Abstract
overlevelse for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er svært dårlig på grunn av sin asymptomatisk progresjon til avansert og metastatisk scenen som dagens behandling fortsatt i stor grad ineffektiv. Derfor er nye terapeutiske midler og behandlingsmetoder ønskelig å forbedre det kliniske resultatet. I denne studien fant vi ut effekten av honokiol, en biologisk aktiv bestanddel av orientalsk medisinsk urt
Magnolia officin /grandiflora
, på to bukspyttkjertelkreft cellelinjer, MiaPaCa og Panc1, alene og i kombinasjon med standard kjemoterapeutiske narkotika , gemcitabin. Honokiol utøves veksthemmende effekt på både bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved å forårsake cellesyklus arrest på G
1 fase og induksjon av apoptose. På molekylært nivå, honokiol markert redusert ekspresjon av cykliner (D1 og E) og cyklin-avhengige kinaser (Cdk2 og Cdk4), og førte til en økning i Cdk inhibitorer, p21 og p27. Videre honokiol behandling førte til styrking av Bax /BCL-2 og Bax /BCL-XL forhold til å favorisere apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse endringene ble ledsaget av økt cytoplasmisk akkumulering av NF-kB med en samtidig reduksjon i kjernefraksjonen og redusert transkripsjonen aktivitet av NF-kB responsiv promoter. Dette ble assosiert med redusert fosforylering av inhibitor av kappa B alfa (IkB-α) forårsaker dens stabilisering og dermed økt cellulære nivåer. Viktigere, honokiol også forsterkes de cytotoksiske effektene av gemcitabin, delvis, ved å begrense den gemcitabin-indusert kjernefysiske akkumulering av NF-kB i de behandlede bukspyttkjertelcancercellelinjer. Til sammen disse funnene viser, for første gang, den veksthemmende effekten av honokiol i kreft i bukspyttkjertelen og viser sitt potensial nytten som en roman naturlig middel i forebygging og behandling
Citation. Arora S, Bhardwaj A, Srivastava SK, Singh S, McClellan S, Wang B, et al. (2011) Honokiol Arrestasjoner Cell Cycle, induserer apoptose, og potenserer cytotoksiske effekten av gemcitabin i Human kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE seks (6): e21573. doi: 10,1371 /journal.pone.0021573
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: May 11, 2011; Godkjent: 02.06.2011; Publisert: 24 juni 2011
Copyright: © 2011 Arora et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend støtte fra National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (CA137513) og USAMCI. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformen hos USA med dødeligheten øker hver kommende år [1], [2]. Ifølge anslag fra American Cancer Society, ble 43140 amerikanere diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen i 2010 og 36 800 døde, merking dette malignitet som den fjerde største dødsårsaken av kreft [2]. På grunn av sin asymptomatisk progresjon, er kreft i bukspyttkjertelen diagnostisert på et stadium når det allerede har spredning eller lokalt avansert [3]. Terapeutiske tilnærminger mot avansert sykdom har i stor grad mislyktes og omtrent 80% av pasienter diagnostisert med denne malignitet fortsatt dø innen 2-8 måneder [4]. Gemcitabin, godkjente en standard FDA medikament for kreft i bukspyttkjertelen terapi, er rapportert å være minimalt effektive som forbedrer pasientens overlevelse etter noen uker bare [3], [5]. Derfor er det av største betydning for å utvikle alternative behandlingsregimer og strategier for effektiv styring av kreft i bukspyttkjertelen.
