Abstract
Immunosignaturing viser løfte som en generell tilnærming til diagnostisering. Det har vist seg å detektere immunologiske tegn på infeksjon tidlig under sykdomsforløpet og til å skille Alzheimers sykdom fra friske kontroller. Her tester vi om immunosignatures tilsvarer kliniske klassifiseringer av sykdom ved bruk av prøver fra mennesker med hjernesvulster. Blodprøver fra pasienter som gjennomgår craniotomies for terapeutisk naive hjernesvulster med diagnoser av astrocytom (23 prøver),
glioblastoma multiforme product: (22 prøver), blandet oligodendroglioma /astrocytom (16 prøver), oligodendroglioma (18 prøver), og 34 ellers friske kontroller ble testet av immunosignature. Fordi prøvene ble tatt før adjuvant behandling, er de neppe bli forstyrret av ikke-kreft relatert påvirker. Den immunosignaturing plattform utmerker seg ikke bare hjernekreft fra kontroller, men også patologisk viktige funksjoner om tumor inkludert type, grad, og tilstedeværelse eller fravær av O
6-metyl-guanin-DNA-metyltransferase metylering promoter (MGMT), en viktig biomarkør som spår respons på temozolomid i
Glioblastoma multiformae
pasienter
Citation. Hughes AK, Cichacz Z, Scheck A, Coons SW, Johnston SA, Stafford P (2012) Immunosignaturing kan oppdage Produkter fra molekylære markører i Brain kreft. PLoS ONE syv (7): e40201. doi: 10,1371 /journal.pone.0040201
Redaktør: Ernesto T. Marques, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 15 februar 2012; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 16.07.2012
Copyright: © 2012 Hughes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funds komme fra oppstart til SAJ fra delstaten Arizona. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
identifikasjon av biomarkører for presymptomatic påvisning av sykdom og klassifisering av eksisterende sykdomstilstander kan gi en rask og rimelig supplement til standard patologisk diagnose. Forskere fortsette å søke etter blodbårne protein biomarkør (e) for påvisning av kreft, men følsomhet holder seg hardnakket lav [1], [2]. Immunovervåkning, men det oppstår kontinuerlig, og er ganske følsomme for endringer antigen-profiler [3], [4], [5], [6], [7]. Det er blitt vist at kreftceller frembringe en påvisbar humoral immunrespons [6], [7]. Antistoffer gjøre gode biomarkører fordi de er stabile i serum, har høy spesifisitet og affinitet til deres beslektet antigen, er rikelig, og muliggjøre retrospektive studier. Av en aktivert B-celle kan produsere antistoffer 5000-20,000 per minutt, [8], [9], mens replikerende hver ~70 hr [10] med en levetid inntil 4½ måneder [11], [12], som fører til 10
11 amplifikasjon av et spesifikt signal per uke. Antistoffbaserte biomarkører unngå utvanning problem sett med proteomikk biomarkører [13], [14] og i er ikke bare svært rikelig, men kan være fysisk fanget på nano- og picomolar slektskap. Videre urensede antistoffer er stabile, slik at arkiv prøver som skal brukes til testing hvor RNA eller proteiner kan ha degradert [15]. Den store hinder for å bruke antistoffer som biomarkører har vært vår manglende evne til dekonvolvere den tette informasjonen i antistoffer som de finnes i et komplekst miljø [16]. Det er 10
9 egne særegenheter i blodet hos en gjennomsnittlig voksen, mer enn det som kan bli undersøkt individuelt. Fingerprinting kreftantistoffer har jobbet i det siste [17], [18] men dette har vært en tung oppgave. Vi introduserte immunosignaturing som en enkel og svært rimelig tilnærming til diagnostikk. Her tar vi hvorvidt immunosignatures er korrelert til biologiske eller kliniske klassifiseringer.
