Abstract
infiltrasjon av myeloide celler i svulsten mikromiljøet er ofte forbundet med økt angiogenese og tumorprogresjon, noe som resulterer i dårlig prognose i mange typer kreft. Polypeptidet chemokine PK2 (Bv8, PROK2) er blitt vist å regulere myeloid cellemobilisering fra benmargen, som fører til aktivering av den angiogene prosess, så vel som akkumulering av makrofager og nøytrofiler i tumorsetet. Nøytraliserende antistoffer mot PK2 ble vist å vise potent anti-tumor effekt, som illustrerer potensialet av PK2-antagonister som terapeutiske midler for behandling av kreft. I denne studien viser at det anti-tumor aktiviteten til et lite molekyl PK2 antagonist, PKRA7, i sammenheng med glioblastom og bukspyttkjertelcancer xenograft tumormodeller. For sterkt vaskularisert glioblastom, ble PKRA7 assosiert med redusert blodkaret tetthet og økt nekrotiske områder i tumormassen. I samsvar med den anti-angiogene aktivitet av PKRA7
in vivo
, denne forbindelsen effektivt redusert PK2-indusert mikrovaskulær endotelial celle forgrening
in vitro
. For dårlig vaskularisert kreft i bukspyttkjertelen, vises den primære anti-tumoreffekten til PKRA7 å være formidlet ved blokkering av myeloid celle migrasjon /infiltrasjon. På molekylært nivå, hemmer PKRA7 PK2-indusert ekspresjon av enkelte pro-trekkende chemokiner og kjemokinreseptorer i makrofager. Ved å kombinere PKRA7 behandling med standard kjemoterapeutiske midler resulterte i forbedrede virkninger i xenograft-modeller for begge typer tumor. Tatt sammen, våre resultater indikerer at anti-tumor aktiviteten til PKRA7 kan være mediert av to forskjellige mekanismer som er relevante patologiske trekk ved den spesifikke type kreft. Denne lille molekylet PK2 antagonist holder løftet som skal videreutvikles som et effektivt middel for combi kreftbehandling
Citation. Curtis VF, Wang H, Yang P, McLendon RE, Li X, Zhou Q-Y, et al. (2013) En PK2 /Bv8 /PROK2 Antagonist undertrykker Svulstfremkallende prosesser ved å hemme angiogenese i Glioma og blokkerer myelogen celleinfiltrasjon i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (1): e54916. doi: 10,1371 /journal.pone.0054916
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 25 juni 2011; Akseptert: 17. desember 2012; Publisert: 23 januar 2013
Copyright: © 2013 Curtis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette var støttet av CA151541 til XFW fra National Cancer Institute (www.cancer.gov) og ved MH67753 til QYZ fra National Institutes of Health (www.nimh.nih.gov). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
komplekset svulstens mikromiljø er en viktig bidragsyter til tumorigenesis. I de siste årene har økt fokus er lagt vekt på å målrette stromale celler i svulsten mikromiljøet som har ansvar for ulike deler av tumorigen prosessen. Benmargavledede myeloide celler, som er forløpere til makrofager, neutrofiler og myeloide-avledede suppressor celler, representerer en subpopulasjon av stromale celler som spiller viktige roller i løpet av tumorprogresjon [1]. Som respons på cytokiner /kjemokiner utskilt av tumorceller, kan myeloide celler bli mobilisert fra benmargen og infiltrere inn i tumor steder hvor de kan fremme vekst, invasjon og angiogenese for å støtte svulstvekst og metastase [2]. For eksempel kan CSF3 (kolonistimulerende faktor 3), også kjent som G-CSF, produsert av tumorceller fører til differensiering av CD11b
+ GR1
+ myeloide celler til neutrofiler, makrofager og dendrittiske celler, som har vist seg å være overprodusert i kreftpasienter og tumor-bærende mus [1], [3] – [4]. Ved tumorstedet, disse CD11b
+ GR1
+ myeloide celler utskiller en rekke faktorer som kan direkte bidrar til angiogenese og tumorvekst [5] – [6].