Flere nye strategier, som er rettet mot vekstfremmende trasé alene og i kombinasjon med gemcitabin, er testet i bukspyttkjertelkreft til bedre terapeutisk utfall [6]. I tillegg har flere senere studier identifisert deregulerte signaleringselementer, så som Ras, Akt, NF-kB, mirnas, etc., som ikke bare fremmer progresjon av kreft, men også gi chemoresistance i bukspyttkjertelkreft [7] – [9]. Induksjon av disse overlevelses pathways resultatene fra aktivere genmutasjoner, tap av inhiberende veier og /eller potensiering gjennom autokrine og parakrine signaliseringsmekanismer [3], [10]. Faktisk er det nå blitt vist at målsøking av noen av disse signal noder kan være nyttig for å inhibere tumorvekst og progresjon, samt i å gjenopprette følsomheten av tumorceller til de cytotoksiske medikamenter [3], [9], [10] .
naturlige produkter har vært kjernen av kreft kjemoterapi for flere tiår og faktisk over 60% av dagens legemidler mot kreft har sin opprinnelse fra naturlige kilder [11]. I flere nyere studier, har nye plante-avledede forbindelser som er identifisert til å virke som anti-tumormidler gjennom modulering av biologiske reaksjonsveier [12]. Honokiol, en biologisk aktiv biphenolic forbindelse isolert fra
Magnolia officin /grandiflora, har
fått betydelig oppmerksomhet på grunn av sin potente anti-neoplastiske og anti-angiogene egenskaper [13], [14]. Det har gitt lovende data mot hud, tykktarm, lunge og brystkreft [13], [15] – [17]. Den slående trekk ved honokiol som en anti-neoplastisk legemiddel er dens evne til å hemme nukleær faktor kappa B (NF-kB), som er forbundet med kreft celleoverlevelse og chemoresistance [9], [10], [18]. NF-kB er konstitutivt aktivert i en rekke hematologisk og faste maligniteter, inkludert kreft i bukspyttkjertelen og styrer ekspresjonen av en rekke gener som er involvert i celle-proliferasjon og overlevelse gjennom direkte og indirekte mekanismer [18] – [20]. I denne studien har vi undersøkt, for første gang, virkningene av honokiol mot bukspyttkjertelkreft. Våre data viser at honokiol hemmer veksten av human bukspyttkjertelcancercellelinjer, MiaPaCa og Panc1, ved å forårsake cellesyklus-stans og induksjon av apoptose. Videre gir vår studie bevis for en rolle honokiol i kjemosensibiliserende de kreft i bukspyttkjertelen celler til cytotoksiske effekten av gemcitabin.
Resultater
Vekst hemmende effekt av honokiol på menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
To menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer nemlig. MiaPaCa og Panc1 ble benyttet som modellsystem for å undersøke effekten av honokiol på bukspyttkjertelkreft cellevekst. Celler behandlet med honokiol (10-60 um) viste forandringer i morfologi sammenlignet med bærer (DMSO) -behandlede celler. Med økende konsentrasjon av honokiol, cellene ble rund, krympet og løsnet fra underlaget (figur 1A), i samsvar med morfologiske forandringer assosiert med apoptose. Deretter kvantifisert vi den cytotoksiske effekten av honokiol ved å måle prosent levedyktighet ved hjelp WST-1-analysen. Våre data viser at honokiol indusert en dose- og tidsavhengig reduksjon i veksten av både kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer med IC
50 verdier av ~43.25, 31,08 og 18,54 mikrometer (mot MiaPaCa), og ~47.44, 34.17 og 21.86 uM (mot Panc1) etter 24, 48 og 72 h behandlinger, respektivt (figur 1B). Sammen utgjør disse funnene tyder på at honokiol har veksthemmende effekt på kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) MiaPaCa og Panc1 celler ble sådd i 6-brønners plate (1 × 10
5 celler /brønn) og lov til å oppnå 70-80% konfluens før honokiol (10-60 pM) behandling i 48 timer. Etter behandling, ble betydelige endringer i cellemorfologi observert av begge celletypene som undersøkt under fasekontrastmikroskop. Celler ble rund, krympet og løsrevet fra celleoverflaten på en doseavhengig måte. Representative mikrofotografier er fra en av de tilfeldige synsfelt (forstørrelse 200X) av celler behandlet med 20, 40 eller 60 uM honokiol. (B) MiaPaCa og Panc1 celler ble dyrket i 96 brønners mikrotiterplater (1 x 10
4 celler /brønn) og behandlet med honokiol (10-60 pM) ved 70-80% konfluens. Prosent levedyktighet av celler ble målt ved hjelp av WST-1-assay etter 24, 48 og 72 timer. En OD-verdien av kontrollceller (behandlet med et like stort volum av DMSO, sluttkonsentrasjon, under 0,1%) ble tatt som 100% levedyktighet. Honokiol hemmet cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte for begge celletypene som tyder på antitumoreffekten til honokiol. Data er uttrykt som middelverdi ± SD; (N = 3).
