar med manualer av produserer. U6 liten kjernefysiske RNA ble brukt som intern kontroll.
oligonukleotid Transfeksjon
miRIDIAN mikroRNA-hemmer, miRIDIAN Mimic HSA-MIR-106a og siRNA av
TGFBR2
ble kjøpt fra Dharmacon (IH-300526-08, C-300526-07, og D-003930, Dharmacon, Lafayette, CO, USA). Cellene ble transfektert med 200 nM av de angitte oligonukleotider bruker Oligofectamine Reagens (12252011, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble brukt for senere eksperimenter 48 timer etter transfeksjon.
Gene Cloning og Ektopisk Expression
Den menneskelige miRNA genet ble PCR-amplifisert fra normal genomisk DNA og klonet inn i MDH1-PGK-GFP 2,0 retrovirus-avledet vektor.
TGFBR2
cDNA som mangler 3’UTR ble PCR-amplifisert fra normal genomisk DNA og uttrykt fra pWZL-blasticidin vektor. Viral generering og infeksjon av målceller er blitt beskrevet tidligere [33]. Infiserte celler ble valgt med 2 ng /ml puromycin (P9620, Sigma, St. Louis, MO, USA), 200 mikrogram /ml hygromycin (H9773, Sigma), og 10 mikrogram /ml blasticidin (sc-205604, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA).
In vitro migrasjon og invasjon Analyser
migrasjon og invasjon potensialet i CRC celler ble evaluert som beskrevet tidligere med små modifikasjoner [34].
CRC celler (2,5 × 10
5) ble sådd ut på ubestrøket forkamrene (24-brønns innlegg, pore størrelse, 8 mikrometer, BD Bioscience, Bedford, MA, USA) for Transwell migrasjon analyser. CRC celler (2,5 × 10
5) ble plassert på Matrigel-belagte forkamrene (24-brønns innlegg, pore størrelse, 8 pm, BD Biovitenskap). For invasjon analyser
medium i toppen komponenten var aspirert og erstattet med serum-fritt medium 2 timer etter såing, og medium inneholdende 20% serum ble anvendt som en chemotractant i de nedre kamre. Celler ble tillatt å migrere til 24 timer, og deretter cellene på begge sider av kammeret ble fiksert med 50/50% aceton /metanol. Celler i bunnen av kammeret ble farget med krystallfiolett (C3886, Sigma). Deretter blir bildet av hver brønn ble tatt av bildet kjerner av cellene med 10 x objektiv, og cellekjerner i hvert felt ble tellet ved hjelp av Image-J-programvare (NIH; https://rsb.info.nih.gov /ij /).
Animal Experiments
Seks til åtte uker gamle nakne mus ble brukt for studien, og alle de eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av Animal Care komité Shanghai Jiaotong University . 10
6 HT29 celler i 200 ul DMEM ble injisert inn i flankene av mus subkutant. Diametrene av tumorene ble målt to ganger i uken med presisjonsmålepunktene. Tre til fire mus pr gruppe ble avlivet ved hver av de 4 tidspunkter (uker 2, 4, 6 og 8 etter transplantasjon). Svulstene ble fjernet og veid. Vevsprøver ble fiksert i 10% bufret formalin i 12 timer, deretter vasket med PBS og sendt til 70% etanol, etterfulgt av å bli innleiret i parafin, seksjonert og farget med hematoksylin og eosin (H9627 og E4009, Sigma).
SYBR Grønn real-time RT-PCR
Den totale RNA av celler ble trukket ut og omvendt-transkribert, som beskrevet tidligere [35]. Oppstrøms og nedstrøms primere for
TGFBR2
genet ble oppnådd fra Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 «og 5»-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 «. SYBR grønn sanntids RT-PCR og det tilsvarende data-analyse er blitt beskrevet tidligere [35]. β-aktin mRNA ble anvendt som en intern kontroll (primere: 5»-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 «og 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3»).