Blant de faktorer produsert av CD11b
+ GR1
+ myeloide celler prokineticin 2 (PROK2), referert til som PK2 i dette dokumentet, også kjent som Bv8. Som en av to medlemmer av prokineticin-familien, PK2 binder seg til to meget beslektede G-protein-koblede reseptorer (GPCR), PROKR1, referert til som PKR1 og PROKR2, referert til som PKR2, og påvirker flere biologiske prosesser, inkludert nocicepsjon, døgnrytme , gastrointestinal motilitet, nevrogenesen, hematopoiese og angiogenese [7]. PK2 produksjon av CD11b
+ GR1
+ myeloide celler kan føre til dannelse av en positiv tilbakekoblingssløyfe, med forbedret differensiering av disse myeloide forløperceller i makrofager, så vel som øket mobilisering av disse celler fra benmargen til blodet [8]. Disse differensierte makrofager kan deretter infiltrere svulsten mikromiljøet og fortsette å utskille mer PK2, som fører til økt spredning og migrasjon av endotelceller uttrykker PKR1 og PKR2, og dermed bidra til økt angiogenese [8]. I tillegg til å stimulere endotelceller, ble PK2 vist seg å påvirke cytokinproduksjon i mus lymfocytter, øke pro-inflammatoriske cytokiner IL-1B og IL-12 og minkende anti-inflammatoriske cytokiner IL-4 og IL-10 [9] – [10] . PK2 reseptorer er også uttrykt i musemakrofager og endotelceller; følgelig PK2 kan indusere migrering av disse makrofager og påvirke dannelsen av kapillære liknende strukturer av endoteliale celler [10] – [13]
På grunn av de viktige roller PK2 i etableringen av en svulst mikromiljøet favorisering tumor. vekst og progresjon, har PK2 blitt et mål for utvikling av nye kreftbehandlingen. En rekke studier har overbevisende vist at nøytraliserende antistoffer mot PK2 kunne oppvise en potent antitumoreffekt på flere typer humane cancere i musemodeller [1], [6], [8]. De positive resultatene fra proof-of-prinsippet type eksperimenter har lagt grunnlaget for videre utvikling av anti-PK2 midler til behandlingsformer. I denne studien, rapporterer vi våre funn på anti-tumor aktivitet av en syntetisk lite molekyl av PK2 antagonist, PKRA7 som kan konkurrere om bindingen av PK2 til sine reseptorer PKR1 og PKR2 følgelig hemme evnen til PK2 å aktivere nedstrøms trasé [ ,,,0],Zhou, manuskript under utarbeidelse]. Vi valgte å teste PKRA7 i to tumortyper, glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen, som har vedvarende utviste de verste prognosene blant alle krefttilfeller på grunn av mangelen på effektiv behandling. De to typer kreft skjerm drastisk forskjellige patologiske funksjoner. Glioblastom er sterkt vaskularisert og har vist en viss følsomhet for anti-angiogene terapi, mens kreft i bukspyttkjertelen er ofte dårlig vaskulariserte men sterkt fibrotisk med en stor del av tumormasse bestående av stromale komponenter, inkludert infiltrerte makrofager [14] – [16]. Men en felles funksjon av både glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen er involvering av myeloide celler [17] – [20]. Vi håpet å finne ut om PKRA7 kunne ha en innvirkning på tumorvekst gjennom sin hemmende effekt på myeloide celler. I samsvar med dette postulering våre resultater viser tydelig at PKRA7 besitter en sterk anti-tumoraktivitet for begge typer kreft, selv gjennom ulike mekanismer. Videre vår studie viser at PKRA7 har potensial til å bli en del av kombinasjonsterapier med standard behandling i dag brukes i klinikken og denne forbindelsen holder løftet for videre utvikling for behandling av disse kreftformer som i dag har svært dårlig prognose.