Honokiol fører G
1 fase cellesyklus arrest og induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler
bekjempelse av kreft cellevekst kan være forårsaket enten av arrest av cellesyklusprogresjon eller på grunn av induksjon av apoptose eller begge deler [12]. Våre data på cellesyklusfordelingen viste at behandling med honokiol resulterte i anriking av kreft i bukspyttkjertelen celler i G
1 fase med en samtidig reduksjon i antallet celler i S-fase (proliferative fraksjon) (figur 2). Vi observerte en ~1.28, 2,16 og 2,46 folder (i MiaPaCa) og ~1.08, 1,53 og 1,93 folder (i Panc1) reduksjon i antallet celler i S-fase på 20, 40 og 60 pM doser av honokiol, henholdsvis (figur 2 ). I apoptose analyser, våre data viste en betydelig økning i apoptotiske indeks (PE Annexin V positive /negative 7AAD celler) i en doseavhengig måte etter 24 timer med honokiol behandling (figur 3). Ved 20, 40 og 60 pM konsentrasjoner av honokiol, observerte vi ~1.25, 2,04 og 3,96 folds økning i apoptotiske indeksene til MiaPaCa og ~1.34, 1,98 og 3,32 folds økning i apoptotiske indekser av Panc1 celler, respektivt. Til sammen våre funn viser at honokiol har både cellegift og cytotoksiske egenskaper mot kreft i bukspyttkjertelen celler.
MiaPaCa og Panc1cells (1 × 10
6 celler /brønn) ble synkronisert ved dyrking i serumfritt medium i 72 timer , etterfulgt av inkubasjon i seruminneholdende medium i 24 timer og etterfølgende behandling med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontroll) i 24 timer. Fordeling av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble analysert ved hjelp av propidiumjodid (PI) farging, etterfulgt av strømningscytometri. Forbedret akkumulering av MiaPaCa og Panc1 celler i G
1 fasen av cellesyklusen ble observert etter behandling med honokiol på en doseavhengig måte (som indikert ved strømnings histogrammer) med en samtidig reduksjon i S-faseceller.
MiaPaCa og Panc1 celler ble dyrket i 6-brønners plater (1 x 10
6 celler /brønn) og fikk oppnå 70-80% konfluens. Celler ble behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontroll) i 24 timer og deretter farget med 7-AAD og PE Annexin V, etterfulgt av strømningscytometri. Nedre venstre kvadrant av hver panelene viser levedyktige celler (negative for begge, PE Annexin V og 7-AAD). De øvre høyre kvadrant inneholde nekrotiske eller sent apoptotiske celler (positive for begge, PE Annexin V og 7-AAD). De nedre høyre kvadrant representerer de tidlige apoptotiske celler (PE Annexin V positive og 7-AAD negative). Data viser en doseavhengig økning i antallet av apoptotiske celler i både MiaPaCa og Panc1 celler etter behandling med honokiol sammenlignet med kontrollceller, noe som indikerer apoptotis induserende potensial på honokiol.
Honokiol endrer ekspresjonen av cellesyklus og overlevelses-assosierte proteiner
for å undersøke den mekanistiske grunnlag av veksthemmende virkninger av honokiol, vi neste undersøkt dens effekt på ekspresjonen av viktige proteiner involvert i cellevekst og overlevelse. Våre data indikerer en reduksjon doseavhengig i uttrykket av cykliner (D1 og E) og cyklin-avhengige kinaser (Cdk2 og Cdk4); mens en indusert ekspresjon av cyclin-avhengige kinaser (P21 og P27) ble observert etter honokiol behandling i både MiaPaCa og Panc1 kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 4). Blant de overlevelse proteiner, observerte vi en doseavhengig reduksjon i nivåer av anti-apoptotiske protein Bcl-2 og Bcl-xL, mens en samtidig økning i nivået av pro-apoptotiske protein Bax ble observert (figur 5A) som fører til en økning i forholdet mellom Bax /Bcl-2 (figur 5B, øvre panel) og Bax /Bcl-xL (figur 5B, nedre panel). Disse funnene viser at honokiol endrer ekspresjonen av proteiner involvert i regulering av cellesyklus og apoptose til å meddele dens veksthemmende virkning.
