Abstract
Nyere data støtter en rolle for SHARP1, en grunnleggende helix-loop-helix transkripsjon repressor, i reguleringen av ondartet celle atferd i flere kreft hos mennesker. Men uttrykket og rolle SHARP1 under utviklingen av livmorkreft (EF) er fortsatt uklart. Her viser vi at oppregulering av SHARP1 trykt tumor angiogenese ved å redusere hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α), hemmet celle levedyktighet og tumorvekst i EF. Immunohistokjemisk farging viste at ekspresjon av SHARP1 var negativt korrelert med tumorstadium, histologiske grad, myometrial invasjon, lymfeknutemetastase, blodårer gjennomtrengning i myometrium og HIF-1α uttrykk. Mekanistiske studier viste at SHARP1 samhandlet med HIF-1a fysisk, og proteinnivået av HIF-1α og mRNA nivå av sine mål gener (
VEGFA, ANGPTL4 Hotell og
CA9
) ble redusert med SHARP1 etter hypoksi. Oppregulering av SHARP1 i EC hindret hypoksi-indusert angiogenese ved reduksjon av VEGF-sekresjon. Immunhistokjemisk analyse bekreftet en sammenheng mellom redusert SHARP1 uttrykk og økt microvessel tetthet i EF-vev. I tillegg SHARP1 hemmet cellelevedyktighet i EC-cellelinjer. Overekspresjon av SHARP1 in vivo inhiberte tumorvekst og angiogenese, og redusert HIF-1α uttrykk. I denne studien har vi etablert SHARP1 som en roman tumor suppressor av EF og belyse mekanismene av hvordan SHARP1 hemmet EC progresjon. Derfor kan SHARP1 være en verdifull prognostisk biomarkør for EC progresjon og viser lover som en ny potensielt mål for antiangiogenic therapeutics i menneskelig EC
Citation. Liao Y, Lu W, Che Q, Yang T, Qiu H, Zhang H, et al. (2014) SHARP1 Undertrykker Angiogenese av livmorkreft av synkende Hypoksi-induserbar faktor-1α nivå. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10,1371 /journal.pone.0099907
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 19 mai 2014; Publisert: 11 juni 2014
Copyright: © 2014 Liao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation of China (81272885, 81172476, 81072139, 81072140) National, Stiftelsen Prosjekt av Shanghai Science and Technology Commission (nr 13JC1404500) og Ph.D. Foundation programmer av Ministry of Education of China (No. 20120073110090). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EC) er en viktig årsak til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet blant kvinner. Det er den fjerde vanligste kreftformen blant kvinner i USA, med anslagsvis 49.500 nye tilfeller og 8200 dødsfall i 2013 [1]. Selv om tidlig stadium EC blir ofte behandlet med kirurgisk inngrep, kan behandling av avansert EC være vanskelig og dens Prognosen er dårlig [2], [3], spesielt i sammenheng med metastatisk eller tilbakevendende sykdom, med en median overlevelse på bare 7 -12 måneder [4]. Nåværende behandlingsalternativer, slik som hysterektomi, hormonbehandling, og kombinasjoner av stråling og kjemoterapi, er effektive for tidlig stadium EC; men effektive mål behandlinger for pasienter med metastatisk eller residiverende EC er utilgjengelige [5], fordi etiologi og biologiske mekanismer for denne heterogene sykdommen ikke er fullt ut forstått. Derfor ytterligere klarlegging av de molekylære mekanismene bak EC progresjon er presserende.
Angiogenese, dannelsen av nye blodkar fra preexisting seg, har en viktig rolle i tumorvekst, progresjon, og metastase [6], [7 ]. I utgangspunktet er angiogen aktivitet fraværende i begynnelsen av svulster. Men som svulster vokse utover den eksisterende tilførselshastigheten, blir oksygen oppbrukt i kjernen. Den resulterende hypoksisk tilstand (PO
2 10 mmHg [~1.5% O
2]) hindrer nedbrytning av hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) gjennom VHL tumor suppressor, slik at trans-aktivering av pro- angiogene faktorer, hvorav det mest bemerkelsesverdige er vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [8] – [11]. Nyere forskning har vist at den HIF-1α /VEGF-signalveien er involvert i endotelcelle proliferasjon, differensiering, migrering og vaskulær permeabilitet [12]. Videre kan inhibering av neovaskularisering ved undertrykkelse av HIF-1α /VEGF-signalveien forsinke tumorprogresjon og kanskje til og med sulte-tumorceller i hjel [13] – [15]. I likhet med andre solide tumorer, vekst og metastasering av EC-celler er avhengig av angiogenese [16]. Mekanismen bak angiogenese regulering har blitt grundig beskrevet i andre typer kreft, men bare knapt studert i EC [15].
