Abstract
Bakgrunn
denaturert DNA i væsker kan være et egnet biomarkør for kreftpasienter.
XAF1
har vist seg å være ofte nedregulert i human magekreft (GC). Her undersøkte vi om
XAF1
metylering i GC kan være en nyttig biomarkør.
Metoder
Real-time RT-PCR ble brukt til å oppdage
XAF1
mRNA uttrykk; immunhistokjemi og western blot ble brukt til å undersøke XAF1 protein uttrykk i GC vev (n = 202) og de tilhørende para kreft histologiske normalt vev (PCHNTs). Sanntids metylering spesifikk-PCR ble brukt til å undersøke
XAF1
promoter metylering i samme panel av GC vev, deres PCHNTs og sera.
Resultater
Vi har bekreftet hyppig
XAF1
ned-regulering i både mRNA og proteinnivåene i GC vev sammenlignet med normale kontroller og PCHNTs.
XAF1
hypermethylation ble dokumentert i 83,2% (168/202) av GC vev og 27,2% (55/202) av PCHNTs, mens ingen metylering ble påvist i de 88 normale kontroller. Metyleringen nivå i GC vev var signifikant høyere enn i PCHNTs (
p
0,05). Den hypermethylation av
XAF1
signifikant korrelert med nedregulering av
XAF1
i GC vev i både mRNA og proteinnivå (
p
0,001 hver). Videre, vi har oppdaget høy frekvens av
XAF1
metylering (69,8%, 141 av 202) i sera DNA fra de samme pasientene, mens sera DNA fra 88 ikke-tumor kontroller var negative for
XAF1
metylering.
XAF1
metylering i både GC vev og i sera kan være en god biomarkør for diagnostisering av GC (AUC = 0,85 for vev og AUC = 0,91 for sera) og signifikant korrelert med dårligere prognose (
p
0,001). I tillegg, etter operasjonen negativ til positiv overgang fra
XAF1
metylering i sera sterkt assosiert med tumor tilbakefall.
Konklusjoner
1) dysfunksjon av
XAF1
er hyppig og er regulert gjennom
XAF1
promoter hypermethylation; 2) Påvisning av sirkulerende metylert
XAF1
DNA i serum kan være en nyttig biomarkør i diagnose, vurdere pasientens utfall (prognose og tilbakefall) for GC pasienter
Citation. Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Sirkulasjons denaturert
XAF1
DNA Indikerer dårlig prognose for magekreft. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 12 mars 2013; Godkjent: 16 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013
Copyright: © 2013 Ling et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Science and Technology Generelt Prosjekt i Zhejiang-provinsen (nr. 2009C33143), og dels ved en bevilgning fra Backbone talent av Zhejiang Provincial Medisin og Hygiene Platform programmer (nr. 2011RCA009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformene i Kina, med en høy forekomst og dødelighet, ca sto for 10% av alle kreftformer [1]. Gastric tumorigenesis er en komplisert, flertrinnsprosess som involverer endringer av mange gener [2]. Avvikende promoter metylering er en av de viktigste mekanismene for å slå noen tumorsuppressorgener og kreftrelaterte gener og spiller svært viktige roller i patogenesen og progresjon i humane kreftformer [3], [4] – [6], inkludert magekreft [7] , [8]. I mellomtiden, samler data sterkt antydet at DNA-metylering kan være nyttig og kraftig biomarkør i kreftrisiko evaluering [5], [7], tidlig diagnose [7], å forutsi pasientens prognose [7], [8], og evaluere følsomheten til cellegifter [9]. Vår nylig studie og andre forskere vist at detektere sirkulerende denaturert DNA i blod er en potent og praktisk metode for kreftpasienter [7], [10], [11].
X-bundet hemmer av apoptose (
XIAP
) -associated faktor 1 (
XAF1
) er en roman negativ regulator av
XIAP
, som reverserer XIAP beskyttelse rolle på kreftceller [12] – [14]. Tapet av
XAF1
uttrykk vil gjøre kreftceller resistens mot apoptose og fremme svulst celle overlevelse [14] – [17]. Dysfunksjon av
XAF1
har blitt rapportert i flere kreft hos mennesker sannsynligvis gjennom arrangøren metylering [15] – [19], noe som tyder på dens betydning i tumorigenesis. I human magekreft,
XAF1
har blitt rapportert å være ofte og betydelig nedregulert og dette nedregulering av
XAF1
sannsynligvis gjennom DNA hypermethylation spesifikke CpG områder [15], [16 ], [18]. Men det er heller ikke rapportert om
XAF1
metylering i blodet og dens potensiale som en biomarkør. I denne studien undersøkte vi
XAF1
promoter metylering i parede vev og serumprøver fra et stort panel av pasienter med magekreft, og evaluert sirkulerende denaturert
XAF1
som en potensiell biomarkør for magekreft .