Resultater
PKRA7 Undertrykker tumorvekst i Nude (nu /nu) mus Xenotransplantat Modell av Glioblastoma gjennom hemming av angiogenese
Selv om en anti-PK2 nøytraliserende antistoffer ble funnet ved tidligere studier å vise anti- tumor aktivitet, vi utforsket muligheten for at små molekyler kan utvikles for å oppnå den samme anti-tumor effekt med lavere kostnader og enklere levering. Etter biokjemisk å definere den molekylære natur av interaksjonen mellom PK2 og dets reseptorer [21] har vi fastslått at heksapeptid aminosyresekvensen AVTIGA i den N-terminale ende av PK2 er fullstendig talt blant pattedyr og ikke-pattedyr-arter, og er kritisk for aktivering PKR1 og PKR2 [22]. Mutasjoner i denne regionen, inkludert en A1M (alanin til metionin) erstatning eller tilføyelse av metionin til N-terminalen vises sterk antagonist aktivitet i nærvær av både PKR1 og PKR2 stabilt uttrykt på kinesisk hamster ovarie (CHO) celler [22]. Etter denne første oppdagelsen, har vi syntetisert over 200 små molekyl forbindelser som strukturelt ligner PK2 N-terminal region mutant peptider og testet deres evne til kompetitivt hemmer aktiveringen av PK2 reseptorer. Fra denne startbildet, har vi funnet over 60 vannløselige forbindelser som utviser inhiberende effekt på PK2-reseptor-interaksjon med binding konstant under 20 nM (Zhou, manuskript under forberedelse). Vi har valgt forbindelsen PKRA7 for våre eksperimenter fordi det kan potente hemmere PK2 reseptorer med IC50-verdier på 5,0 og 8,2 nM for PKR1 og PKR2, henholdsvis (fig S1), og, enda viktigere, det kan trenge gjennom blod-hjerne-barrieren, en funksjon som kan være avgjørende for behandling av glioblastom.
for å studere
in vivo
effekten av PKRA7 på glioblastom tumorvekst, må vi først generert subkutane menneskelig glioblastom tumorxenotransplantater i nakne mus. 5 x 10
4 D456MG glioma-celler ble implantert i naken mus som ti subkutant og musene ble delt i to behandlingsgrupper 14 dager etter implantasjon. Musene i den første gruppen mottok en intraperitoneal (IP) kontroll behandling av PEG400 (polyetylenglykol) fortynnet 1:10 i PBS, mens den andre gruppen av mus fikk IP-injeksjoner av PKRA7 i den samme oppløsning ved en dose på 20 mg /kg /dag. Tumor størrelser ble overvåket hver tredje dag og vekstkurver ble generert (figur 1A). 30 dager etter implantering, ble tumorene isolert etter ble musene avlivet og veid (figur 1B). Mus behandlet med PKRA7 viste en klar nedgang i både D456MG tumorvekst og tumorvekten. For å bestemme den mekanismen som PKRA7 inhiberte xenograft tumorvekst, målte vi mulige forandringer i blodkaret tetthet og grad av nekrose i D456MG tumorer behandlet eller ubehandlet med denne forbindelsen. Som vist i figur 1C-F, ble det observert en betydelig reduksjon i relativ blodåre tetthet og en betydelig økning i områder av nekrotiske områder av PKRA7-behandlede tumorer sammenlignet med kontroller, noe som tyder på at PKRA7 kan undertrykke tumordannelsen i første rekke ved å hemme angiogenese igjennom PKR1 og PKR2 uttrykkes på endotel-celler på en lignende måte som den PK2-neutrolizing antistoffer [8], [12] – [13].
(A) D456MG celler ble injisert SC nakne mus, og kontroll ( n = 5) eller PKRA7 (n = 5) behandling ble igangsatt når tumorer ble visuelt påvisbare (14 dager). Målingene ble foretatt hver 2-3 dager. (B) Gjennomsnittlig tumorvekt av kontroll- og PKRA7-behandlede mus tumorer etter fjerning. (C) IHC flekker ved hjelp av CD34 endotelceller markør i D456MG SC svulster fra mus behandlet med kontroll eller PKRA7. (D) Kumulativ sannsynlighet for fartøyet relativ densitet som målt ved CD34-farging. Vaskulær tetthet av svulster redusert med PKRA7 behandling. (E) Representative bilder av H E farging av seksjoner fra kontroll og PKRA7 behandlet SC svulster (F) Kvantifisering av nekrotiske områder fra 5 lysbilder av hver svulst per behandlingsgruppe, prosenter av nekrotiske områder ble målt ved ImageJ (* p≤0.05 ). (G) 1 × 10
4 D456MG celler var IC injisert i hårløse mus og behandling opprettet 7 dager etter tumor implantasjon. Mus kontroll (n = 8) eller PKRA7 behandling (n = 9) gruppe ble avlivet da de utviklet alvorlig nevrologisk fenotype tegn på tumorvekst intracranially.