SHARP1 (også kjent som bHLHE41 eller Dec2), et medlem av transcriptional repressor familien av grunnleggende helix -loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktorer [17], [18], er uttrykt i ulike embryonale og voksne vev [19], [20]. Omfattende bevis mener det er en viktig regulator av tumorprogresjon i muntlig og brystkreft, hvor dens virkning på kreftcelle apoptose, proliferasjon og metastase har vært mye undersøkt [21] – [24]. I tillegg SHARP1 regulerer negativt VEGF uttrykk [25], og en fersk undersøkelse viser at SHARP1 undertrykker brystkreft metastase [23]. Imidlertid er det fortsatt ukjent om og i så fall hvordan SHARP1 bidrar til utvikling og progresjon av EF, særlig med hensyn til angiogenese, der HIF-1α /VEGF veien er involvert.
I denne undersøkelsen , viste vi at redusert uttrykk for SHARP1 var signifikant korrelert med dårlig klinisk utfall i EF. Videre, for første gang, viste vi at SHARP1 har en undertrykkende rolle under EC progresjon; Særlig SHARP1 hemmet angiogenese i en HIF-1α-avhengig måte og kan være en verdifull markør for antiangiogen terapi utvalg.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av human Investigation Etisk komité for International Peace Maternity Child Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University. Prøvene i EU og normal endometrial vev ble samlet etter å ha mottatt skriftlig informert samtykke fra pasientene. Dyret Forskningen ble utført i henhold til anbefalingene i Veileder for omsorg og bruk av forsøksdyr i Kina. Prosedyrene ble godkjent av Institutt for laboratorie Animal Science Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelser.
Pasienter og Prøver
parafininnstøpte vev prøver ble innhentet fra 110 pasienter med livmorkreft og 52 pasienter med normal endometrium som gjennomgikk kirurgisk reseksjon å behandle andre sykdommer som myom eller adenomyosis på International Peace Maternity Child Health Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University fra 2009 til 2013. Gjennomsnittsalderen for pasienter med EF var 56,9 ± 8,8 år (gjennomsnitt ± SD, median, 57 år, range, 33-78 år). Gjennomsnittsalderen for pasienter med normal endometrium var 53,9 ± 8,6 år (gjennomsnitt ± SD, median, 53 år, range, 34-70 år). Det var ingen signifikant forskjell om pasientens alder når EU og kontrollprøver ble sammenlignet (
P
= 0,054). I kontrollgruppen, alle prøvene var hysterektomi eksemplar, hvorav 16 tilfeller var fra postmenopausale kvinner, 17 tilfeller var fra perimenopausal kvinner og de andre var fra premenopausale kvinner. Etappene (I-IV) og histologiske karakterer (G1-G3) av disse svulstene ble etablert i henhold til kriteriene for International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) kirurgisk iscenesettelse system (2009) [26]. Ingen av pasientene hadde gjennomgått hormonbehandling, strålebehandling eller cellegift før operasjon.