Kreftceller kan fremkalle produksjon av antistoffer mot selvantigener eller mot neo-antigener [3], [18], [19], [20 ], [21], [22], [23], [24]. Vi har ingen
a priori
måte å fastslå nøyaktig hva profil av antigener vil bli presentert av en kreftcelle (selv om analyse av EST biblioteker kan foreslå kandidater). Således, skaper en epitop eller protein microarray stand til å påvise kreftspesifikke antigener ville være vanskelig. Selv om fagdisplay har vist seg å påvise antistoffer som er spesifikke for kreft [17], [18], [25], for en rekke tekniske og praktiske grunner panorering er ikke mottagelig som et diagnostisk verktøy. Vi skapte en engangsmicroarray består av 10.000 ulike tilfeldig sekvens peptider. Vi bruker 20mer-peptider som inneholder alle mulige aminosyrer, bortsett fra at cystein som vi bruker som en linker. Disse 20mers kan inneholde minst 7 typisk store epitoper. Fag-display og epitop microarrays tendens til å bruke kortere peptider for å hindre krysstale og vedlikeholde spesifisitet; i vårt tilfelle, lengre peptider tillate oss å utvide kompleksiteten i vår microarray som har relativt få funksjoner. Også, arrays utviser ekstremt høy reproduserbarhet, slik at selv små forskjeller i bindingen mellom antistoff og peptid kan være betydelig. Peptidene er trykt på svært høy tetthet, en viktig faktor når du bruker tilfeldige peptider for å påvise antistoffer som binder ved mikromolare eller millimolar slektskap [26]. Tettheten av disse vilkårlige sekvens peptider på overflaten av den mikromatrise skaper en aviditet aktig påvirke hvor off-rate er bremset med flere størrelsesordener, forsterke de svake men reproduserbare interaksjoner mellom antistoff og peptid. Mønstre blir synlig, og er så reproduserbare at sub-klassifisering av sykdommer er gjennomførbart. Selv om matrisen har en effektiv mange-til-mange-relasjon mellom antistoff og peptid, mønstrene som produseres er på ingen måte monoton; faktisk er de ganske skiller seg fra sykdom til sykdom. Således er den «immunosignature» definert som den felles mønster av binding som deles av pasienter med en gitt sykdom, men ikke med en annen sykdom eller med friske kontrollpersoner [27], [28], [29], [30].
Vi spurte om antistoffer dannet mot kreftceller kan være relatert til, eller fungere som en proxy for, klinisk nyttige sykdoms biomarkører. For å svare på spørsmålet, fokuserte vi på ondartede hjernesvulster. Selv om forekomsten av kreft i hjernen er relativt lavt sammenlignet med andre kreftformer som brystkreft og lungekreft,
Glioblastoma multiformae plakater (GBM) er en av de mest dødelige og aggressive svulster med topper av forekomst i både yngre og eldre populasjoner [31 ], [32]. De vanligste ondartede hjernesvulster er astrocytomas, som består av klasse II, klasse III (anaplastisk) og klasse IV (GBM). Ondartede svulster kan også oppstå fra oligodendrocytes og anses lav karakter oligodendroglioma (grad II) og anaplastisk oligodendroglioma (grad III). Det er også blandet oligoastrocytomas (lav karakter og anaplastiske). Menigiomas oppstå fra de araknoide celler som dekker hjernen og er vanligvis godartet, men kan gjenoppstå. En liten andel av disse kan utvikle seg til høyere karakterer som er mer invasive. Faktisk, kan pasienter med hvilken som helst av tumortyper som er nevnt presentere seg med en høy grad av tumor i utgangspunktet, eller de kan utvikle seg over tid. Mens diagnostisering av noen av disse svulster kan være relativt enkel, er for eksempel ikke alltid tilfelle, [33], [34]. Neuropathologists står overfor utfordringen med å lage konsistente samtaler – et ikke-subjektive biomarkør panel som kan skille mellom disse ulike typer og grader av hjernesvulster vil være svært nyttig i å eliminere lab-til-lab varians. I denne artikkelen presenterer vi data som viser resultatene av vår immunosignaturing plattform for å identifisere en rekke hjernetumortyper og subtyper.