Immunoblotting
Cellene ble høstet i RIPA lysebuffer . Proteiner fra cellelysatene ble løst med PAGE-gel, overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) og deretter blokkert i 5% ikke-fettholdig melk i PBS /Tween-20, etterfulgt av inkubering med antistoff againstN-cadherin (sc-271386, Santa Cruz), E-cadherin (sc-21791, Santa Cruz), vimentin (sc-373717, Santa Cruz), ZEB1 (sc-25388, Santa Cruz) eller TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz) . Mengden av målet protein ble kalibrert ved hjelp av β-aktin (sc-130656, Santa Cruz), og relative intensiteter ble oppnådd.
Konstruer
TGFBR2
3’UTR sekvenser ble klonet inn i en pMIR-RAPPORT luciferase konstruksjon (AM5795, Ambion) [36]. Mutant
TGFBR2
3’UTR ble generert med en Quickchange seterettet mutagenese Kit (200519, Stratagene, Palo Alto, CA, USA).
luciferaserapportørplasmid Analyse
Celler 50% samløpet i 24-brønners plater ble transfektert med Fugene6 (E2691, Promega, Madison, WI, USA). Luciferase reportergen-konstruksjonen (200 ng) og PRL-SV40 Renilla luciferase-konstruksjon (1 ng [benyttes for normalisering]) ble ko-transfektert i hver brønn. Celleekstrakter ble utarbeidet 24-48 timer etter transfeksjon og målt med en Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (E1910, Promega).
Klinisk tykktarmssvulster
Primære tykktarmssvulster og tilsvarende normal kolorektal vev var samlet mellom 2004 og 2006, og behandles i samsvar med en protokoll godkjent av etisk komité Ruijin Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine. TNM stadium av svulsten ble bestemt i henhold til klassifiseringen foreslått av AJCC Cancer Staging Manual [37]. Oppfølgingsdata ble oppsummert på slutten av 2011 med en median oppfølging på 60 måneder. Fresh vev ble høstet fra pasienter, snap-frosset, og bevares ved -80 ° C. Delvis seksjoner fra samme vev ble deretter farget med hematoksylin-eiosin å validere tilstedeværelsen av svulsten og vev som inneholder 90% tumorceller ble brukt for QRT-PCR som svulster. Total RNA ble isolert fra frosset vev ved hjelp TRIzol utvinning (15596, Ambion) og en Mirvana miRNA Isolation Kit (AM1560, Ambion). miRNA ble utført med en Mirvana QRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) sammen med QRT-PCT primersett (4395280, Ambion) i samsvar med produsentens manualer. U6 small nuclear RNA ble anvendt som en intern kontroll. Primære svulster ble stratifisert som MIR-106a lavere eller høyere for å skjelne hvorvidt MIR-106a nivåer korrelert med metastaser. Svulster ble ansett MIR-106a lavere eller høyere hvis den normaliserte uttrykk for MIR-106a bodde i bunnen eller toppen 50% av svulstene i gruppen, henholdsvis.
cellevekst og levedyktighet analysen
for å bestemme vekstrater, 2,5 × 10
4 celler ble sådd ut i hver brønn i en 12-brønns plate. Tjuefire timer senere ble cellene høstet og tellet på et hemocytometer etter 2 dager før dag 6. For å bestemme celle-levedyktighet, ble celler trypsinisert og fortynnet med 0,4% trypanblått (302 643, Sigma) løsning farging og telles på en hematocytometer.
Statistical Analysis
data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil. En Student t-test (tosidige) ble brukt til å sammenligne to grupper (en P 0,05 ble betraktet som signifikant) med mindre annet er oppgitt (χ
2 test)
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1. .
Korrelasjon av MIR-106a uttrykk med metastaser i pasienter med kolorektal kreft.
doi: 10,1371 /journal.pone.0043452.s001 plakater (DOC)