Immunohistochemistry (IHC) og Assessments
Tissue seksjoner (4 mikrometer tykk) ble fremstilt fra parafininnstøpte vevsprøver. Seksjonene ble avvokset med xylen etterfulgt av rehydrering i gradert alkohol. Antigen gjenfinning ble utført i etylendiamintetraeddiksyre (EDTA; pH 9,0) i 20 minutter ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Deretter endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert ved inkubering av seksjoner med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter, og ikke-spesifikk farging ble blokkert ved inkubasjon med 10% normalt geiteserum i 30 min. Seksjoner ble inkubert med kanin-polyklonalt antistoff mot SHARP1 (et fortynningsforhold på 1:100 til 10 ug /ml; Novus, Littleton, CO), muse-monoklonalt antistoff mot HIF-1α (et fortynningsforhold på 1:50 til 5 pg /ml ; BD Biosciences, Bedford, MA), kanin-monoklonalt antistoff mot CD34 (et fortynningsforhold på 1:100 til 5 ug /ml; Abcam, Cambridge, UK), og kanin-polyklonalt antistoff mot Ki67 (et fortynningsforhold på 1:100 til 5 ug /ml; Epitomics, Burlingame, CA) i et fuktet kammer ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med biotinylert sekundært antistoff (et fortynningsforhold på 1:1000 til 1 pg /ml; Beyotime, Nanjing, Kina) i 30 min, etterfulgt av streptavidin-peroksidase i 15 min. Fosfat-bufret oppløsning (PBS) ble anvendt for å fortynne antistoffer. Peroksidase-aktivitet ble detektert ved å anvende 3,3′-diaminobenzidin-tetraklorid. Hver inkuberingstrinn ble utført ved 37 ° C og ble etterfulgt av tre sekvensielle vaskinger med PBS i 5 minutter hver. Til slutt deler var dehydrert i alkohol og ryddet i xylen.
Skåring ble utført av to uavhengige patologer som ble blindet for de kliniske og patologiske data. SHARP1 farging ble evaluert ved å vurdere både antall celler med positiv nukleær og cytoplasmatisk farge og intensiteten av fargingen i hver positiv kjernen og cytoplasmaet. Antallet av positive celler ble gradert som følger: 0 (mindre enn 5%); 1 (5-25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 ( 75%). Intensiteten ble gradert som følger: 0 (negativ); 1 (svak); 2 (moderat); 3 (sterk). En sluttresultatet ble beregnet ved å multiplisere de to score ovenfor. Resultater av 0-2 ble definert som » negative uttrykk »; score til 3-8 som » svakt positivt uttrykk », og score til 9-12 som » sterkt positivt uttrykk » [27]. For HIF-1α flekker, bare prosentandelen av mørke, homogent fargede kjerner ble vurdert, og cytoplasmatisk farge ble ignorert. Det ble ansett som positivt når 1% av kjerner ble farget [28]. Den microvessel tetthet (MVD) ble vurdert ved IHC farging for CD34, som fremhever svulst /vev vascularity. Microvessels ble telt i tre ulike felt per avsnitt som følger: slides ble først skannet i lav effekt (× 100) for å finne tre » hotspots » eller områder med maksimalt antall microvessels, da de positive-farget blodårene i utvalgte områder ble analysert ved × 400 forstørrelse [29].
Cell Culture, hypoksiske betingelser, og reagenser
Menneskelig EC cellelinjer (Ishikawa og RL95-2) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Menneske navle vaskulære endotelceller (HUVECs) ble hentet fra Key-GEN Biotech (Nanjing, Kina). Ishikawa og RL95-2-celler ble dyrket i DMEM /F12 (Gibco, Auckland, NZ) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA). HUVECs ble dyrket i RPMI1640 (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum. Celler ble dyrket i en 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C. For hypoksi eksperimenter ble celler dyrket i en in vitro hypoksisk ( 0,1% O
2) beholdersystem (BD Diagnostics, Sparks, MD). Kondisjonert medium (CM), protein og RNA ble samlet inn umiddelbart når cellene ble fjernet fra hypoksisk container.
Forbigående og stabil transfections for SHARP1-overekspresjon
SHARP1 uttrykk plasmid Pez-M02-SHARP1 og tomt plasmid pReceiver-M02-NEG ble kjøpt fra GeneCopoeia (Guangzhou, Kina). Forbigående transfeksjon ble utført i 70% konfluente Ishikawa-celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. For stabil uttrykk i Ishikawa celler, ble det menneskelige SHARP1 genet klonet inn lentiviral vektorer med Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP bruker Gateway teknologi (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til bruksanvisningen (http: //products.invitrogen. com /ivgn /produkt /12538120).
små interfererende RNA (siRNA)
sirnas ble syntetisert ved GenePharma Biotech (Shanghai, Kina). Sekvensene er presentert i tabell 1. siRNA ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens som beskrevet ovenfor.