Basert på disse lovende resultater med undertrykkelse av underhudsfett tumordannelse ved PKRA7, benyttet vi intrakraniell inokulering av gliomceller for å vurdere evnen til PKRA7 til å hemme tumorvekst i et patologisk relevante innstillingen. Denne gangen startet behandlingen 7 dager etter 1 × 10
4 D456MG glioma celle inokulasjon med daglige IP injeksjoner av PKRA7 eller kjøretøy kontroll. Mus ble ofret da nevrologiske tegn på voksende tumor byrde ble tydelig og datoene ble registrert for å generere en Kaplan-Meier kurve (figur 1G). I denne analysen behandling med PKRA7 merkbart forlenget angrep av nevrologiske tegn på tumorbyrden (gjennomsnittlig overlevelse på 38,4 dager, sammenlignet med 34,1 dager for PKRA7 og kontroll, respektivt, p≤0.05), som indikerer at PKRA7 var effektiv til å inhibere tumorvekst i intrakraniell miljø. Lignende resultater ble oppnådd med en annen glioma cellelinje som for D456G celler (data ikke vist).
PKRA7 Undertrykker tumorvekst i Nude (nu /nu) mus Xenotransplantat Modell av bukspyttkjertelkreft gjennom hemming av makrofagin
Vi neste testet om PKRA7 kunne ha en innvirkning på xenograft vekst av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler på grunn av den veletablerte rolle myeloide celler i dannelsen av kreft i bukspyttkjertelen. 5 x 10
5 ASPC-1-celler ble inokulert i nakne mus subkutant og behandlingen begynte 7 dager etter implantasjon og fulgte samme prosedyre som med D456MG gliomceller. Som vist i figur 2A, ble veksthastigheten til ASPC-1-celler undertrykkes av PKRA7, noe som resulterer i en betydelig reduksjon i den gjennomsnittlige vekt av de tumorer (figur 2B). Lignende resultater ble oppnådd når en annen human bukspyttkjertelkreft cellelinje, CFPac-1, ble anvendt i stedet for ASPC-1-celler (Figur S2).
(A) ASPC-1-celler ble injisert SC nakne mus og kontroll (n = 4) eller PKRA7 (n = 5) behandling ble igangsatt når tumorer ble visuelt påvisbare (9 dager). Målingene ble foretatt hver 2-3 dager. (B) Gjennomsnittlig tumorvekt av kontroll- og PKRA7-behandlede mus svulster etter fjerning (* p≤0.05). (C) Representant H E glir fra kontroll og PKRA7 behandlet svulster. (D) Kvantifisering av nekrotiske områder fra 5 lysbilder av hver svulst per behandlingsgruppe, ble prosenter av nekrotiske områder målt ved ImageJ (p = 0,205719). (E) IHC flekker ved hjelp av F4 /80 mus makrofag markør for ASPC-1 SC svulster behandlet med kontroll eller PKRA7. (F) Kvantifisering av gjennomsnitt makrofag infiltrering av ASPC-1-tumorer behandlet med kontroll (n = 4) eller PKRA7 (n = 5), 5 lysbilder av hver tumor per behandlingsgruppe (* p≤0.05).
for å fastslå potensialet mekanismen bak den betydelige reduksjonen i tumorvekst skyldes PKRA7 behandling, undersøkte vi tumorsnitt etter tegn på endringer i angiogenese og nekrose. Det var ingen forskjell i tettheten av blodkar, selv om det var færre fartøy pr synsfelt observert sammenlignet med glioblastom seksjoner (data ikke vist) og ble observert tilsvarende nivåer av nekrose av tumorer avledet fra behandlede og kontrollmus (Figur 2C D). I motsetning til dette, var det en signifikant reduksjon i antall makrofager infiltrerte inn i tumorene isolert fra PKRA7-behandlede mus som målt ved farging Intensiteten av mus makrofag markør F4 /80 (figur 2E, F). Disse resultatene antyder sterkt at PKRA7 kunne hemme bukspyttkjerteltumorvekst via en annen mekanisme ved å blokkere PKR1- og PKR2-uttrykker makrofager fra infiltrere inn i svulsten mikromiljøet i stedet for å undertrykke angiogenese, en observasjon i samsvar med fenotypiske trekk ved menneskelig kreft i bukspyttkjertelen som dårlig vaskualisert men stille rikelig desmoplastic fibrose og inneholder stort antall infiltrerte myeloide celler inkludert makrofager [10], [15].
