Abstract
Bakgrunn
For å klargjøre de genetiske mutasjoner assosiert med intraductal papillær mucinkjertler svulster (IPMN) og IPMN-relaterte pankreastumorer, gjennomførte vi kreft-relaterte genet profilering analyser ved hjelp av ren bukspyttkjertelen juice og resected bukspyttkjertelen vev.
Metoder
Pure bukspyttkjertelen juice ble samlet fra 152 pasienter [ni med en normal bukspyttkjertelen, 22 med kronisk pankreatitt (CP), 39 med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC), og 82 med IPMN], og resected vev fra bukspyttkjertelen ble samlet inn fra 48 pasienter (seks IPMNs og 42 PDACs ). Det ekstraherte DNA ble amplifisert ved multiplekset polymerase kjedereaksjon (PCR) som målretter 46 kreft-relaterte gener inneholdende 739 mutasjonspunkter. Mutasjonene ble analysert ved hjelp av en halvleder-baserte DNA sequencer.
Resultater
Blant de 46 kreftrelaterte gener,
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner var hyppigst påvist i både PDAC og IPMN tilfeller. I ren bukspyttkjertelen juice,
Gnas
mutasjoner ble påvist i 7,7% av PDAC tilfeller og 41,5% av IPMN tilfeller (
p
0,001 vs andre). Alle PDAC tilfeller med
Gnas
mutasjoner (n = 3) ble ledsaget av IPMN. Multivariat analyse viste at
Gnas
mutasjoner i IPMN tilfeller var assosiert med utvidede viktigste bukspyttkjertelkanaler (MPD,
p
= 0,016), mens ble ikke observert noen statistisk uavhengige foreninger med kliniske variabler for
KRAS
mutasjoner. I resected bukspyttkjertelen vev,
Gnas
mutasjoner ble påvist i 50% av PDAC tilfeller samtidig med IPMN, 33,3% av PDAC tilfellene stammer fra IPMN, og 66,7% av IPMN tilfellene, mens ingen
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i tilfeller av PDAC uten IPMN.
Konklusjoner
Gnas
mutasjonen ble spesielt funnet i tilfeller med IPMN og det ble spekulert i at enkelte PDACs kan være påvirket av samtidig, men separat plassert IPMN i deres sykdomsfremkallende mekanisme. Videre
Gnas
mutasjon var signifikant assosiert med MPD utvidelse i IPMN tilfeller, noe som tyder på sin rolle i slim hypersekresjon
Citation. Takano S, Fukasawa M, Maekawa S, Kadokura M, Miura M , Shindo H, et al. (2014) Deep Sekvensering av kreft-relaterte gener avslørt
Gnas
Mutasjoner å bli assosiert med Intraductal papillær mucinous Svulster og dens viktigste pankreasgang Dilatasjon. PLoS ONE 9 (6): e98718. doi: 10,1371 /journal.pone.0098718
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 31 januar 2014; Godkjent: 02.05.2014; Publisert: 04.06.2014
Copyright: © 2014 Takano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (25860527, https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/) og med tilskudd fra Stiftelsen for Advancement of International Science (https://www.fais.or.jp/grant/fy25/01_file/2013_01members.pdf). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) er en pancreatic exocrine svulst preget av cystisk utvidelse av de viktigste og /eller gren bukspyttkjertelen kanaler; disse kanalene er foret med en mucin-produserende atypisk epitel som ofte proliferates i en papillær mote [1] – [3]. IPMN er forbundet med et spektrum av sykdommer som strekker seg fra adenom til invasiv pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC). PDAC kan bli avledet fra IPMN eller kan utvikle seg samtidig i andre regioner av en bukspyttkjertel hvori IPMN har utviklet seg. De to IPMN-relaterte former av PDAC anses å være forskjellige sykdoms enheter på grunn av deres forskjellige nærhets til IPMN i bukspyttkjertelen. Imidlertid er prognose for disse IPMN-relaterte former av PDAC ofte bedre enn for vanlig PDAC hvis tidlig diagnose er stilt [4], [5]. I motsetning til dette blir de genetiske egenskapene til disse to IPMN-relaterte former av PDAC og årsakene til deres forskjellige prognoser ikke fullt ut forstått.