Materiale og metode
Etikk erklæringen
De identifiserte menneskelige vevsprøver og sera ble oppnådd fra Zhejiang-provinsen menneskelig vev Specimen Bank. Bruken av prøvene ble godkjent av Institutional Review Board i Zhejiang-provinsen Cancer Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient i samsvar med kravene i vår institusjonens styre av etikk. 88 ikke-kreft frivillige ga skriftlig informert samtykke. En del av prøvene var fra Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan County. The Institutional Review Board på medisinsk etikk i Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan fylke godkjent metode for prøvetaking, inkludert skriftlig informert samtykke fra alle pasienter, henholdsvis.
vevsprøve
sammenkoblede tumor og para-kreft histologiske normalt vev (PCHNT) prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet på tidspunktet for kirurgi fra 202 pasienter med primær adenokarsinom i ventrikkel i Zhejiang-provinsen Cancer Hospital, Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan fylke fra januar 2008 til desember 2009. PCHNT ble vurdert mikroskopisk for nærvær av normale celler og fravær av dysplastiske celler. Ingen av disse tilfellene hadde gjennomgått noen medisinsk behandling før operasjonen. Demografiske, kliniske og histopatologiske parametre av disse tilfellene ble vist i tabell 1. vekstmønster av tumorceller ble bestemt i henhold til Ming klassifisering [20]. Alle rekrutterte pasientene hadde blitt fulgt opp med jevne mellomrom til forfall. Antrum slimhinnen snitt fra 88 ikke-kreft frivillige ved gastroskopi ble tilfeldig samlet som kontroller i samme periode, inkludert 54 menn og 34 kvinner, med en gjennomsnittsalder på 52,9 år. Blant disse frivillige, ble 48 pasienter diagnostisert med kronisk ikke-atrofisk gastritt. I mellomtiden var forbundet serumprøver samlet inn før kirurgi eller endoskopi.
Analyse av Helicobacter pylori (
H. Pylori
) Infeksjon
Biopsi ble innhentet fra alle pasienter som hadde endoskopisk undersøkelse.
H
.
pylori
status ble bestemt ved hurtig Urease test og Giemsa farging metoder [21], [22]. Det ble ansett som
H
.
pylori
smitte når begge testene var positive, og de prøver med én positiv ble ekskludert for statistisk analyse [22].
Real-time RT-PCR
mRNA uttrykk av
XAF1
ble analysert ved real-time RT-PCR [23]. Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol (Gibco). Totalt 3 ug totalt RNA ble underkastet revers transkripsjon ved bruk av M-MLV-revers transkriptase (Promega). Den glyseraldehyd fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) ble valgt som intern referanse. Sekvensene til
XAF1
primere var som følger: (F) 5′-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 «, (R) 5′- GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3».
GAPDH
Primersekvensene var som følger: (F) 5′-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 «, (R) 5′-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3». De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative endringer i genuttrykk.
immunhistokjemisk farging
uttrykk for XAF1 protein ble bestemt ved immunhistokjemisk analyse med XAF1 monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology ). Immunhistokjemisk farging for XAF1 ble utført ved hjelp av representative parafininnstøpte prøvene fra de 202 GC pasienter. Etter deparaffinization, antigen gjenfinning i 0,01 M citratbuffer, og inaktivering av endogen peroksidase-aktivitet i 3% H
2o
2 /metanol, inkubert vi lysbildene med antistoffer for XAF1 ved 4 ° C over natten, og immunhistokjemisk farging, etter en standard avidinbiotin-peroksydase kompleks teknikk, ble utført ved anvendelse av 3,3′-diaminobenzidin (DAB) som kromogen. Kjerner ble kontra med hematoksylin. Den immunhistokjemisk farging score (ISS) bestemmes av tre uavhengige patologer som kombinerer farging hyppigheten og intensiteten som følger [24], [25]: ingen farging er scoret som 0, 1~10% av celler farget scoret som en, 11~50% som to, 51~80% som 3, og 81~100% som 4. fargeintensitet er rangert på en skala fra 0 til 3, med 0, negativ; 1, svak; 2, moderat; og 3 = sterk. Når det er multifokal immunreaktivitet og det er betydelige forskjeller i fargingsintensitet mellom brennpunkter, var gjennomsnittet av minst intens og mest intense farging registrert. Rådataene ble omdannet til ISS ved å multiplisere frekvensen stillingen og fargingsintensitet. Teoretisk sett kan ISS variere fra 0 til 12. En ISS av 9~12 ble ansett sterke immunoreaktivitets, ble 5~8 vurderes som moderat, 1~4 ble ansett svak, og 0 ble scoret som negative. Delene der flekker ikke kan være godt karakteriseres ble ansett som usikre.