RNA Isolation og kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Total RNA ble utvunnet fra dyrkede celler ved anvendelse av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Første-tråd cDNA ble revers-transkribert fra 1 pg av total RNA ved å bruke Prime Script RT reagenssettet (Takara, Dalian, Kina), og cDNA ble analysert ved hjelp av qPCR SYBR Premiks Ex Taq (Takara). For qPCR eksperimenter, verdier på
y
aksen representerer to
(- ΔΔCt), hvor ΔCt er differansen mellom Ct for genet av interesse og at av genet som koder for β-aktin og ΔΔCt er forskjellen mellom ΔCt av forsøksgruppe og en kontrollgruppe eller første kjørefelt [30]. Primersett er vist i Tabell 2. Data ble innhentet i tre eksemplarer fra tre uavhengige eksperimenter.
Western Blotting
Celler ble lysert i RIPA lysebuffer (Beyotime, Nanjing, Kina) med proteasehemmer fenylmetansulfonylfluorid (PMSF, Beyotime). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved en BCA Protein Assay kit (Beyotime). Like mengder protein ble lastet inn i hver kolonne av en SDS-PAGE-gel av proteinseparasjon og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble blokkert, og deretter inkubert med kanin-polyklonalt antistoff mot SHARP1 (et fortynningsforhold på 1:500 til 2 ug /ml; Novus), muse-monoklonalt antistoff mot HIF-1α (et fortynningsforhold på 1:200 til 5 ug /ml; Abcam), og kanin-polyklonalt antistoff mot β-aktin (et fortynningsforhold på 1:5000 til 0,2 ug /ml; Epitomics) individuelt ved 4 ° C over natten. Deretter peroksidase-bundne sekundære anti-kanin og anti-mus antistoffer (et fortynningsforhold på 1:5000 til 0,2 ug /ml; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Ble anvendt for å påvise bundede primære antistoffer
Co-Immunpresipitasjon (Co-IP) Analyse
for å studere endogen SHARP1 /HIF-1α bindende, ble Ishikawa cellene inkubert i henhold til hypoksi i 24 timer før høsting. Deretter to sammenflytende 10 cm skåler av celler ble lysert som beskrevet ovenfor. Før immunoutfelling, ble de totale cellelysatene inkubert med 1 ug muse-IgG og 20 ul av en protein A + G-agarose vulst slurry (Beyotime) ved 4 ° C i 2 timer for å eliminere ikke-spesifikk binding. Sentrifugering ble deretter utført, og supernatanten ble samlet og inkubert med mus-anti-human HIF-1α (sluttkonsentrasjon: 10 ug /ml; Abcam) eller kontroll mus IgG (sluttkonsentrasjon: 10 ug /ml; Beyotime) over natten. Den neste dag, 40 ul av en protein A + G-agarose-perle oppslemning ble tilsatt til reaksjonsblandingen og inkubert i 4 timer ved 4 ° C med rotasjon. Co-immunopresipitert proteiner ble analysert ved western blotting som beskrevet ovenfor
Enzyme-Linked immunosorbent assay (ELISA)
Quantikine human VEGF kit ble kjøpt fra R . D-systemer (Minneapolis, MN). Celler ble sådd ut i 12-brønners plater. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble mediet erstattet med DMEM /F12, og cellene ble dyrket under hypoksi eller normoxia i ytterligere 24 timer. Deretter ble supernatantene oppsamlet, og ekstracellulært VEGF i mediet ble kvantifisert i henhold til produsentens instruksjoner.
endotelcelle Tube Formation Assay
A 96-brønners plate ble belagt med 100 ul Matrigel (BD biovitenskap, San Diego, California) per brønn og holdt ved 37 ° C i 30 min. Deretter ble 2 x 10
4 HUVECs ble suspendert i 1 ml fortynnet kondisjonert medium (CM; 1:10) og påført pre-belagte 96-brønns plate ved en densitet på 2000 celler /brønn. CM ble oppsamlet fra supernatanten av Ishikawa-celler dyrket under hypoksi eller normoxia i 24 timer. Etter inkubering ved 37 ° C i 14 timer, ble den totale lengden av de kapillære lignende rør som hadde dannet tellet og middelverdien dannes i en tilfeldig valgt tre mikroskopiske felt. ble det observert morfologiske forandringer under et mikroskop, og celler ble fotografert ved 100 x forstørrelse.