PDAC oppstår som et resultat av akkumulering av genetiske og epigenetiske mutasjoner som en selektiv fordel til kreftceller [6], [7]. Mutasjoner i
KRAS
,
CDKN2A
,
TP53
, og
SMAD4
er ofte blitt rapportert i tilfeller av PDAC med konvensjonelle metoder som direkte sekvense [ ,,,0],8]. Nylig har hel-exome analyse ved hjelp av neste generasjons sekvensering avslørte også høyfrekvente endringer i disse få gener [6], [7], [9].
I motsetning til somatiske onkogene mutasjoner i guanin nukleotid bindende protein, alfa stimulerende (
Gnas
) kodende G protein, har nylig blitt identifisert i 41-66% av IPMN tilfeller [10] – [12].
Gnas
mutasjoner har også blitt identifisert i flere svulster i endokrine systemet [13], noen hypofyse adenomer [14], og i McCune-Albright syndrom [15]. Disse mutasjonene oppstår meget tidlig i den naturlige utvikling av IPMN [10] og er meget spesifikke for å IPMN [11], [12], [16]. Med unntak av en liten prosentandel av pankreas intra-epitelial neoplasi (PanINs),
Gnas
mutasjoner er sjelden blitt påvist i de fleste tilfeller av PDAC eller andre pasienter med cystisk neoplasmer [11], [12], [16]. Men det er ukjent hvordan den kliniske presentasjon av IPMN kan påvirkes av
Gnas
mutasjon. Videre er det også ukjent om IPMN-relaterte PDACs er forbundet med
Gnas
mutasjoner
Påvisningen av disse mutasjonene i bukspytt [17] -. [21] eller i prøver oppnådd ved endoskopisk ultralyd finnålsaspirasjon (EUS-FNA) [22] hjelpemidler i diagnostisering av tidlig stadium sykdommen. Men bare noen få vanlige muterte gener kan analyseres i små prøver på grunn av begrensninger i konvensjonell sekvenseringsteknologi. For å lindre disse begrensningene, har halvleder-baserte neste generasjons sekvense nylig blitt utviklet og aktivert rask, dyp og kostnadseffektiv sekvensering av et bredt spekter av DNA fra små klinisk innhentet prøver [23].
I denne studien, basert på halvledere sekvensering ble ansatt for å gjennomføre kreftrelaterte genmutasjon analyse for bukspyttkjertelen svulster ved hjelp av små vevsprøver. Ved hjelp av ren bukspyttkjertelen juice, undersøkte vi mutasjons profilering av bukspyttkjertelen svulster og foreningen av denne profilen med de kliniske variabler. I tillegg bruker resected vev sammenlignet vi forskjellene i mutasjons profilering av de to typene PDACs som var relatert til IPMN (PDAC avledet fra IPMN og PDAC samtidig med IPMN).
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
De rene bukspyttkjertelen juice og tilhørende klinisk informasjon ble innhentet fra 152 tilfeller [CP (kronisk pankreatitt), n = 22; PDAC, n = 39; IPMN, n = 82; normale bukspyttkjertel, n = 9] som ble behandlet ved Yamanashi Hospitalet 2000 til 2012 (tabell 1). Grundige pankreas undersøkelser ble utført i alle tilfeller. Endoskopisk nasopancreatic drenering (ENPD) ble utført i løpet av ercp (ERCP) for å oppnå bukspyttkjertelen juice for cytologisk testing. Det rene bukspytt ble oppnådd, og umiddelbart lagret ved -80 ° C inntil bruk. I tilfeller med gallesykdom og en normal bukspyttkjertelen, ble ENPD utført for å unngå post-ERCP pankreatitt, og de innsamlede bukspytt ble klassifisert som normale bukspyttkjertel tilfeller i analysen. Resected vev ble oppnådd ved samme sykehus 2006-2012 fra saker med IPMN (n = 6) og PDAC (n = 42), som vist i tabell 2. Av de vevsprøver PDAC, ble 21 macrodissected frosne eksemplarer og 21 ble microdissected formalinfikserte parafininnstøpte (FFPE) eksemplarer, mens seks av de IPMN prøvene var frosne prøver. Diagnostisering og klassifisering av IPMN var basert på de internasjonale konsensus retningslinjene for forvaltningen av IPMN og mucinkjertler cystisk svulster i bukspyttkjertelen som ble etablert i 2006 [1]. Denne studien ble godkjent av Human Etisk Review Committee of Yamanashi universitetssykehus. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
DNA-ekstraksjon
DNA fra resected vev ble ekstrahert med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) for de frosne prøver og QIAamp DNA FFPE Kit (Qiagen) for FFPE- prøver. DNA fra den rene bukspyttkjertelen juice ble ekstrahert med DNeasy Blood Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. I gjennomsnitt ble 1,4 mikrogram og 0,3 mikrogram av DNA ekstrahert fra de frosne prøver og FFPE- prøver, henholdsvis, og ca 3-4 ug DNA ble ekstrahert fra 400 mL av ren bukspyttkjertelen juice.