PKRA7 Hemmer endotelcelle Capillary Forgrening og myelogen Cell Migration
resultatene fra
in vivo
xenograft studier av menneskelig glioma og kreft i bukspyttkjertelen celler sterkt støttet tanken om at anti-tumor aktivitet av PKRA7 kan formidles via to svært forskjellige mekanismer. For å undersøke dette videre på cellenivå, gjennomførte vi
in vitro
analyser for å vurdere virkningen av PKRA7 på angiogen aktivitet av endotelceller, samt den vandrende evne av myeloide celler. For å avgjøre om PKRA7 påvirker evnen av endotelceller å danne kapillarrør-lignende nettverk som en viktig indikator på angiogenese [23], ansatt vi udødelig humane mikrovaskulære endotelceller (IHMVECs). Cellene ble behandlet med 200 ng /ml rekombinant PK2 alene eller PK2 pluss 1 pg /ml PKRA7 og sådd ut på et tynt lag av Matrigel. Denne konsentrasjonen av PKRA7 ble brukt i våre
in vitro
eksperimenter fordi det er nær konsentrasjonen av PKRA7 i sirkulasjon av mus fra vår
in vivo
eksperimenter mens de resterende ikke-giftig for cellene i vevskultur (data ikke vist). Som vist i figur 3A, PKRA7 effektivt hemmet PK2-indusert kapillær forgrening som målt ved antallet av forbindelser mellom cellene, men hadde ingen virkning på VEGFA-indusert kapillær forgrening (kvantifisering presentert i figur 3B). Identiske resultater ble oppnådd under anvendelse av to ytterligere endoteliske cellelinjer: mus embryonale endotelceller og primære, humane mikrovaskulære endotelceller (data ikke vist). Spesifisiteten til anti-PK2 aktivitet i denne analysen ble ytterligere bekreftet ved påvisning av en lignende effekt av anti-PK2 polyklonalt antiserum (figur S3 og data ikke vist). Tatt sammen tyder disse resultater på at PKRA7 spesifikt kan hemme den angiogene effekten av PK2 på endotelceller.
(A) IHMVECs ble sådd ut på Matrigel i angitte behandlingsgruppene. Representative fotografier ble tatt ved 8 timer etter utplating. (B) Gjennomsnittlig antall forbindelser mellom cellene ble telt og analysert. Resultatene er normaliserte data fra 3 uavhengige eksperimenter. Tilsetting av PKRA7 betydelig blokker PK2-indusert kapillær forgrening (* p≤0.05). (C) 1 x 10
5 THP-1-celler på toppen av kammeret transwells ble tillatt å migrere i 4 timer. Celler ble fiksert, farget og antallet celler pr synsfelt telles. Resultatene er den normaliserte gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter. Tilsetting av PKRA7 betydelig blokkert PK2-indusert monocytt migrasjon (* p≤0.05). (D) 7,5 x 10
4 RAW264.7 celler på toppen av kammeret transwells ble tillatt å migrere i 18 timer. Celler ble fiksert, farget og antallet celler pr synsfelt telles. Resultatene er den normaliserte gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter. Tilsetting av PKRA7 betydelig blokkert PK2-indusert makrofag migrasjon (* p≤0.05). (E) Gjennomsnittlig målte luminescens svulst området etter IP injeksjon av luciferase-merket RAW-celler til kontroll (n = 4) eller PKRA7 (n = 4) behandlede mus med SC ASPC-1 svulster 30 dager etter implantasjon. Gjennomsnittlig total luciferasepreparater teller var lavere i mus behandlet med PKRA7 sammenlignet med kontrollgruppen (* p≤0.05). (F) qPCR-analyse for å måle effekten av PKRA7 på ekspresjon av kjemokiner og kjemokinreseptorer som ble identifisert til å bli indusert av PK2 behandling. Data på mRNA-nivå endringer ble vist som log2 av CT verdiendringer. PKRA7 hemmer oppregulering av CCL27, CCR10, CCR4, CCR5, og CCR6 (* p≤0.05).