naken mus Tumor Xenograft Assay
Nitten 6 uker gamle hunn nakne BALB /c-mus ble erholdt fra Shanghai life Science Institute (SLAC Forsøksdyr Co., Ltd, Kina). Å etablere en naken mus modell peiling EC, Ishikawa celler transfektert med lentiviral vektor som bærer den menneskelige SHARP1 genet (Lenti-SHARP1) eller med tom vektor alene (Lenti-Control) ble brukt. Alle mus ble tilfeldig delt inn i to grupper på fem mus (de andre ni mus ble anvendt for Matrigel plugg-analysen; se nedenfor). Cellene ble injisert subkutant i flanken av hver mus (1 x 10
7 celler pr injeksjon). Subkutan tumor Dannelse ble overvåket i det hele tatt nakne mus hver 7. dag fra 14 dager etter injeksjonen. De korte og lange diameter på svulster ble målt ved hjelp av en kaliper og tumorvolum (cm
3) ble beregnet ved hjelp av følgende standard formel: tumor volum (cm
3) = (den lengste diameter) × (de korteste diameter)
2 × 0,5. Mus ble ofret 6 uker etter injeksjon, hvoretter svulster ble nøye fjernet, og deres vekt og volum ble målt før videre histologisk evaluering.
Mus Matrigel Plug-analysen
Nine naken BALB /c mus ble tilfeldig delt i tre grupper på tre mus. Vekstfaktor-redusert Matrigel (BD Biosciences) (300 ul) ble blandet med Ishikawa-celler transfektert med tom plasmid i henhold normoxia eller hypoksi eller SHARP1 fullengde plasmid i henhold til hypoksi, eller blandet med tilsvarende CMS (100 ul) fra å få de samme cellene nevnt over. Celler eller tilsvarende CMs var samlet på samme tid etter dyrket under angitte betingelser i 24 timer. Blandingene ble injisert subkutant i flanken av hver mus (høyre side, i blanding med celler, venstre side, i blanding med tilhørende CM). Musene ble avlivet og pluggene ble fjernet 14 dager etter inokulering og fotografert. Matrigel plugger ble farget med hematoxylin og eosin (H E) for histologisk undersøkelse og analysert ved IHC som beskrevet ovenfor ved hjelp av antistoffer mot mus CD34 (1:100, Abcam)
Trans-vel Migration Analyser
.
for HUVEC trans-brønns migrasjon analyser, 1 × 10
4 celler suspendert i 200 ul RPMI 1640 ble sådd på toppen kammer og kondisjonert medium (CM) fra ulike kilder som beskrevet i Materialer og metoder ble lagt til i bunnkammeret, hvor Ishikawa-celler ble dyrket med normoxia eller hypoksi i 24 timer før CM ble oppsamlet. Hver prøve ble belagt i tre eksemplarer. Etter 24 timer inkubasjon ble cellene i oversiden av den øverste kammeret fjernes med en bomullspinne. De migrerende cellene (på undersiden av filteret) ble fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med 0,5% krystallfiolett, og antallet av migrerende celler ble tellet. Totalt seks felt ble telles for hver trans godt filter. Hvert felt ble tellet under et mikroskop og fotografert ved 200 x forstørrelse.
Metyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) Analyser
Transfekterte celler ble sådd i 96-brønners plater ved 5000 celler /brønn og ble dyrket ved 1 til 4 d. I løpet av siste 4 timer av kulturen, metyl- tiazolyl tetrazolium (MTT; 5 mg /ml) reagens (Sigma, St. Louis, MO) ble tilsatt til kulturmediet. Absorbans-verdiene ble målt ved 490 nm med en mikroplateavleser (modell 680, Bio-Rad, Hercules, CA). For HUVEC levedyktighet deteksjon, 2 x 10
4 HUVECs ble oppslemmet med 1 ml fortynnet CM (fortynningsforholdet 1:10) og sådd ut i 96-brønners plater ved 2000 celler /brønn. Etter 24 timers inkubering, ble HUVEC levedyktighet detektert ved MTT-analyse som beskrevet ovenfor. I hvert forsøk, og under hver tilstand, ble celleviabilitet vurdert i tre eksemplarer, og eksperimenter ble gjentatt tre ganger.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av SPSS programvare versjon 17.0 (Chicago, IL ). Verdier representerer gjennomsnitt ± SD. Data ble analysert ved uparede Student
t
-test eller enveis variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger. Den χ
2 test for tabeller ble brukt til å sammenligne de kategoriske data. Den Spearmans korrelasjonskoeffisient test ble benyttet for korrelasjon deteksjon. En
P
-verdi av. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
SHARP1 er nedregulert i EF og er korrelert med Clinicopathological Kjennetegn
Å bestemme effekten av SHARP1 uttrykk på EC utvikling og progresjon, valgte vi 52 tilfeller av normal endometrium vev, 97 tilfeller av endometrioid livmorkreft (EØF) vev og 13 tilfeller av papillær serøs EC eller klarcellet EC vev som representanter for type i og type II EF hhv. Type I EC, som forekommer i om lag 85% av pasientene, ofte viser ER positive. Svulster med denne typen pleier å være godt differensiert, av lav karakter og god prognose. I kontrast, type II, som hovedsakelig består av serøs og klarcellet karsinom, oppstår typisk i atrofisk endometrium via en mekanisme som ikke er relatert til østrogen eksponering. Denne typen er vanligvis ER negative, og dårlig differensiert, av høy klasse og dårlig prognose. Selv om type II egenkapitalbevis utgjør ca 15% av tilfellene, er de ansvarlige for ca 50% av alle tilbakefall [31]. Immunhistokjemisk farging viste at SHARP1 ble sterkt uttrykt i cytoplasma og kjernen av de fleste cellene i normal endometrium men viste signifikant redusert uttrykk i EF (
P
= 0,00046, tabell 3, figur 1A-C).
Representative mikrofotografier av SHARP1 og HIF-1α flekker i endometrium vev (original forstørrelse: 400 × for innleggene, 200 × for alle andre; skala bar, 100 mikrometer). Paneler A-C viser immunhistokjemisk farging for SHARP1 i normal endometrium (A), endometrioid livmorkreft (EØF) (B), og papillær serøs EC (C). Paneler D-F viser immunhistokjemisk farging for SHARP1 i histologisk grad 2 (G2) EEC (D), G3 EEC (E), og klar celle EC (F). Paneler G-jeg vise immunhistokjemisk farging for HIF-1α i G2 EEC (G), G3 EEC (H), og klar celle EC (I) i tilsvarende samme områdene av samme tilfeller til SHARP1 farging.
de clinicopathological karakteristikker av de 110 EC pasientene ble oppsummert i tabell 4. Sammenlignet med EEC, SHARP1 uttrykk ble betydelig redusert eller tapt i papillær serøs EF eller klarcellet EC (
P
= 0,017), som står for de mest aggressive typer EC. Videre redusert SHARP1 uttrykk markert i sent stadium (stadium III eller IV) eller høyverdig (G3) EC sammenlignet med tidlig stadium (stadium I eller II) eller lavgradige (G1, G2) EC (
P
= 0,017 og
P
= 0,001, henholdsvis). I tillegg har vi også funnet sterke invers korrelasjon mellom SHARP1 uttrykk og myometriets invasjon (
P
= 0,002), lymfeknutemetastase (
P
= 0,005), og blodkar gjennomtrengning i livmoren (
P
= 0,021). Vi fikk imidlertid ikke finne noen signifikante sammenhenger mellom SHARP1 og andre clinicopathologic variabler, blant annet alder og uttrykk av østrogen reseptor, progesteron reseptor, og p53.