Utarbeidelse av fragment biblioteker
Ion AmpliSeq Cancer Panel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble brukt til å generere mål fragment biblioteker, som beskrevet tidligere [23]. I korte trekk, ble 10 ng DNA amplifisert ved PCR ved hjelp av ferdigblandet Ion AmpliSeq Cancer Primer Pools inneholder 190 primerpar og AmpliSeq HiFi Master Mix (Ion AmpliSeq Library Kit, Life Technologies). De 190 multipleksede amplikonene ble behandlet med fupa Reagens (Life Technologies) for delvis fordøyelse av primer sekvenser og fosforylering. De amplikonene ble så bundet til adaptere fra Ion Xpress Barcode Adaptere 1-16 Kit (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter ligering, de amplikonene gikk nick-oversettelse og ekstra bibliotek forsterkning av PCR for å fullføre sammenhengen mellom adaptere og amplikonene. Den BioAnalyser High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ble brukt til å visualisere størrelse og rekkevidde, og for å bestemme bibliotek konsentrasjoner.
Emulsion PCR og sekvense
multiplekset strekkode biblioteker ble forsterket av emulsjon PCR på Ion Sphere partikler (ISP) ved hjelp av Ion One Touch 200 Mal Kit v2 (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter malen ISPer ble gjenvunnet fra emulsjonen, ble de positive mal ISPer biotinylert under emulsjonen prosess og beriket med Dynabeads MyOne streptavidin C1 perler (Life Technologies). Sekvensering ble utført på et personlig Genome Machine Sequencer (Life Technologies) ved hjelp av Ion PGM 200 Sequencing Kit (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Siden DNA-muterte tumorceller kan foreligge som små populasjoner i prøvene på grunn av de små proporsjoner mellom de hele tumorvev og /eller forurensning med ikke-tumorceller, ble dypt sekvensanalyse utført i denne studie for å påvise mutasjoner i en mengde så lite som 1%. Torrent Suite v2.2 programvare (Life Technologies) ble brukt til å analysere strek leser, for å justere leser til referanse genomet, og å kjøre beregninger, inkludert chip-lasting effektivitet og totale lese teller og kvalitet. Varianter ble identifisert med Variant Caller v2.0 programvare (Life Technologies). Kvalitetsverdien av målrettede base ble satt til 21, som er lik 0,79% av sannsynligheten for feil i mutasjonsdeteksjon. Terskelen for mutasjonsdeteksjon Forholdet var satt til ≥1%. Den Ion AmpliSeq Cancer Panel (Life Technologies), som ble brukt i bibliotek forsterkning, mål 739 mutasjons områder av 46 kreftrelaterte gener som ble rapportert i Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC; hotspot mutasjoner) [24]; Disse detekterte hotspot mutasjoner ble analysert i kombinasjon med de kliniske variabler. De 46 kreft-relaterte gener som er oppført på den horisontale aksen i diagrammet i figur 1 og figur 2.
Y-aksen på figuren representerer prosentandelen av tilfellene med mutasjoner i hvert gen. A. Ingen mutasjon ble detektert i ren bukspytt fra tilfeller med normal pankreas vev. B.