For å bestemme effekten av PKRA7 på PK2-indusert migrering av myeloide celler, vi ansatt menneske monocytt cellelinje THP-1 ved hjelp av en transwell migrasjonsanalyse. Som vist i figur 3C, 1 ug /ml PKRA7 effektivt svekkes den PK2-indusert migrering av THP-1-celler, men ikke migrering av disse cellene overfor CCL2 eller monocytt chemotatic protein 1 (MCP-1), en kjent kjemotiltrekkende av THP -1 [24] – [25]. Nesten identiske resultater ble observert med mus makrofag-cellelinjen, RAW264.7 med PKRA7 spesifikt blokkerer PK2-indusert migrasjon, men ikke migrering indusert av CXCL12, her referert til som SDF-1α (figur 3D). Derfor PKRA7 hemmer spesifikt PK2-indusert migrering av myeloide celler fra både menneskelige og murine opprinnelse.
For å vurdere virkningen av PKRA7 om migrasjon /infiltrasjon av mus makrofager i mikromiljøet av xenografttumorer dannet av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler målte vi ansamling i svulster luciferase-merket RAW264.7 makrofagceller 24 timer etter deres IP injeksjon i nakne mus 30 dager etter subkutan implantasjon av ASPC-en kreftceller. Som vist i figur 3E, ble en signifikant nedgang i luminiserende signal som utsendes av de muse makrofagceller observert hos mus behandlet med PKRA7 i forhold til den for kontrollmusene. Disse resultatene indikerer at PKRA7 er i stand til å blokkere makrofag migrerings /infiltrering inn i tumorstedet i en
in vivo
innstilling, og dermed hemme evnen til makrofagene til å bidra positivt til veksten av xenograft tumorer.
for ytterligere å undersøke mekanismen som PKRA7 blokker PK2-indusert makrofag migrasjon, utførte vi en cytokin array ved hjelp av kvantitativ-real time PCR på THP-1 celler som ble overtalt til å differensiere til makroceller. Blant en rekke 95 menneskelige chemokine /cytokin ligander og deres reseptorer, fem viste en signifikant induksjon i deres uttrykk etter behandling med PK2 inkludert CCL27, CCR10, CCR4, CCR5, og CCR6 (figur S4). Viktigere, minst fire av disse induserte molekyler er kjent for å være involvert i å forbedre overføringen av myeloide celler og alle deres induksjon ved PK2 ble avstumpet ved PKRA7 (figur 3F), sterkt tyder på at undertrykkelsen av PK2-indusert produksjon av disse kjemokiner og reseptorer ligger under den primære mekanismen av anti-tumor aktivitet av PKRA7 i sammenheng med kreft i bukspyttkjertelen.
PKRA7 Forbedrer Effekt av Standard Terapi for Glioblastoma og kreft i bukspyttkjertelen i xenograft modeller,
Selv om PKRA7 vises sterke anti-svulst aktiviteter i sammenhenger av både glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen, er det lite sannsynlig å bli utviklet til et terapeutisk middel brukes alene. For å teste hvorvidt PKRA7 kunne øke effekten av standard kjemoterapeutisk behandling av glioblastom, undersøkte vi effekten av denne forbindelsen i kombinasjon med temozolomid som for tiden benyttes i klinikken for denne sykdommen [26] – [27]. Etter en etablert eksperimentell prosedyre for å evaluere effekten av kombinasjonsterapi i xenograft musemodeller [28] – [29], 1 x 10
4 D456MG-celler ble implantert intracranially og etterfulgt av behandling med 10 mg /kg temozolomid i fem dager, og deretter med eller uten PKRA7 administrering i løpet av de resterende dagene i eksperimentene. Som vist i figur 4A, behandling med både temozolomid og PKRA7 forlenget utbruddet av nevrologiske tegn på tumormasser sammenlignet med mus som mottok kontroll, temozolomid eller PKRA7 alene, noe som indikerer en forbedret effekt av kombinasjonsterapi med midler til å inhibere intrakranial gliom vekst i nakne mus (gjennomsnittlig overlevelse på 49,8 dager for PKRA7 pluss temozolomid vs 44,6 dager for enten temozolomid eller PKRA7 alene vs 38,6 dager for kontroll).