Resultater
Immunosignaturing kan skille GBMS av andre sykdommer
Tidligere publiserte resultater fra vårt laboratorium [26], [28], [29], [30] har vist signaturer for Alzheimers sykdom, smittsomme sykdommer, monoklonale og polyklonale antistoffer. Først, testet vi hypotesen om at en autoimmun reaksjon oppstår hos pasienter som lider av kreft i hjernen. For å gjøre dette, utsettes vi serum fra 5 tilfeldig utvalgte GBM pasienter fra vår pasient kohort og 3 tilfeldig utvalgte sunne, alder-matchet kontroller til Livet Technologies «ProtoArray®. Etter kontroll for den falske funnrate, ble ingen signifikant reaktivitet til noen protein på ProtoArray sett, enten for friske kontroller eller kreftpasienter. Gitt dette, spurte vi om kreft var påviselig i det hele tatt på vår peptid microarray, og om ulike krefttyper produsert forskjellige mønstre av bindende. Faktisk, kreft og infeksjonssykdommer både produsere et reproduserbart mønster; Figur 1 viser de 100 mest betydningsfulle peptider valgte å bruke en-veis ANOVA med p 1,06 × 10
-13 over 28 brystkreftpasienter, 19 friske kontroller, 10 pasienter GBM og 9 pasienter med disseminert
Coccidiodes immitis
(Valley Fever). Klassene på sykdom var samtidig merkbar med 0% permisjon en ut kryssvalideringsfeil ved hjelp av både lineær diskriminant analyse og støtte Vector Machine Ved klassifisering av disse pasientene. Vi konkluderer med at GBM hjernen kreftprøver har immunosignature mønstre skjelnes fra andre sykdommer.
heatmap presenteres her skiller 4 forskjellige sykdommer ved hjelp av 70-peptider som er identifisert som den mest betydningsfulle ved hjelp av en en-veis ANOVA over 27 brystkreftpasienter , 19 friske kontroller, 10
Gliobastoma multiformae
pasienter, og 9-dalen Fever pasienter. Klassifisering nøyaktighet var 100% ved bruk av både lineær diskriminant analyse og Support Vector Machines og la en ut kryssvalidering.
Immunosignature var Reproduserbar tvers av ulike prøvesett og over tid
I 2007 prøver fra 13 GBM pasienter og 45 friske kontroll frivillige ble drevet som et proof-of rektor eksperiment. I 2010 ble 14 forskjellige GBM pasienter og 13 forskjellige friske kontroller kjøres på immunosignature peptid microarray. I de mellomliggende 3 år, ble mange endringer i trykk og skyv overflatekjemi implementert, så peptid-to-peptid reproduserbarhet forbedret fra en gjennomsnittlig variasjonskoeffisient per array 50% til 15%. Tidligere har vi brukt in-house belagt aminosilan lysbilder og en Nanoprint 60 med Telechem SMP2 pins å kontakte utskrifts peptider i en 1-up design. Currently Applied Mikromatriser (Tempe, AZ) piezo utskrifter peptider bort på Schott (Jena, Tyskland) Nexterion A + aminosilan-belagt lysbilder ved hjelp av piezo avsetning for å skrive ut 10.000 peptider i en 2-up design [26]. Men selv med disse betydelige endringer og bruk av nye prøver, mange av peptider fra 2007 hadde lignende klassifisering ytelse
Vi fant 55 peptider med en t-test p-verdi. 1 x 10
– 6 mellom 45 kontroller og 13 GBM pasienter (figur 2, venstre). Vi gjentok forsøket med 14 GBM og 13 kontrollpasienter 3 år senere med samme peptidsekvenser (figur 2 høyre) og fant de nye prøvene hadde 0% klassifiseringsfeil ved hjelp av både LDA og SVM. En k-means ble utført på peptider med k = 3 og fant at peptider som dannet cyan cluster (høy-binding i GBM, lite kontroller) var de samme for både 2007 og 2010 prøver.
heatmap til venstre viser 50 peptider som differensiert glioblastom pasienter fra friske personer hentet fra 4 forskjellige geografiske steder over hele USA (Fred Hutchison Institute, University of Washington, University of California Irvine, Arizona State University). Disse peptidene ble også brukt til å klassifisere ulike prøver som består av blindet pasient og sunn sera hentet fra Barrow Neurological Institute 3 år senere. De fargede striper på høyre angir klynger som definerer grupper av peptider. Selv om det er forskjeller mellom verdiene oppnådd i 2007 og 2010, de fleste av de høye-peptider er veldig like.