Gnas
mutasjonen ble oppdaget i ett tilfelle (4,5%) med CP (kronisk pankreatitt) og en liten cystisk lesjon. C.
Gnas Hotell og
KRAS
mutasjoner ble påvist i 7,7% (tre av 39 tilfeller) og 20,5% (åtte av 39 tilfeller), henholdsvis, som hadde bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC).
Gnas
mutasjon ble påvist i alle tilfeller med intraductal papillær mucinous svulst (IPMN, n = 3). D.
Gnas Hotell og
KRAS
mutasjoner ble påvist i 41,5% (34 av 82 tilfeller) og 39,0% (32 av 82 tilfeller), henholdsvis med IPMN.
y-aksen i figur representerer prosentandelen av tilfellene med mutasjoner i hvert gen. A. I resected vev,
KRAS
mutasjon ble påvist i 84,6% (22 av 26 tilfeller) av tilfellene bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) som ikke har intraductal papillær mucinous svulst (IPMN). B.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i 80% (åtte av 10 tilfeller) og 50% (fem av 10 tilfeller), henholdsvis av PDAC tilfeller samtidig med IPMN. C.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble påvist i 66,7% (fire av seks tilfeller) og 33,3% (to av seks tilfeller), henholdsvis av PDAC tilfeller avledet fra IPMN. D.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i 100% (n = 6) og 66,7% (fire av seks tilfeller), henholdsvis av invasiv IPMN tilfeller.
Statistisk analyse
de assosiasjoner mellom genmutasjoner og kliniske variabler ble undersøkt ved hjelp av Fishers eksakte test eller χ
2 test og variabler med en
p
verdi 0,2 var som inngår i den multivariate analysen. Kontinuerlige data som cyste størrelse og tilstedeværelse av freske knuter ble kategorisert i henhold til mottaker drift karakteristikk (ROC) analyse (data ikke vist). For den multivariate analysen, ble en multippel logistisk regresjonsmodell som brukes, og en
p
-verdi. 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
Deep sekvensanalyse av 46 kreftrelaterte gener i rene bukspyttkjertelen juice
de kreftrelaterte mutasjoner i de 46 genene ble analysert i den rene bukspyttkjertelen juice av de 152 tilfellene, med et gjennomsnitt på 2114 leser per fragment. De utpakkede varianter med listen over endrede gener, variant frekvens, lese dybde, og tilsvarende COSMIC IDer fra de dype-sekvense data i hvert enkelt tilfelle er vedlagt som tilleggsinformasjon til dette papiret som Microsoft Excel-formaterte filer (File S1-S4) . Ingen mutasjoner ble detektert i bukspytt av de ni tilfeller med normal pankreas vev (Fig. 1A). Et
Gnas
mutasjon ble detektert i ett tilfelle med CP som ble ledsaget av en liten cyste (5 mm); Dette kan ha vært representativ for en tidlig IPMN lesjon (fig. 1B og fig. 3A).
KRAS
,
Gnas
, og
TP53
mutasjoner ble oppdaget i begge PDAC og IPMN tilfeller (Fig. 1).
KRAS
mutasjoner ble påvist i 20,5% av PDAC tilfeller (
p
= 0,0074 vs normal og CP) og 39,0% av IPMN tilfeller (
p
0,001 vs . normal og CP).
Gnas
mutasjoner ble påvist i 7,7% av PDAC tilfeller og 41,5% av IPMN tilfeller (
p
0,001 vs andre). IPMN var til stede i alle PDAC saker som inneholdt
Gnas
mutasjon (n = 3).
A. Et tilfelle av CP med en liten cyste (blå pil) som hadde den
Gnas
mutasjon (Fig. 1B) i ren bukspyttkjertelen juice på magnetisk resonans cholangiopancreatography (MRCP) bildebehandling. B-D. PDAC med
Gnas
mutasjoner forskjellige fra samtidig IPMN. I tilfeller 30 (B) og 31 (C), MRCP bildebehandling avslørte stenose i MPD i bukspyttkjertelen hodet nær PDAC (gul pilspiss). Den IPMN lå i bukspyttkjertelen kroppen (blå pil). Computertomografi bildebehandling i tilfelle 28 (D) avslørte at PDAC lå i bukspyttkjertelen kroppen (gul pilspiss), mens IPMN lå i bukspyttkjertelen hodet (blå pil). En liste over saker B-D er vist i Tabell 4.