Western Blot analyse
Paret tumor og PCHNT eksemplarer av 20 saker ble tilfeldig valgt fra 202 mage kreftpasienter for western blot analyse. Totalt protein ble ekstrahert og deretter kvantifisert ved hjelp av Lowry-metoden [26]. Western blot analyse ble utført ved hjelp av anti-XAF1 monoklonale antistoffer (Santa Cruz, California) i henhold til tidligere rapport [6]. β-tubulin ble servert som en intern kontroll.
DNA Extraction, Bisulfite Modifikasjon og Real-time Metylering Specific-PCR (MSP)
Serial 5 mm seksjoner som inneholdt karsinom og ikke-neoplastiske vevene ble montert på ikke-belagte glassplater og tørket ved 37 ° C over natten. Etter deparaffinization og farging med hematoxylin og eosin (H E), samlet vi 5000 kjerner fra 5 til 10 seriesnitt med en 27G nål. De oppsamlede kjerner ble behandlet med 40 ml 200 mg /ml proteinase K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 42 ° C i 72 timer. Den paramagnetiske perle teknologi (AxyPrep Mag Blood gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) ble benyttet for å isolere genomisk DNA fra friskt blod ifølge kit protokoll. Protokollen består av følgende trinn: lyse, binding, vasking, og eluering. Forurensninger fjernes i løpet av bindings og vasketrinn. Kvaliteten av DNA ble bestemt ved A260 /280-forhold på Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA-integritet ble undersøkt ved denaturerende agarosegel-elektroforese.
DNA ble modifisert etter natriumbisulfitt bruker EpiTect Bisulfite kit (Qiagen Inc.) etter manufactory instruksjoner. Modifiserte DNA ble analysert ved real-time MSP på ABI7500 PCR (ABI Co.) med SYBR Premiks Taq ExTaq Kit (Takara Co Ltd).
XAF1
metylering og unmethylation spesifikke primere ble utformet som følger:
XAF1 plakater (MF) 5′-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 «, (MR) 5’CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3»;
XAF1 plakater (UF) 5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 «, (UR) 5′-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3» [23]. Humant genomisk DNA (NEB) ble behandlet ved SSSI metyltransferase in vitro ble anvendt som en positiv kontroll. Et perifert blod-DNA fra en frisk person ble anvendt som en negativ kontroll. Prosentandelen av denaturert DNA i prøvene ble beregnet i henhold til de referanser som tidligere beskrevet [27], [28]. Metylert DNA-indeksen ble scoret i henhold til andelen av DNA metylering; 0, 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; og 4, 80%. Indeksen score på 0 regnes som DNA unmethylation og scorer 1-4 ble ansett hypermethylated henholdsvis [7], [27]. Den 20% avskåret terskelen for DNA hypermethylation var basert på kontroll normal prøver og interne kvalitetskontroller oppnådd i sanntid MSP analyse.
Cell Culture and Drugs behandling
Menneske mage kreft cellelinjer (AGS og KATO-III) ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /mL penicillin og 100 U /mL streptomycin ved 37 ° C og 5% CO henholdsvis
2,. Dyrkede celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-CDR) (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 1,0 pmol /L. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 20 ng /ml ble administrert følgende 5-Aza behandling eller alene i 24 timer. Celler ble oppsamlet og utsatt for DNA, RNA og proteinrensing og etterfølgende analyser.