kreft i bukspyttkjertelen celler (MiaPaCa og Panc1) ble behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontroll) i 24 timer. Totalt protein ble isolert og underkastet immunoblotanalyse for forskjellige cellesyklus-assosierte proteiner (cyklin D1, cyklin E, Cdk2, Cdk4, p21 og p27). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Intensitetene for immunoreaktive bånd ble kvantifisert ved densitometri. Normaliserte densitometriske verdier er angitt på toppen av båndene som utviser en reduksjon doseavhengig i uttrykket av cyclin D1, cyklin E, Cdk2 og Cdk4 og økning i ekspresjon av cyklin-inhibitorer; p21 og p27, etter eksponering for honokiol, i begge celletyper.
(A) MiaPaCa og Panc1 cellene ble behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontroll) etter 24 timer. Immunoblotting ble utført for BCL-XL, Bcl-2 og Bax proteiner etterfulgt av densitometri av immunoreaktive band. Normaliserte densitometriske verdier er angitt på toppen av bandene. (B) Søylediagram som oppsummerer effekten av honokiol behandling på Bax /BCL-2 ratio (øvre panel) og Bax /BCL-XL-forhold (nedre panel). Data tyder på at honokiol induserer apoptose ved oppregulering pro-apoptotiske Bax og downregulating anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-XL proteiner.
Honokiol demper konstitutiv aktivering av NF-kB i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
NF-kB er konstitutivt aktiv i mange krefttyper, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [18] – [20], og det har vist seg at aktiveringen av denne signalnoden letter cellesyklusprogresjon [21] og apoptotisk motstand [22 ]. Derfor undersøkte vi om behandlingen av kreft i bukspyttkjertelen celler med honokiol har en innvirkning på NF-kB aktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi først undersøkt effekten av honokiol på den transkripsjonelle aktivitet av NF-κB- responsive promoter i et luciferase reporter-analyse. Våre data indikerte en doseavhengig reduksjon i transkripsjonen aktivitet av NF-kB (~1.40, 2,08 og 4,0 folder i MiaPaCa, og ~1.29, 1,96 og 5,26 folder i Panc1 celler) ved 20, 40 og 60 uM av honokiol behandling hhv (Figur 6A). For å støtte denne observasjonen videre, vi neste studerte cellulær lokalisering (cytoplasma vs. atom) p65 subenheten av NF-kB. Våre Immunoblotanalyse data viste at honokiol behandling forårsaket en markert og doseavhengig reduksjon i NF-kB nivåer i den nukleære fraksjonen av både MiaPaCa og Panc1 kreft i bukspyttkjertelen celler med en samtidig økning i den cytoplasmiske fraksjon (figur 6B). Cellulær fordeling av NF-kB er kontrollert av relative ekspresjon av dets biologiske inhibitor IkB, som holder NF-kB sekvestrert i cytoplasma i et inaktivt kompleks [23]. Derfor, analyserte vi cytoplasmiske ekstrakter av honokiol-behandlede kreft i bukspyttkjertelen celler for bestemmelse av IkB-α nivå. Våre data viser en doseavhengig økning i nivået av IkB-α ved honokiol-behandling (figur 6B). Dette var forbundet med en samtidig reduksjon i IicB-fosforylasjon α indikerer økt stabilisering av IkB-α etter eksponering for honokiol. Alt i alt har våre data indikerer at honokiol undertrykker konstitutiv aktivering av NF-kB i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) MiaPaCa og Panc1cells (0,5 x 10
6 celler /brønn) ble sådd ut i 12-brønns plate . Neste dag ved 60% konfluens, ble cellene ko-transfektert med NF-kB luciferase reporter og TK-Renilla luciferase (kontroll) plasmider. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med honokiol (20, 40, eller 60 uM) for neste 24 timer. Protein lysatene ble gjort og luciferase (Brann-fly, test og Renilla, transfeksjon effektivitet kontroll) aktivitet vurdert ved hjelp av en dual-luciferase assay system. Dataene er presentert som normalisert fold-endring i luciferase-aktivitet (gjennomsnitt ± SD; n = 3, * p 0,05). (B) Totalt, nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble fremstilt fra celler behandlet med honokiol (20, 40, eller 60 uM) i 6 timer og ekspresjon av NF-kB /p65, p-IkB-α (S32 /36) og IκB- α ble bestemt ved Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Intensitetene for immunoreaktive bånd ble kvantifisert ved densitometri. Normaliserte densitometry verdier er angitt på toppen av båndene som indikerer en redusert lokalisering av NF-kB /p65 i kjernen med en samtidig økning i cytoplasma. I motsetning til dette, ble ekspresjon av p-IkB-α redusert og føre til økte nivåer av IkB-α. Til sammen er disse dataene antyder klart at honokiol hemmer NF-kB aktivitet gjennom stabilisering av IkB-α.
Honokiol chemosensitizes de kreft i bukspyttkjertelen celler for gemcitabin toksisitet
Gemcitabin er den eneste FDA godkjent kjemoterapeutisk legemiddel mot kreft i bukspyttkjertelen; Imidlertid er det fortsatt minimalt effektive på grunn av chemoresistance [3], [5], [10]. Siden aktivering av NF-kB er ansett som en av mekanismene poten chemoresistance, undersøkte vi om honokiol ville fungere som en chemosensitizer i kreft i bukspyttkjertelen celler. Kreft i bukspyttkjertelen celler (MiaPaCa og Panc1) ble behandlet med gemcitabin alene eller i kombinasjon med til side IC
50 konsentrasjoner av honokiol og virkning på veksthemming ble undersøkt ved bruk av celle-levedyktighet assay. Våre data viser at gemcitabin hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler på en doseavhengig måte og kombinert behandling med honokiol førte til en betydelig reduksjon i IC
50 av gemcitabin (figur 7A). Ved 10 og 20 uM doser av honokiol henholdsvis en ~1.53 og 2,41 ganger (i MiaPaCa) og ~1.40 og 2,08 ganger (i Panc1) reduksjon i IC
50 av gemcitabin ble observert betegner kjemosensibiliserende effekten av honokiol (figur 7A). For å identifisere en rolle av NF-kB, undersøkte vi dens cellulære lokalisering i gemcitabin (alene eller i kombinasjon med honokiol) -behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre data viste en økt opphopning av NF-kB i kjernerommet, og en samtidig reduksjon i cytoplasmafraksjonen med økende doser av gemcitabin i både MiaPaCa og Panc1 celler (figur 7B). Spesielt, observerte vi at honokiol (selv ved 20 pM dose) var effektive i å hemme gemcitabin-indusert aktivering av NF-kB i begge MiaPaCa og Panc1 celler (figur 7C). Disse funnene tyder klart på at honokiol potenserer anti-tumor effekt av gemcitabin ved å fungere som en chemo-sensibilisator i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) MiaPaCa og Panc1 celler ble dyrket i 96 brønners mikrotiterplater (1 x 10
4 celler /brønn). Ved sub-konfluens, ble cellene behandlet med gemcitabin (1,25 til 40 uM) alene eller i kombinasjon med honokiol (10 eller 20 uM) i 48 timer. Prosent levedyktighet ble målt ved hjelp av WST-1-assay. Data er presentert som relativ prosent levedyktighet i forhold til ubehandlede eller honokiol bare-behandlede celler for å kontrollere for vekst undertrykkende effekten av honokiol (gjennomsnitt ± SD, n = 3. *, p 0,05). En betydelig reduksjon i IC
50 verdiene for gemcitabin ble observert i celler ko-behandlet med honokiol. (B) Celler ble behandlet med gemcitabin (5, 10 og 20 uM) i 6 timer og ekspresjon av NF-kB /p65 i nukleære, ble cytoplasmatiske og de totale cellelysatene bestemt ved Western blot-analyse. Gemcitabin behandling av celler resulterte i forbedret kjerne akkumulering av NF-kB /p65 på en doseavhengig måte (C) Kjerne og cytoplasmiske ekstrakter ble fremstilt fra celler behandlet med gemcitabin (10 uM), honokiol (20 uM) alene eller i kombinasjon for seks h. Uttrykk av NF-kB /p65 i kjernefysiske, cytoplasmatiske og totale cellelysater ble bestemt ved Western blot analyse. Dataene viser at honokiol co-behandling begrenset gemcitabin-indusert NF-kB /p65 atom akkumulering. Sammen utgjør disse funnene tyder på at honokiol fungerer som en chemosensitizer og øker den cytotoksiske effekten av gemcitabin i bukspyttkjertelkreft.