Siden vår analyse viste at
Gnas
mutasjon var spesifikke for IPMN, assosiasjoner mellom de utvalgte kliniske variabler og
Gnas
status i de 82 IPMN sakene ble statistisk analysert for å klargjøre den kliniske relevansen og viktigheten av
Gnas
mutasjon i bukspyttkjertelen juice. Den univariate analysen avdekket en sammenheng mellom
Gnas
mutasjon og IPMN type (hovedkanalen type) og mengden av dilatasjon (≥6 mm) i MPD (tabell 3). I multivariat analyse ble bare MPD utvidelse uavhengig assosiert med
Gnas
mutasjon (tabell 3). På den annen side,
KRAS
mutasjon var forbundet med plasseringen (bukspyttkjertelen kropp og hale,
p
= 0,044) og mengden av dilatasjon (≥6 mm) i MPD (
p
= 0,01) av den univariate analysen; Men det var ingen uavhengig klinisk sammenheng med denne mutasjonen etter multivariat analyse (data ikke vist).
Deep sekvensanalyse av 46 kreftrelaterte gener i resected bukspyttkjertelen tumorvev
etter at vi fant
Gnas
mutasjon i saker som hadde PDAC samtidig med IPMN samt i saker som hadde bare IPMN fra analysen av bukspyttkjertelen juice, vi neste sekvensert vevsprøver for å bestemme mulige mutasjonsmønstre i IPMN , PDAC avledet fra IPMN, PDAC som var med samtidig IPMN, og PDAC alene. Sekvenseringen ble utført i 48 resekterte pankreatiske tumorer (PDAC uten IPMN, n = 26; PDAC samtidig med IPMN, n = 10; PDAC avledet fra IPMN, n = 6; noninvasive IPMN, n = 6, Fig. 2). Gjennomsnittlig antall leser per amplicon var 2582. De utpakkede varianter med listen over endrede gener, variant frekvens, lese dybde, og tilsvarende COSMIC ID fra dyp-sekvensering av data i den enkelte sak har blitt vedlagt denne papir som saksdokumenter i Microsoft Excel-formaterte filer (File S5-S8) .
KRAS
mutasjoner ble påvist i 84,6% av PDAC tilfeller uten IPMN, 80% av PDAC tilfellene som var samtidig med IPMN, 66,7% av PDAC saker som ble avledet fra IPMN, og 100% av IPMN tilfeller.
Gnas
mutasjoner ble påvist i 50% av PDAC saker som var samtidig med IPMN (
p
= 0,0007 vs. PDAC uten IPMN), 33,3% av PDAC saker som ble avledet fra IPMN (
p
= 0,03 vs. PDAC uten IPMN), og 66,7% av IPMN tilfeller (
= 0,0004 vs. PDAC uten IPMN), mens ingen
Gnas
mutasjoner ble oppdaget> i tilfeller av PDAC uten IPMN.
Gnas
mutasjoner ble dermed bare påvist i IPMN og IPMN-assosiert PDAC (PDAC samtidig med IPMN og PDAC avledet fra IPMN). En detaljert liste over genmutasjoner er gitt i Tabell 4. Dermed ble tilsvarende egenskaper i genmutasjoner observert for disse tre sykdomskategorier (tabell 4).
Radiologisk bilder av PDAC samtidig med IPMN
De radiologiske bilder for saker 28, 30 og 31 i tabell 4 er vist i figur 3 som representative bilder som viste PDAC samtidig med IPMN. I disse tilfellene,
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i PDAC og samtidig IPMN ble plassert i en egen bukspyttkjertelen region. For eksempel, pankreasgang strukturer som følge av PDAC var tydelig i bukspyttkjertelen hodet i tilfelle 30 (Fig. 3B) og tilfelle 31 (fig. 3C), mens den IPMN var synlig i bukspyttkjertelen kroppen. Ved 28 (Fig. 3D), en lav tetthet masse lesjon av PDAC og flere cystisk lesjoner av IPMN var tilsynelatende skilt i bukspyttkjertelen.