Statistical Analysis
SPSS 17,0 statistisk programvare ble tatt i bruk for dataanalyse. Telledata sammenligninger mellom grupper ble utsatt for
χ
2 test og Fishers eksakte test. Overlevelsesanalyse ble computered ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og betydelige nivåer ble vurdert ved hjelp av log-rank test. En univariat analyse ved Cox-modellen regresjon ble brukt for å bestemme identifiserte prognostiske faktorer, og multivariat analyse med Cox regresjonsmodellen ble benyttet for å utforske kombinerte effekter. For alle statistiske analyser,
p
verdier. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikans
Resultater
nedregulering av
XAF1
i Primær Gastric svulster
for å undersøke
XAF1
genekspresjon profil, undersøkte vi mRNA uttrykk for
XAF1
i 88 ikke-kreft frivillige og 202 primær mage kreft vev og tilhørende PCHNTs. Som vist i figur 1A,
XAF1
uttrykk ble betydelig redusert i magekreft prøvene sammenlignet med det i normale kontroller og PCHNTs (
p
0,001). Men det var ingen signifikant forskjell i
XAF1
uttrykk i PCHNTs sammenlignet med ikke-kreft kontroller.
A,
XAF1
mRNA uttrykk nivå i GC vev, PCHNTs ( para-cancerous histologisk normalt vev) og ikke-kreft kontroller ble bestemt ved real-time RT-PCR og ble normalisert til
GAPDH
. B-F, XAF1 protein-ekspresjon ble nedregulert i magekreft vev. B, en representant positiv, høy ekspresjon av XAF1 protein i en PCHNT vev; C, Fraværende av XAF1 uttrykk i en dårlig differensiert GC; opprinnelige forstørrelse × 200. D, et sammendrag av XAF1 immunhistokjemisk fargingsresultater i 202 mage kreft. E, representant western blot analyse av XAF1 uttrykk i magekreft og tilsvarende PCHNT prøver med forskjellige
XAF1
metylering nivåer. PCHNT vev i sak 59 (XAF1 metylering score: 0); GC vev i sak 59 (metylert
XAF1
score: 4); PCHNT vev i sak 20 (metylert score: 0); GC vev i sak 20 (metylert
XAF1
score: 1). Beta-tubulin ble brukt som intern kontroll. F, Oppsummering av de vestlige blotting resultater fra 20 GCer og tilsvarende PCHNTs presenteres som relative band tetthet normalisert til beta-tubulin av de samme prøvene.
Videre
XAF1
uttrykk var betydelig lavere i avanserte tumorer (stadium III /IV) enn at i tidlig stadium svulster (stadium i /II) (
p
0,0001, figur S1 A), og var betydelig lavere i dårlig differensierte svulster enn i godt /moderat differensierte svulster (
p
0,0001, figur S1B)
For å sjekke XAF1 proteinnivået i magekreft vev, vi utført immunhistokjemisk analyse i 202 mage kreft vev og tilhørende PCHNTs.. Nuclear XAF1 uttrykk var konsekvent tilstede i normal mage epitel viser høye immunreaktive score. Den XAF1 protein uttrykk ble påvist i høye nivået i 97,5% (197/202) av PCHNTs (figur 1B). Men høy uttrykk for XAF1 protein ble bare påvist i 16,8% (34/202) av magekreft vev; Flertallet av magekreft vev var fraværende eller på et lavt nivå av XAF1 protein (figur 1C). De immunhistokjemiske funn er oppsummert i tabell 1. immunhistokjemisk farging score i mage kreft vev var betydelig lavere enn i PCHNTs eller i normale kontroller (
p
0,0001, figur 1D). Tapet av XAF1 protein signifikant korrelert med
H. pylori
infeksjon, tumor størrelse, histologisk differensiering, lymfatisk invasjon, venøs invasjon, invasiv dybde, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser og klinisk stadium (tabell 1) (alle
p
0,05)
.
De immunhistokjemiske resultatene av 20 mage kreft vev ble ytterligere bekreftet ved hjelp av western blot analyse. De representative vestlige blotting resultater i to tilfeller ble vist i figur 1E. Den relative mengden av XAF1 proteinekspresjon ble normalisert til den β-tubulin av de samme prøvene. Den gjennomsnittlige XAF1 protein nivå i 20 mage kreft vev var betydelig lavere enn i PCHNTs (
p
0,05). (Figur 1F)
Arrangøren Hypermethylation av
XAF1
i Primær Gastric Svulster
for å undersøke de molekylære mekanismer for
XAF1
stillhet i mage kreft, vi brukt en real-time MSP teknologi for å studere DNA metylering status for
XAF1
promoter. Hyppigheten av
XAF1
hypermethylation i mage kreft vev, tilsvarende PCHNTs og ikke-kreft kontrollene var 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) og 5,7% (5/88), henholdsvis. Den hypermethylation hyppigheten av
XAF1
i kreft er betydelig høyere enn i PCHNTs og ikke-kreft-kontroller (alle
p
0,0001, figur 2)
Data viser. hyppigheten av
XAF1
hypermethylation (DNA metylering nivå ≥20%) i hver gruppe.