Uttrykk for SHARP1 er omvendt korrelert med HIF-1α i EF
for å finne ut om den reduserte SHARP1 uttrykk korrelerer med HIF-1α uttrykk i tumorvev, immunhistokjemisk farging av HIF-1α ble utført i 104 av de 110 EC vevsprøver (resten seks prøvene ble skadet eller mangler ). Blant disse 31 var sterkt positive for SHARP1 (29,8%), og 77 av 104 prøver som var positive for HIF-1α (74,0%). Kun 16 tilfeller var sterkt positiv for SHARP1 og positivt for HIF-1α (15,4%). Våre kliniske data gir den første bevis for at det er en sterk invers korrelasjon mellom SHARP1 og HIF-1α uttrykk i EF (
P
= 0,003, Tabell 5; figur 1D-I).
SHARP1 Demper uttrykk for HIF-1α Protein og nedstrøms Gener i EF-cellelinjer
på bakgrunn av våre kliniske funn, foreslo vi en potensiell sammenheng mellom SHARP1 og HIF-1α. Ved hjelp av qPCR og western blotting, fant vi at
SHARP1
nivået ble hevet todelt i EF cellelinje RL95-2 sammenlignet med Ishikawa cellelinje, som begge stammer fra adenokarsinom i endometrium (figur 2A) . For ytterligere å undersøke SHARP1 funksjon og dens korrelasjon med HIF-1α, vi oppregulert SHARP1 hjelp SHARP1 ekspresjonsplasmider i Ishikawa celler og slått ned SHARP1 hjelp siRNA i RL95-2 celler. Transfeksjon effektivitet ble bekreftet ved 48 t og 72 timer etter transfeksjon for mRNA og proteinnivåer, henholdsvis (figur S1).
(A) Uttrykk for SHARP1 i Ishikawa og RL95-2 celler som bestemmes av qPCR (til venstre ) og western blotting (til høyre). (B) Western blot-analyse av kontroll og SHARP1-overekspresjon Ishikawa-celler dyrket ved de angitte oksygennivået i 24 timer. (C) Western blot-analyse av virkningene av SHARP1 uttømming i RL95-2 celler etter 24 timer ved de angitte oksygennivåer. (D) qPCR analyse av
HIF-1α
mRNA i kontroll og SHARP1-overekspresjon Ishikawa celler (til venstre), og i RL95-2 celler som hadde blitt transfektert med kontroll eller SHARP1 sirnas (høyre) inkuberes ved den indikerte oksygennivåer i 24 timer. (E) Co-immunoprecipitation (Co-IP) av endogen HIF-1α med endogen SHARP1 fra ekstrakter av Ishikawa celler. Stjernen angir et bakgrunnsbånd som følge av kryssreaksjon av immunoglobuliner (IgG). (F) qPCR (til venstre) og western blotting (til høyre) analyse av
SHARP1
i Ishikawa celler inkubert ved de angitte oksygennivået i 24 timer. (G) qPCR analyse av
VEGFA
,
ANGPTL4
, og
CA9
i kontroll og SHARP1-overekspresjon Ishikawa celler inkubert ved de angitte oksygennivået i 24 timer. (H) qPCR analyser av
VEGFA
,
ANGPTL4
, og
CA9
i RL95-2 celler som hadde blitt transfektert med kontroll eller SHARP1 sirnas og inkuberes ved den angitte oksygen nivåer i 24 timer. For transiente transfeksjoner, ble plasmid (1,6 ug /ml) og siRNA (40 pmol /ml) anvendt. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra en representant eksperiment av tre uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer (*
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001; NS, ikke signifikant). For alle qPCR-analyser, ble ekspresjonsnivåer i forhold til p-aktin, og data ble normalisert til uttrykket som vises i første kolonne.