Association of mutasjonsmønstre mellom bukspyttkjertelen juice og resected bukspyttkjertelen tumorvev
Noen gener som
ATM
,
BRAF
,
IDH1
, og
RB1
ble oppdaget bare i bukspyttkjertelen juice (Fig . 1), men ikke i den resekterte vev (fig. 2). I kontrast, andelen av tilfeller med mutasjoner av
KRAS
eller
Gnas
var høyere i resected vev enn i bukspyttkjertelen juice (Fig. 1, 2). For å undersøke om mutasjons profiler av bukspytt ordentlig representerte de av pankreatiske tumorer, ble mutasjonsprofil mellom den bukspytt og resekterte pancreatic tumorvev sammenlignet i 21 tilfeller hvor begge prøvene var tilgjengelige. Blant de
KRAS product: (n = 17) og
Gnas product: (n = 7) mutasjoner funnet i de 21 resected bukspyttkjertelen tumorvev,
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble detektert i bukspytt i 41,2% (7/17) og 71,4% (5/7) av tilfellene, henholdsvis (tabell 5), som indikerer at følsomheten av bukspytt for påvisning av mutasjoner av pankreastumorer kan nå ca. 50%. Hvis vi ser på detaljene blant
KRAS product: (n = 11) og
Gnas product: (n = 4) mutasjoner funnet i resected bukspyttkjertelen vev av the15 PDAC tilfeller,
KRAS
og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i bukspyttkjertelen juice på 27,3% (3/11) og 50% (2/4) av tilfellene, henholdsvis. Blant de
KRAS product: (n = 6) og
Gnas product: (n = 3) mutasjoner funnet i resected bukspyttkjertelen vev av de seks IPMN tilfeller,
KRAS Kjøpe og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i bukspyttkjertelen juice i 66,7% (4/6) og 100% (3/3) av tilfellene, henholdsvis. Andelen av tilfeller med mutasjoner var høyere i IPMN enn i PDAC; Derfor tenkte vi at mutasjoner påvist i bukspyttkjertelen juice kan være alternativ måte å måle mutasjoner i de fra vev i hvert fall i de tilfeller med IPMN, i henhold til denne analysen. Som et resultat, analyserte vi sammenhengen mellom de kliniske variabler og
Gnas
status med bukspyttkjertelen juice i tilfellene med IPMN.
Diskusjoner
I denne studien , basert på halvledere, DNA-sekvensering ble utført i klinisk innhentet prøver av ren bukspyttkjertelen juice og resected bukspyttkjertelen vev, med fokus på IPMN og IPMN-assosierte svulster. Analysen av bukspyttkjertelen juice avslørte at
Gnas
mutasjon var spesifikke for IPMN og at
Gnas
mutasjon ble spesielt knyttet til IPMN med MPD utvidelse. Analysen av resected vev med hensyn til
Gnas
mutasjonsstatus viste at IPMN-forbundet PDAC (begge PDAC samtidig med IPMN og PDAC avledet fra IPMN) delte lignende mutasjons egenskaper, og at disse egenskapene skilte seg fra de ordinære PDAC.