Diskusjoner
Kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en ødeleggende malignitet grunn av mangel på effektiv terapi for behandling [3]. Denne studien viste at honokiol (en naturlig biphenolic forbindelse) er effektiv i å undertrykke veksten av humane kreft i bukspyttkjertelen celler (MiaPaCa og Panc1) på grunn av sin cytostatiske og cytotoksiske egenskaper. Videre våre studier gitt bevis for en rolle honokiol i kjemosensibiliserende bukspyttkjertelen kreftceller til å gemcitabin toksisitet. Honokiol hemmet NF-kB aktivitet og forårsaket endret uttrykk av mange cellesyklus og overlevelsesassosierte proteiner for å konferere sin vekst undertrykkende og kjemosensibiliserende effekter i kreft i bukspyttkjertelen celler.
deregulert vekst i kreftceller ofte tilskrives tap av kontroll i proliferative og apoptotiske trasé [24]. Faktisk har molekylære studier viste at ekspresjonen av cellesyklus regulatorer og proteiner forbundet med celleoverlevelse er hyppig endres på flere humane krefttyper [25] – [27]. Cellesyklus reguleres ved felles virkninger av cykliner, cyklin-avhengige kinaser (CDK) og CDK-inhibitorer [26], [28]. Vi har observert at ved behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med honokiol resulterte i G
1-fase arrest av cellesyklusutvikling, sammen med reduksjon i cyklin D1, cyklin E, Cdk2 og Cdk4 og økning i p21 og p27 på proteinnivået. Cyclin D1 og dets katalytiske partner Cdk4 dominere i G
1 fase, mens cyclin E og Cdk2 komplekse regulerer cellesyklusprogresjon fra G
1 til S [26], [28]. Derfor våre funn tyder på at honokiol-indusert arrestasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler i G
en cellesyklus fase kan være mediert gjennom nedregulering av cykliner og CDK sammen med oppregulering av p21 og P27 proteiner som danner heterotrimeric komplekser med G
1-S-CDK og cykliner for å hemme deres aktivitet [29]. Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier på effekten av honokiol i human lymfoid leukemi, plateepitel lungekreft og brystkreft celler [16], [17], [30].
Etter G
1- fase cellesyklus arrest, kan cellene enten gjennomgå reparasjon eller angi apoptotiske sti å opprettholde cellular integritet og eliminering av feilet /muterte pre-maligne og neoplastiske celler [31]. Således, induksjon av apoptose er en av de beskyttende mekanismer mot kreft initiering og progresjon og kreftcellene har ofte ervervet resistens mot apoptose [24]. I denne studien, observerte vi signifikant induksjon av apoptose i honokiol behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler som indikerer at honokiol er i stand til å forsterke den apoptotiske maskineriet. Celle overlevelse blir vedlikeholdt av en fin balanse av forholdene mellom pro-apoptotiske (f.eks Bad og Bax) og anti-apoptotiske proteiner (f.eks Bcl-2 og Bcl-xL), som styrer prosessen med apoptose gjennom utgivelsen av caspases [ ,,,0],32], [33]. Derfor endret uttrykk av Bcl-2 familien proteiner observert på honokiol behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler på en måte som favoriserer økning i prosenter av Bax /Bcl-2 og Bax /BCL-XL kan ligge til grunn for den observerte apoptotisk effekt av honokiol. Dereguleringen av apoptose-relaterte proteiner er også blitt rapportert i kondrosarkom celler etter behandling honokiol ytterligere støtte dens rolle i induksjon av apoptose [34].