SHARP1 overekspresjon signifikant redusert HIF-1α proteinnivået i Ishikawa-celler i henhold til hypoksi (figur 2B). Vi undersøkte om endogen SHARP1 var en relevant hemmer av HIF-1α protein nivåer. SHARP1 uttømming bruker siRNA økte HIF-1α protein nivå i RL95-2 celler etter hypoksi (figur 2C). Men HIF-1α protein ble knapt påvist i begge cellelinjer dyrket under normoxia. I mellomtiden var ingen signifikant endring i
HIF-1α
mRNA nivået som ble observert i Ishikawa celler overuttrykt SHARP1 eller RL95-2 celler med uttømming av SHARP1 (figur 2D). Vi har også oppdaget en fysisk sammenheng mellom HIF-1α og SHARP1 på endogene nivåer i Ishikawa cellene under hypoksi ved hjelp av en co-immunoprecipitation analysen (figur 2E). Forbløffende
SHARP1
uttrykk ble forhøyet i Ishikawa celler etter at de ble dyrket under hypoksi i 24 timer (figur 2F). Videre HIF-1α knockdown ved hjelp av siRNA redusert SHARP1 til uttrykk under hypoksi (figur S2A).
For å teste om SHARP1 påvirker funksjonelt HIF-1α aktivitet, ble qPCR brukes til å oppdage forskjeller i nivåene av valgt HIF-1α mål genet transkripsjoner. Vi evaluerte genene som koder for vaskulær endotelial vekstfaktor A (
VEGFA
, en isoform av VEGF som er avgjørende for tumor angiogenese og spiller en nøkkelrolle i endotelceller spredning, overlevelse, og permeabilitet [7], [10 ], [12], [16], [32]), Angiopoietin lignende 4 (
ANGPTL4
), og karboanhydrase 9 (
CA9
). Spesielt disse genene ble transcriptionally oppregulert etter hypoksi i Ishikawa celler, mens SHARP1 uttrykk fuktet disse induksjoner (figur 2G). Omvendt, SHARP1 knockdown stimulerte transkripsjon av disse gener i RL95-2-celler i henhold til hypoksi (figur 2 H). Uttrykket av disse genene ble imidlertid ikke signifikant påvirket av SHARP1 oppregulering eller nedregulering i henhold normoxia. I tillegg nedregulering av HIF-1α hjelp siRNA dempes mRNA uttrykk for
VEGFA
,
ANGPTL4 Hotell og
CA9
i Ishikawa celler etter hypoksi (figur S2B).
SHARP1 hemmer angiogenese
HIF-1α er en mester regulator av tumor angiogenese [33], og SHARP1 hemmet
VEGFA
mRNA uttrykk i vår studie (figur 2G, venstre panel). Videre utførte vi ELISA for å påvise VEGF-sekresjon i kondisjonert medium (CM) av Ishikawa celler. SHARP1 overekspresjon delvis reduserte VEGF-sekresjon indusert av surstoffmangel i Ishikawa-celler (figur 3A). Derfor vurderte vi om impingement av SHARP1 på HIF-1α /VEGF uttrykk påvirker hypoksi-utløst angiogenese i EF. Vi har brukt flere fremgangsmåter for å undersøke hvorvidt og hvordan SHARP1 kunne regulere oppførselen til endotelceller. CM ble oppsamlet fra Ishikawa-celler transfektert med tom plasmid eller SHARP1 fullengde plasmid i henhold normoxia eller hypoksi i 24 timer. Spesielt, ble levedyktighet og migrering evne til HUVECs stimulert med CM fra hypoksiske Ishikawa-celler, mens CM fra hypoksiske Ishikawa-celler som overuttrykt SHARP1 inhiberte disse effektene (figur 3B og C). Som ingen åpenbare effekter av SHARP1 på VEGF-sekresjon, HUVEC levedyktighet og migrasjon ble observert etter normoxia, brukte vi CM fra Ishikawa celler transfektert med SHARP1 eller tomme plasmider etter hypoksi for å følge eksperimenter, og CM fra Ishikawa celler transfektert med tomme plasmider dyrket under normoxia som en negativ kontroll. For å bestemme hvorvidt SHARP1 endret den funksjonelle virkemåten av endotelceller, ble HUVECs plassert på en basalmembran matriks for å indusere kapillar-rør som dannelse i nærvær av CMs nevnt ovenfor. Rør Dannelse ble kvantifisert ved å midle den totale lengden av rørene i tre tilfeldig valgte felt. Tilsvarende CM fra SHARP1-overekspresjon Ishikawa celler betydelig hemmet hypoksi-stimulert tube dannelse og forgrening (figur 3D).