blant de 46 kreftrelaterte gener sekvensert i vår studie,
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget med høy frekvens, mens andre inkludert
TP53
,
SMAD4
, og
CDKN2A
mutasjoner ble påvist i bare noen få tilfeller som nevnt før. Siden det har vært flere tidligere rapporter som har analysert
KRAS
mutasjoner i PDAC eller IPMN, vi fokusert vår analyse på
Gnas
mutasjon. Nylige fremskritt innen neste generasjons sekvensering har avdekket detaljerte genetiske endringer i tilfeller med PDAC [6], [7], [9] og IPMN [12], [16]. Jones et al [7], Biankin et al [9], og Wang et al [6] gjennomført hel-exome sekvensering analyse av bukspyttkjertelen PDAC og avslørte at
KRAS
,
TP53
,
SMAD4, etter og
CDKN2A
var de mest forandret gener, som rapportert tidligere [8]. Av disse fire gener, mutasjoner for
TP53
,
SMAD4
, og
CDKN2A
gener ble påvist i bare noen få tilfeller med PDAC i vår studie. Selv homozygot delesjon har blitt rapportert i
SMAD4 Hotell og
CDKN2A
gener i tidligere studier [8], presis identifisering av homozygot delesjon i kliniske prøver har vært vanskelig på grunn av DNA-kontaminering fra normale celler . Imidlertid vellykket påvisning av DNA homozygot delesjon var mulig for disse genene i analyse av rene bukspyttkjertel cancer-cellelinjer (data ikke vist). Fordi det kun er 73
TP53
hot spot mutasjoner fra blant mer enn 1000 mutasjon områder oppført i COSMIC databasen ble målrettet av Ion AmpliSeq Cancer Primer Pools [24], og dessuten lav tumor-cellularity prøver ble brukt,
TP53
endringer kan ha vært undervurdert i vår studie. Disse gene forandringer kunne ha blitt detektert ved andre metoder, slik som immunhistokjemi eller kopi-antall variasjonsanalyse. Det virket merkelig at noen mutasjoner som
ATM, BRAF, IDH1
, og
RB1
ble bare påvist i bukspyttkjertelen juice og ikke i resected prøver. Imidlertid, siden hvert vev benyttes for analysen var bare en del av hele tumor, var det mulig at det bukspytt kan være mer representativ for mutasjoner fra hele tumoren i visse forhold.
Wu et al [16 ] og Furukawa et al [12] utførte hel-exome sekvensering av IPMN fra resected vev og funnet ut at
KRAS
,
Gnas
, og
RNF43
var ofte muterte gener. I denne studien
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble også påvist i bukspyttkjertelen juice og resected vev fra tilfeller med IPMN.
Gnas
mutasjoner er blitt rapportert i flere svulster i endokrine systemet [13], [24], noen hypofyse adenomer [14], og i McCune-Albright syndrom [15].
Gnas
mutasjoner har også tidligere blitt rapportert i IPMN [11], [12] saker som hadde bukspyttkjertelen cyster [10], [12], [16] med en deteksjonsrate på 41-66% fra resected vev pankreatiske cyst væske eller sekretin-stimulert bukspytt oppsamlet fra tolvfingertarmen. Mer nylig er det blitt rapportert at intraductal papillære svulster i gallegangen [25], [26], pyloric kjertel adenom av magesekken og tolvfingertarmen [27], og lav grad av appendiceal mucinkjertler neoplasmer [28] lignet IPMN histologisk og at disse svulster hadde en høy frekvens av
Gnas
mutasjoner.
Gnas
koder α-subenheten av en stimulerende G-protein (Gas) og en mutasjon i
Gnas
fører til konstitutiv aktivering av adenylylcyklase og en forhøyet cAMP nivå [29], [30 ]. Selv om rollene /funksjonene til
Gnas
mutasjoner i IPMN eller PDAC er ikke klarlagt, disse mutasjonene kan være forbundet mer med startfasen enn med tumorprogresjon fordi mutasjonen har også blitt observert i lavgradige svulster [ ,,,0],10], [12]. I vår studie,
Gnas
mutasjoner ble påvist i 41,5% av den rene bukspyttkjertelen juice og i 66,7% av resected vevsprøver fra tilfeller med IPMN; disse mutasjon priser var nesten lik de i tidligere rapporter. I kontrast,
KRAS
mutasjoner er blitt rapportert i resected vev fra både IPMN og PDAC, med respektive deteksjon frekvensområdene for 48-81% [12], [16] og 78-100% [7], [ ,,,0],9], [12], noe som indikerer at
KRAS
mutasjoner kan være forbundet med begge sykdommer; har imidlertid mutasjonsraten vært noe høyere i PDAC.
KRAS
mutasjon deteksjon priser i vår studie var tilsvarende de studier av resected vev i både IPMN og PDAC tilfeller.