Vi har også observert hemming av NF-kB aktivitet på honokiol behandling, som var forbundet med inhibering av IkB-α fosforylering og samtidig økning i sin ekspresjon. Transkripsjonsfaktor NF-kB er konstitutivt aktivert i flere ondartede sykdommer og har blitt rapportert å være patologisk implisert i kreft i bukspyttkjertelen [18] – [20]. Nyere studier har vist at vekstundertrykkende virkning av honokiol i prostata og tykktarm kreft er mediert gjennom hemming av NF-kB [35]. NF-kB transkripsjonsfaktor består av heterodimerer som består av Rel (p65, c-Rel og relB), P52, og P50-proteiner, og er lokalisert i cytoplasma i sin inaktiv form i kompleks med IkB (inhibitor av NFkB bestående av α og β subenheter som maskerer dets nukleære lokaliseringssignalet [36]. Aktivering av NF-kB er forårsaket, når IkB-α blir fosforylert av IKK (inhibitor kinase) -kompleks fører til sin ubiquitinering og degradering. Dette resulterer i frigjøring av NFkB fra cytoplasma og transport inn i kjernen, etterfulgt av aktivering av NF-kB-responsive promoter. NF-kB er kjent for å indusere ekspresjon av cyclin D1, Bcl-2 og Bcl-xL (endres ved honokiol behandling i studien) sammen med en rekke av proteiner involvert i celle-proliferasjon og overlevelse [37], [38]. Derfor kan det foreslått at veksthemming av kreft i bukspyttkjertelen celler ved honokiol er mediert gjennom hemming av NF-kB.
klinisk utfall i kreft i bukspyttkjertelen har vært dårlig på grunn av avansert og metastatisk tilstand av sykdommen ved tidspunktet for diagnose og ineffektivitet av tillatte medikament-behandlingen på grunn av chemoresistance [3], [5], [10]. Foreløpig er gemcitabin nasjonal standard kjemoterapeutiske stoffet for kreft i bukspyttkjertelen behandling. Gemcitabin forstyrrer DNA syntese fører til cellesyklus og apoptose i ultimate kurs [39], [40]. En av de mekanismer som begrenser gemcitabin effekt er indusert aktivering av NF-kB som respons på behandlingen [41], som kan føre til apoptotisk forsinkelse eller undertrykkelse. I denne studien har vi vist kjemosensibiliserende effekten av honokiol på kreft i bukspyttkjertelen celler til gemcitabin toksisitet. I tillegg viste vi at gemcitabin behandling induserte akkumuleringen av kjernefysisk NF-kB, som kan effektivt inhiberes ved ko-behandling med honokiol. Disse parallelle funn indikerer at hemming av NF-kB aktivitet kan også megle chemosensitization av kreft i bukspyttkjertelen celler ved honokiol. Faktisk er det blitt rapportert tidligere at anti-kreft effekt av kjemoterapeutiske midler kan forsterkes ved inhibisjon av NF-kB aktivitet [22], [41].