(A) Kaplan-Meier kurve for hårløse mus etter temozolomid og PKRA7 behandling etter IC injeksjon av 1 × 10
4 D456MG celler. Behandling med 10 mg /kg temozolomid eller kontroll startet 3 dager etter injeksjon IC for en total av 5 påfølgende daglige behandlinger. Behandling med PKRA7 eller kontroll opprettet 7 dager etter IC injeksjonen og fortsatte i løpet av eksperimentet. 5 mus per tilstand. (B) ASPC-1-celler ble injisert SC nakne mus, og kontroll (n = 10) eller PKRA7 (n = 10) behandlingen ble påbegynt da tumorene var synlige (7 dager). Behandling med 100 mg /kg gemcitabin (n = 10) eller kontroll (n = 10) opprettet 7 dager etter tumor-implantasjon og ble administrert hver 4. dag i to uker i totalt 4 behandlinger (#). Målinger ble tatt hver 3. dag. 5 mus per tilstand. (C) Gjennomsnittlig tumorvekt av kontroll, gemcitabin, gemcitabin og PKRA7 pluss PKRA7-behandlede mus svulster etter deres fjerning (* p≤0.05).
For kreft i bukspyttkjertelen, er gemcitabin en av de viktigste kjemoterapeutiske legemidler i dag brukes i klinikken, og det ble testet tidligere i kombinasjonsbehandling involverer ASPC-1 celler [30]. I våre eksperimenter, 5 x 10
5 ASPC-1-celler ble subkutant implantert i nakne mus som ble behandlet med PKRA7 og gemcitabin (100 mg /kg) 7 dager senere. Som vist i figur 4B, er det klart at tumorer fra mus som mottok både gemcitabin og PKRA7 var betydelig mindre enn dem fra mus som ble behandlet med bare gemcitabin eller PKRA7. Disse resultatene tyder på at kombinasjonsterapi med gemcitabin og PKRA7 kunne ha en sterkere anti-tumoreffekt enn standardbehandling for å redusere kreft i bukspyttkjertelen xenograft tumorvekst i modellen.
diskusjon
tumorgenese er en kompleks prosess som involverer mye mer enn prolifererende tumorceller. Tumorcellene blir hjulpet og understøttet av den omgivende svulsten stromal mikromiljø som er rik med en heterogen blanding av celler slik som fibroblaster, endotelceller og immunceller [31]. Disse cellene svare på signaler fra den voksende svulsten ved å skille faktorer av sine egne som kan hevde vekst signal, renovere den ekstracellulære matrise, bidrar til angiogenese og omdirigere rollen av immunceller. Angiogenese har lenge vært forstått å være en viktig del av tumordannelse, og mange studier har blitt gjort for å blokkere denne prosessen [32]. Mens viktige angiogene faktorer har blitt identifisert som VEGF, har legemiddel mot VEGF signalveien ikke vist seg å være universelt vellykket. Faktisk er mange kreftformer er resistente mot anti-VEGF-terapi eller bli motstandsdyktige overfor administrering av disse behandlinger, noe som resulterer i gjentakelse som noen ganger er mer aggressiv enn primærtumor [14], [16], [33] -. [38]
Det er behov for å identifisere og målrette flere signalveier som kan bidra til angiogenese eller andre prosesser som har vist seg å være viktig for tumorprogresjon som makrofag infiltrasjon. PK2 og dets reseptorer er del av en signalveien som er involvert i myeloid cellemobilisering [8]. Flere studier har vist at CD11b
+ GR1
+ myeloide forløperceller kan bidra til angiogenese og tumordannelse i en rekke forskjellige krefttyper [8], [37], [39]. Makrofager er avledet fra disse forløper celler i svulsten mikromiljøet kan også skille ut cytokiner som direkte påvirker tumorcellevekst. I senere studier har anti-tumor effekt av et anti-PK2-antistoff blitt sammenlignet med behandling med et anti-VEGF-antistoff og funnet å være like effektive i å forebygge sykdomsprogresjon av en transgen musemodell for pankreas β-celle tumorgenese, mens kombinasjonen av de to antistoffer viste en enda mer uttalt effekt på inhibering av veksten av subkutane forskjellige humane kreftcellelinjer (tykktarmskreft, rhabdomyosarkom) og musetumorceller (mastocytom, lymfom) [8], [39]. Anti-PK2 antistoffbehandlingen også redusert antall sirkulerende og tumor-infiltrerende CD11b
+ GR1
+ myeloide celler, inkludert benmarg-avledede makrofager, som har vært vist å mediere Ingen respons til anti-VEGF-terapi i flere mus xenograft tumormodeller [8], [37]. Disse studier har indikert PK2 som et legitimt mål for kreftbehandling.