Immunosignaturing Kan skille mellom forskjellige hjernesvulst Pathologies og molekylær Subtyper
Til slutt spurte vi om patologi av hjernesvulst produsert en identifiserbar immunosignature. Vi analyserte blod fra pasienter som er oppført i tabell 1.
Metylering av O-6-metylguanin-DNA-metyltransferase-promoteren er blitt vist å være en viktig stratifier for GBM. Pasienter med denne molekylære subtype har bedret overlevelse, særlig når behandlingen omfatter temozolomid [38], [39], [40]. Nåværende tenkning er at den forbedrede overlevelse er ikke utelukkende på grunn av dette genet, men at metylering av dette genet er promoteren kan være en markør for en mer pleiotropisk metylering fenotype.
pasientprøver ble kjørt i duplikat på to- opp micoarrays. En teknisk replikere ble kjørt på toppen rekke en sklie og bunnen av en annen for å sikre at ingen topp /bunn bias. De immunosignaturing arrays gitt et minimum deteksjonsgrensen på 1,25 ganger på 95
th persentil over 2 tekniske replikater i gjennomsnitt. Arrays demonstrerte en Pearsons korrelasjonskoeffisient 0,97 over tekniske replikater fra skred i samme print batch, og 0,91 over utskrifts grupper. Analyse brukt median ikke-bakgrunns trekkes signaler tatt direkte fra GPR fil (GenePix rapport). Bakgrunn subtraksjon er ikke brukt på grunn av jevn og meget lav bakgrunn. Peptide klassifisering strøm beregnes ved hjelp av standard maktanalyse i R [41] ( «power.t.test» kommando). For test-opplæringsformål delt vi prøver 50:50 tilfeldig, 1000 ganger og beregnet den resulterende nøyaktighet. For funksjonsvalg bruker vi enten t-test eller ANOVA med passende multippel testing korreksjon. 100 peptider som p-verdier varierte fra 10
-27 til 10
-18 ble brukt i heatmap sett i figur 3.
Top: seks forskjellige klasser av hjernesvulst pasienter ble testet for deres immunosignature . Vi undersøkte
Glioblastoma multiformae plakater (MGMT- er brun, MGMT + er lilla), astrocytom grad II (rødt), oligodendroglioma (cyan) og blandet oligo /astro (blå) mot ellers friske kontroller (gul). Vi brukte en en-veis ANOVA for å velge 100 mest betydningsfulle peptider, p 10
-18. Høy (rød) og lav (blå) signaler tilsvarer pasientens antistoffer oppdages med en fluorescensmerket anti-human sekundær. Data ble gruppert ved hjelp av hierarkisk clustering på begge peptider (Y-aksen) og pasienter (X-aksen). Nederst til høyre: hovedkomponenter visning av avstanden mellom prøvene. X- og Y-akser representerer de første to hovedbestanddeler som utgjør 64% av den totale variansen over prøvene. Pasient informasjon finnes i tabell 1.
Som tydelig i figur 3a, produsert hvert av de kliniske klassifiseringer av kreft i hjernen en identifiserbar mønster, inkludert MGMT + og MGMT- prøver. En rektor komponenter plott (figur 3b) viser de relative forskjeller mellom enkeltprøver, og lineær diskriminant analyse med leave-one-out kryssvalidering (tabell 1) gir klassifisering ytelse og feiling. Bare astrocytom vs kontroller produsert mis-klassifisering på prøvene som ble testet. Vi utførte test-trening med LDA og la en ut kryssvalidering av jevnt splitte kreft og kontrollprøver i test-treningssett. Vi gjorde dette 1000 ganger og fått 0% feil for alle parvise sammenligninger unntatt astrocytom vs. kontroll hvor vi oppnådde en gjennomsnittlig feilrate på 4,7%. Vi har rapportert en feil på 7% i tabell 1 som svarer til et enkelt tilfeldig valgte test-trening iterasjon. Vi hadde 0% klassifiseringsfeil mellom GBM MGMT + vs kontroller og MGMT- vs kontroller; Vi hadde også en 0% klassifiseringsfeil mellom MGMT + og MGMT- GBM pasienter. Vi konkluderer med at immunosignatures av de kliniske klassifikasjoner er tydelig.