Gnas
mutasjoner ble assosiert med MPD utvidelse i IPMN tilfeller gjennom multivariat analyse. Kanda et al rapporterte en uavhengig sammenslutning av
Gnas
mutasjoner med utviklingen av flere cyster i tilfeller med bukspyttkjertelen cyster og Marco et al rapporterte at IPMN med en tarm fenotype har alltid vært forbundet med
Gnas
mutasjoner [10], [31]. Våre data bekrefter spesifisiteten av
Gnas
mutasjoner til IPMN og foreslo en funksjonell rolle
Gnas
mutasjoner i dannelsen av IPMN. Spesielt siden MPD utvidelse uten hindring i IPMN er generelt ansett for å være et resultat av slim hypersekresjon,
Gnas
mutasjoner kan ha en rolle i oppregulering av slim hypersekresjon. Egentlig har det nylig blitt rapportert at innføringen av
Gnas
mutasjon i dyrkede celler resulterer i oppregulering av slimstoffgener, som støtter vår hypotese [32]. En fersk studie rapporterer den høye frekvensen av
Gnas
mutasjon, spesielt i tarm typen IPMN som har påfallende slimproduksjon, støttet våre resultater så vel [31]. Videre studier av en mulig årsakssammenheng mellom
Gnas
mutasjoner og MPD utvidelse er garantert.
Det ble observert samme mutasjon mønstre av kreftrelaterte gener mellom PDAC som var samtidig med IPMN og PDAC avledet fra IPMN i denne studien. I tidligere studier,
Gnas
mutasjoner har ikke blitt påvist i ordinær PDAC med noen få unntak [12], [33]. Konvensjonelt, har disse svulstene blitt klassifisert i tre grupper: vanlig PDAC, PDAC samtidig med IPMN og PDAC avledet fra IPMN [4], [5]. En skjematisk klassifisering av PDAC når det gjelder forholdet til IPMN er gitt i figur 4. I vanlig PDAC, er ingen IPMN identifisert i bukspyttkjertelen (fig. 4A). PDAC avledet fra IPMN er en invasiv kreft i hvilken en histologisk overgang fra IPMN til PDAC kan observeres (fig. 4C) [4]. På den annen side, PDAC samtidig med IPMN er en duktalt adenokarsinom som er ansett for å være en annen sykdom enhet fra den PDAC avledet fra IPMN (figur 4D.); de PDAC lesjoner er separat og adskilt fra de ledsagende IPMN lesjoner i bukspyttkjertelen på radiologisk avbildning og histologisk undersøkelse. En årlig forekomst av en uavhengig PDAC utvikling av 0,8 til 4,1% har blitt rapportert i tilfeller med IPMN under oppfølging [5], [34] – [36]. Selv PDAC samtidig med IPMN kan utvikle uavhengig av IPMN, ligner den biologiske atferd som av PDAC avledet fra IPMN fordi utfallet er mer gunstig sammenlignet med resultatene av ordinær PDAC. Selv om en annen rapport studere
Gnas
status i PDAC samtidig med IPMN viste ingen mutasjon i seks PDAC samtidig med IPMN tilfeller kan deres følsomhet har vært lavere enn forventet, fordi de bare oppdaget
Gnas
mutasjoner i 1 av 6 IPMN tilfeller [37]. Fra mutasjonsmønster
Gnas
observert i denne studien, vi spekulert i at PDAC samtidig med IPMN og PDAC avledet fra IPMN kan dele noen lignende molekylære mekanismer med patogenesen av PDAC.
A.
KRAS
mutasjonen ble oppdaget i vanlig PDAC uten IPMN. B.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i IPMN. C.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget i PDAC avledet fra primær IPMN. D.
KRAS Hotell og
Gnas
mutasjoner ble oppdaget, ikke bare i IPMN men også i PDAC som utviklet seg fra IPMN.
Vår forskning har vist at kreftrelatert genet profilering av halvlederbaserte sekvensering er mulig ved hjelp av små kliniske prøver. På den annen side, deteksjonsfølsomheten var noe lavere i vår analyse delvis på grunn av utilstrekkelig sekvense dybde for hvert gen for et stort antall gener rettet i en enkelt analyse.