av notatet, metylert status for
XAF1
signifikant korrelert med noen klinisk-patologisk parametre i magekreft, som lymfeknutemetastase, T-stadium,
H
.
pylori
infeksjon, etc (alle
p
0,05, tabell 2). Ingen signifikant sammenheng mellom hypermethylation av
XAF1 Hotell og kjønn, alder ved diagnose, svulststedet og fjernmetastaser ble dokumentert (alle
p
0,05). (Tabell 2)
XAF1
Arrangøren Hypermethylation er assosiert med sine Transkripsjonell lyddemping i Gastric kreftceller
For å undersøke sammenhengen mellom
XAF1
metylering og
XAF1
uttrykk, vi sammenlignet
XAF1
metylering nivå med
XAF1
mRNA nivå og proteinnivåer bestemmes enten ved immunhistokjemisk analyse (figur 3A) eller western blotting (figur 3B) med Spearman korrelasjonsanalyse. Som vist i figur 3A-, XAF1 proteinekspresjon (bestemt ved immunohistokjemisk analyse) i 202 GC vev ble korrelert med
XAF1
mRNA-nivå [lg (T /N)] (bestemt ved RT-PCR) (
γ
= 0,841,
p
0,0001). Mer viktig,
XAF1
metylering nivået var signifikant assosiert med
XAF1
mRNA nivå (
γ Anmeldelser = – 0,846,
p
0,0001) og XAF1 protein nivå (
γ
= -0,969,
p
0,0001). Lignende resultater ble oppnådd ved analyse av korrelasjonen av
XAF1
promoter metylering og XAF1 proteinekspresjon bestemt ved western blot analyse (figur 3B). Disse resultatene sterkt tiltalt som
XAF1
uttrykk er regulert av
XAF1
promoter metylering.
A, Korrelasjonen av
XAF1
metylering med
XAF1
mRNA-nivå bestemt ved RT-PCR-analyse og XAF1 protein ekspresjon bestemt ved immunohistokjemisk analyse i 202 magekreft vev. B, Korrelasjon av
XAF1
metylering med
XAF1
mRNA-nivå bestemt ved RT-PCR-analyse og XAF1 protein ekspresjon bestemt ved Western-blotting-analyse på 20 frosne magekreft vev. I både A og B,
XAF1
metylering score omvendt korrelert med
XAF1
genuttrykk i både mRNA og proteinnivåer.
5-Aza-CDR Administration Gjenoppretter Expression of
XAF1
for ytterligere å bekrefte epigenetisk regulering av
XAF1
uttrykk, AGS og KATO-III celler ble behandlet med 5-Aza-CDR og /eller TSA .
XAF1
mRNA uttrykk ble reaktivert i både mage kreft cellelinjer, ledsaget av demetylering av
XAF1
promoter (figur 4), noe som indikerer at
XAF1
er transcriptionally forstummet i disse cellene av DNA hypermethylation. Interessant, TSA behandling alene var effektivt for å gjenopprette
XAF1
uttrykk i AGS og KATO-III uten vesentlig endring av
XAF1
metylering nivå, noe som tyder på at histonmodifikasjonene kan også være involvert i regulering av
XAF1
uttrykk. Imidlertid har ikke administrering av TSA følgende 5-Aza-CDR hadde en additiv effekt i å gjenopprette genuttrykk med en ytterligere nedgang i metylering nivået av
XAF1
. Disse resultatene er i overensstemmelse med nyere studier som antydet at TSA kan ha en demetylering effekt i en gen-spesifikk måte [5]. Den vestlige blot analyse ved hjelp av AGS celler, som en modell, bekreftet oppregulering av XAF1 proteiner etter den 5-Aza-CDR og 5-Aza-CDR /TSA behandlinger (figur 4).