Som konklusjon, har vi vist, for første gang den veksthemmende og kjemosensibiliserende potensialet honokiol i bukspyttkjertelkreft. Honokiol bevirker G
1 fase cellesyklus-stans og induksjon av apoptose ved å endre ekspresjonen av cellesyklus og overlevelse assosierte proteiner. Inhibering av NF-kB kan være en av de viktige mekanismer i honokiol-indusert vekst undertrykkende og kjemosensibiliserende effekter i kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi mener derfor at honokiol kan være en ny lovende naturlig middel for behandling av kreft i bukspyttkjertelen, og kan også tjene som en chemosensitizer for å forbedre den terapeutiske effekt av gemcitabin, som allerede er i klinisk anvendelse som et terapeutisk medikament.
materialer og metoder
Reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) medium ble hentet fra Thermo Scientific (Logan, UT). Fetal bovin serum (FBS) var fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Penicillin, streptomycin og trypsin-EDTA ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol ble anskaffet fra LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemcitabin ble gitt av USAMCI apotek. Fugene transfeksjon reagens, fosfatase /proteasehemmere cocktail og celleproliferasjon reagent WST-1 ble anskaffet fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland). Propidiumjodid- /RNase flekker buffer og PE Annexin V apoptose deteksjon kit ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Diego, California). Nuclear ekstrakt kit ble anskaffet fra Active Motif, LLC (Carlsbad, California). Antistoffer mot Bcl-2, Bax og p-IkB-α (Ser32 /36) (kanin polyklonale), Bcl-xl og NF-kB /p65 (kanin monoklonalt), og IkB-α (mus monoklonalt) ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot p21, ble Cdk4 (mus monoklonalt), p27, cyklin D1, cyklin E, Cdk2 (kanin polyklonale), og pepperrot peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). P-Actin (monoklonalt) antistoff ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL pluss western blotting deteksjon kit ble anskaffet fra Thermo Scientific. pGL4.32 [luc2P /NF-kB -re /Hygro] plasmid, PRL-TK plasmid og Dual Luciferase Assay System kit var fra Promega (Madison, WI).
Cell kultur og behandlinger
De humane pankreas cellelinjer MiaPaCa og Panc1 (ATCC, Manassas, VA) ble opprettholdt i kultur som tilhenger monolag i RPMI-1640 og DMEM henholdsvis, supplert med 10% (v /v) FBS, penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler ble opprettholdt i 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C. Vekst medium ble skiftet hver 3 dag og cellene ble splittet (01:03) når de nådde 80% samløpet. For behandlinger, ble stamløsning av honokiol (10 mmol /l) fremstilt i DMSO, lagret ved -20 ° C, og fortynnet med friskt komplett medium umiddelbart før bruk. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av honokiol alene, gemcitabin alene eller i kombinasjon (som angitt i figuren sagn). Et like stort volum av DMSO (sluttkonsentrasjon, under 0,1%) ble tilsatt til kontroll
Cellevekst assay
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater (1 x 10
4. celler /brønn) en dag før behandling. Celleviabilitet i de behandlede celler ble undersøkt etter 24 til 72 timer ved hjelp av WST-1 (4- [3- (4-jodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-benzen di-sulfonat) assay kit som per produsentens instruksjoner med hensiktsmessige kontroller. Denne analyse er basert på spaltingen av WST-1 i metabolsk aktive celler til å danne vannløselige formazan. Absorbansen av formazan ble målt ved en bølgelengde på 450 nm, med bakgrunn subtraksjon ved 630, ved anvendelse av en Bio-Rad Referansemikroplateleser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Veksten ble beregnet som prosent levedyktighet = [(A /B) x 100], hvor A og B er absorbansen av behandlede og kontrollcellene, henholdsvis.
Cell-syklusanalyse
Effekten av honokiol behandling av cellesyklusutvikling ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri etter farging med propidiumjodid (PI). I korte trekk-celler (1 x 10
6 celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønners plate og synkronisert ved å dyrke dem i serumfritt medium. Etter 48 timer ble mediet erstattet med fullstendig medium som inneholder de ønskede konsentrasjoner av honokiol eller DMSO. Flytende og festede celler ble oppsamlet etter 24 timer med behandling og fiksert i 70% etanol over natten ved 4 ° C. Cellene ble deretter farget med propidiumjodid, ved bruk av PI /RNase farging buffer i 1 time ved 37 ° C.