Diskusjoner
Vi først viste at immunosignature av GBM var forskjellig fra brystkreft og dal feber infeksjon. Vi viste også at GBM signaturen var relativt stabil, selv over flere gjentakelser av microarray plattform. Endelig undersøkte vi et stort antall pasienter med de mest vanlige kreft i hjernen patologier og funnet slående immunosignature forskjeller mellom dem. Overraskende, selv GBM pasienter med forskjeller i O
6-metyl-guanin-DNA metyltransferase metylering status (MGMT) viste en målbar og felles immun signatur, nok til å klassifisere MGMT status med 0% kryssvalideringsfeil.
et første bekymring for anvendeligheten av immunosignaturing var at den inflammatoriske respons på en hvilken som helst sykdom vil dempe spesifisitet for en sykdom. Som vist i vårt sammenligning mellom GBM, brystkreft og Valley Fever, sykdomsspesifikke signaturer er åpenbare. En teknisk problem er stabiliteten av microarray plattformen. Som vist i figur 2, GMB-karakteristiske peptider var tydelig selv på arrays trykte 3 år fra hverandre med aldring (og antagelig nedbrytende) oppløste peptid aksjer. Men vi forbedret plattformen i de mellomliggende årene ved å iverksette ikke-kontakt utskrift teknikker (Applied Mikromatriser, Tempe, Arizona), større utskrifts grupper (136 lysbilder per batch), og automatisering av utvalgets behandling (HS 4800 Pro Hybridisering Station, Tecan, Männedorf, Sveits).
Vi viser for første gang at en patologisk tilstand, definere svulsten cellulære opprinnelse eller utvikling kan bli reflektert i immunosignature (Figur 3a, 3b og tabell 1). Til vår overraskelse, en enkelt molekylære markør, MGMT promoter metylering status, har en så dyp effekt på immunsystemet at immunosignature er tydelig. Selvfølgelig kan MGMT arrangøren metylering være ganske pleotropic og kan markere flere endringer i cellen forårsaker flere mål for å bli presentert for immunsystemet. Vi har ikke bort fra at de forskjellene vi ser i immunsignaturene er på grunn av disse flere proteiner som blir aktivert av en enkelt promoter. Gitt at MGMT status er relevant for utfallet og temazolamide respons, kan immunosignatures føre til en nyttig non-invasiv diagnostisk for kreft i hjernen.
I sammendraget, har vi vist at immunosignaturing av kreft i hjernen reflekterer patologiske utmerkelser. Selv om hjernen er immunologisk privilegert kan kreft tilsynelatende bryte den blod-hjerne-barrieren og stimulere en bred humoral respons. Det er viktig å merke seg at peptider som brukes på følgende mikromatriser er helt tilfeldig. De kan brukes for analyse av en hvilken som helst sykdom hos noen arter; de er
ikke anbefale spesifikke for kreft i hjernen, og de ble
ikke anbefale forhåndsvalgt på noen måte. Enten immunosignaturing ville ha diagnostisk eller prognostisk bruksområder for kreft i hjernen ikke er besvart av denne studien, men teknologien er attraktive i sin enkelhet og lave kostnader og har høy følsomhet for endringer i sirkulerende antistoffer. Brain kreft har pålagt enorme hindringer som hindrer deteksjon, overvåking og behandling. Vi føler denne teknologien gir en ny metode for å overvinne mange av disse hindringene.