Antistoff-basert terapi representerer en betydelig del av kreft behandlingstilbud i dagens klinikker. Imidlertid har studier med pasienter og musemodeller av glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen vist at disse typer kreft kan være motstandsdyktig eller ildfast til anti-VEGF-signaliseringsbehandlings [14], [16], [33], [35] – [37] . Andre studier har vist at dette motstandsdyktig responsen kan være felles for flere typer kreft som brystkreft og tykktarmskreft [34], [40] – [41]. Pasienter kan derfor dra nytte av flere behandlinger som er rettet mot alternative veier i kombinasjon med anti-VEGF signal terapi for å hindre ildfaste svar. Således lavmolekylære inhibitorer tilbyr et alternativ terapeutisk tilnærming fordi de kan likevel være spesifikke til sine mål som samtidig er mer kostnadseffektivt å produsere. Dessuten er noen legemiddelterapier som kreves for å krysse blod-hjerne-barrieren for å behandle sykdommer så som glioblastoma og lavmolekylære inhibitorer er gode kandidater for dette formål. I denne forbindelse, vår demonstrasjon av at PKRA7 er i stand til å penetrere blod-hjerne-barrieren i mus og virker til å hemme intrakranial xenograft svulstdannelse av gliomceller presenterer en alternativ strategi for å hemme tumor angiogenese via en mekanisme som er forskjellig fra anti-VEGF siden PK2 forbedrer angiogenese gjennom G-protein-koblede reseptor-aktivert trasé [7].
Desmoplastic stroma er en definerende egenskap for kreft i bukspyttkjertelen, og kan inneholde høye nivåer av tumorassosierte makrofager (TAM), spesielt ved invasiv fram av kreft i bukspyttkjertelen [15], [18]. Denne infiltrering av makrofager er antatt å bidra til sykdomsprogresjon og er assosiert med dårlig prognose [18]. Nyere studier rapporterer at immunsuppressive celler, inkludert TAMs, myeloid-avledede suppressorceller (MDSCs) og regulatoriske T-celler (T
reg) ble funnet i høye nivåer i begynnelsen til slutten stadier av progresjon kreft sammenlignet med normalt vev i en musemodell av pre-invasive og invasive bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom [42]. PK2 kan spille en avgjørende rolle i den komplekse og dynamiske forhold mellom kreft i bukspyttkjertelen celler og disse stromale celler gjennom regulering av rekruttering og aktivitet av myeloide celler. Faktisk har vi funnet at PK2 induserer produksjon av kjemokiner og reseptorer som er involvert i overføringen av myeloide celler og PKRA7 kan blokkere denne induksjon (figur 3F). De kjemokinreseptorer, CCR10 og CCR4, kjent for å svare på chemo-lokke CCL27, MCP-1, og CCL22, har vist seg å være kritisk ved indusering og mobilisering homing av myeloide celler og leukocytter til tumorstedet [43]. Kjemokinreseptoren CCR6 og dens ligand CCL20 har vært implisert i dendrittiske cellemigrering og synes å være viktig for å opprettholde et normalt nivå av makrofagen befolkningen siden CCR6
– /- mus viste redusert antall makroceller [44]. Våre undersøkelser viste at pankreastumorer er dårlig vaskularisert og inneholder relativt få endotelceller i de ubehandlede mus og bekreftet at eventuelle forandringer i vaskulær tetthet på grunn av PKR hemming av PKRA7 i de behandlede mus ville sannsynligvis være meget liten og vanskelig å oppdage.