Materialer og metoder
Prøver
Blod ble samlet fra pasienter som gjennomgår craniotomy for reseksjon av primær, terapi-naive hjernesvulster i henhold IRB # 10BN171 på Barrow Neurological Institute, Phoenix, AZ. Prøvene ble frosset ved -20 ° C fra 1 til 7 år før bruk. Blodet ble sentrifugert 100 000 x g i 30 min for å pelletere celleavfallet og hemolysert plasma ble overført til et nytt rør og frosset ved -20 ° C. Friske frivillige av omtrent samme alder og hann-hunn sammensetning som kreft kohort donert blod som var frosset på lignende måte. Vi fikk også prøver fra pasienter diagnostisert med brystkreft og Valley Fever. Tabell 1 viser antall og type av prøver anvendt i denne analysen. MGMT-promoteren metylering analyse av GBM tumorvev ble utført ved polymerase-kjedereaksjon (PCR) -analyse av bisulfitt-modifisert DNA som beskrevet [42]
Protoarray Plattform:. Tilstedeværelse av autoantistoffer
Vi valgte 5
Glioblastoma multiformae
pasienter og 3 friske alder-matchet kontroller fra vår kohort av serumprøver. Vi fulgte Life Technologies «protokoll for påvisning av autoantistoffer nøyaktig som skrevet. Vi brukte Novagen Biologicals (San Diego, California) biotinylert anti-human sekundært til en veiledende konsentrasjon og Livet Technologies «AlexaFluor 647-streptavidin som å oppdage tertiær. Lysbilder ble skannet i en Agilent «C» scanner, 100% laser makt, 80% PMT ved 10 uM oppløsning. Lysbilder ble på linje med appropriate.gal filen, og konvertert til verdier ved hjelp av Molecular Devices «(Santa Clara, California) GenePix Pro 6.0. Alle kontroller som følger med arrays fungerte som forventet; Dataene ble analysert i Agilent (Palo Alto, California) GeneSpring 7.3.1 bruker FWER = 5%. Ingen proteiner på arrays møtte de falske oppdagelse kriteriene for signifikans mellom sunn vs kreftpasienter.
Immunosignature plattform
immunosignaturing teknologien har blitt beskrevet andre steder [26], [27], [28 ], [29], [30], [35], [36], [37], [43]. I korthet ble et 1:500 fortynning av plasma tilsatt inkuberingsbuffer bestående av 5% BSA, 0,1% Tween 20 i 1 x PBS pH 7,2. Denne blandingen ble inkubert på immunosignaturing mikromatriser (oppnådd fra www.peptidemicroarraycore.com) ved 37 ° C i en time med omrøring på en Tecan 4800 Pro Hybridisering Station (Tecan, Salzburg, Østerrike), tørket under molekylær klasse nitrogen, og ble skannet en Agilent «C» scanner på 70% laser makt, 20% PMT ved 10 uM oppløsning, enkel fargemodus. 16-bits microarray bildene ble konvertert til verdier ved hjelp av GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Santa Clara, CA) for å produsere en GPR-fil. Data ble analysert med GeneSpring 7.3.1 (Agilent, Santa Clara, CA). Pearsons korrelasjonskoeffisient på tvers av disse prøvene i gjennomsnitt 0,92. Prøver med korrelasjonskoeffisienter på tvers av tekniske replikater. 0,85 ble re-run
Informatic Analyse
Forbehandling av microarray data bestod av median normalisering per lysbilde og logge
10 transformasjon. T-tester ble Welsh-korrigert og justert for multiple test skjevhet ved hjelp av en FWER (Family-Wise Error Rate) på 5%; ANOVA likeså. Peptider ble analysert ved å teste hypotesen om at det var forskjeller i intensitet på tvers av kreft i hjernen eller andre sykdomskullene og kontrollpasienter som følge av sykdomsstatus. Peptider som møtte disse kriteriene var «funksjoner» ble brukt for klassifisering. Klassifisering brukt lineær diskriminant analyse (LDA) med leave-one-out kryssvalidering. Support Vector Machines (SVM) med et polynom prikk produkt orden 1 og 0 diagonal skaleringsfaktor ble brukt sammen med de innledende funksjoner for å sikre at klassifiseringen ytelsen var ikke på grunn av klassifikator. SVM produsert klassifiseringsfeil innen 3% av LDA. En mottaker Operator Karakteristisk (ROC) kurve ble opprettet og arealet under ROC-kurven (AUROC) ble beregnet (tabell 1).
Takk
Vi takker Adrienne Scheck og Barrow Neurological Institute of St. Joseph Hospital for serumprøver.