To magekreft -cellelinjer (AGS og KATO-III) ble behandlet med 1,0 umol /L 5-Aza-CDR i 72 timer og /eller 100 nM TSA i 24 timer. Metyleringen nivåer ble bestemt ved sanntids-MSP. Vi utførte sanntids RT-PCR-analyse i tre eksemplarer for hvert cDNA-prøve og benyttet medianverdier i tre eksperimenter. Den relative
XAF1
mRNA uttrykk ble normolized til
GAPDH
av de samme prøvene ved hjelp av formel 2
-ΔΔCT. Resultatene ble multiplisert med 100 for en bedre visualisering. Prosentandelen av
XAF1
DNA metylering er vist på venstre side; mens den relative mRNA uttrykk for
er XAF1
vises på høyre side. B: Uttrykk for XAF1 på proteinnivå etter 5-Aza-CDR og TSA behandlinger. Western blot-analyse av AGS-celler etter behandling med DMSO (kontroll), 5-Aza-CDR, eller 5-aza-CDR /TSA i 72 timer demonstrere oppregulering av de XAF1 proteiner i behandlede celler sammenlignet med kontroll (DMSO). Beta-tubulin er vist som en lasting kontroll.
Påvisning av Sirkulasjons
XAF1
Metylering
Vi oppdaget høy frekvens av
XAF1
metylering i grunnskolen magekreft (83,2%), noe som tyder på at det kan være en god biomarkør hvis
XAF1
metylering kan påvises i serum. Derfor undersøkte vi
XAF1
metylering i matchet serum DNA fra de 202 GC pasienter.
XAF1
metylering ble oppdaget i 141 (69,8%) serum DNA fra de 202 mage kreftpasienter (figur 5). I kontrast,
XAF1
metylering ble ikke påvist i serum DNA fra de 88 ikke-kreft kontroller.
Deretter fikk vi bekreftet konsistensen i
XAF1
metylering mellom tumorvev og tilhørende serum. I 168 tilfeller som viste
XAF1
metylering i tumorvev, 141 vises
XAF1
metylering i sin paret serum, noe som gir en konsistens på 83,9% mellom dem. Og i de 34 mage kreftpasienter uten
XAF1
metylering i deres mage kreft vev, ingen metylering ble funnet i alle serum DNA (figur S2).
XAF1
Metylering som en biomarkør for diagnose av magekreft
for å vurdere verdien av
XAF1
metylering som en biomarkør i diagnostisering GC, vi plottet mottaker drift karakteristikk (ROC) kurver og beregnet areal under kurven (AUC) verdier ved hjelp av DNA metylering data fra både GC vev og sera. Både ROC-analyser av
XAF1
metylering i vev og sera viste signifikant diskriminerende kapasitet (figur 6); AUC-verdien av vev
XAF1
metylering var 0,849 (95% konfidensintervall, 0,806 til 0,892;
p
0,0001), AUC-verdien av serum
AXF1
metylering var 0.909 (95% konfidensintervall, 0,875 til 0,942;
p
0,0001).
Receiver opererer karakteristikk (ROC) kurve analyse ble brukt for å vurdere muligheten for å
XAF1
metylering i mage kreft vev eller i serum som en biomarkør for å diagnostisere magekreft. For
XAF1
metylering i mage kreft vev, et område under ROC-kurven (AUC) er 0,849 (95% konfidensintervall, 0,806 til 0,892;
P
0,0001). For
XAF1
metylering i serum, er AUC 0.909 (95% konfidensintervall, 0,875 til 0,942;
P
0,0001).
I tillegg liker
XAF1
metylering status på mage kreft vev og sera signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser, T-stadium, klinisk stadium, og andre klinisk-patologisk parametre (alle
p
0,05, tabell 2 ).
XAF1
metylering korrelert med Prognose av magekreft pasienter
signifikant korrelasjon av
XAF1
metylering med mange klinisk-patologisk parametre (Tabell 2 ) antydet at det kan assosiere med prognosen for magekreftpasienter. Frem til forfall Oppfølging, 113 av 168 pasienter med
XAF1
hypermethylation i mage kreft vev gikk rask sykdomsprogresjon eller død. Median sykdomsfri overlevelse (DFS) var bare 23,4 måneder. I motsetning til i de 34 pasienter uten
XAF1
hypermethylation i deres mage kreft vev, bare 5 pasienter ble forverret, og median DFS var 39,6 måneder. Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med
XAF1
hypermethylation i deres mage kreft vev viste en tydelig dårligere overlevelse enn at uten
XAF1
hypermethylation (
p
0,0001) (Figur 7A). Tilsvarende Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med positiv serum
XAF1
metylering hadde signifikant lavere DFS enn i pasienter uten serum
XAF1
metylering (
p
0,0001 ) (figur 7B), noe som indikerer at
XAF1
promoter metylering i serum var et ugunstig prediktor for mage kreftpasienter.
Akkumulert sykdomsfri overlevelse (Cum DFS) kurver plottes agains
t XAF1
DNA metylering nivået i magekreft vev (A) og i sera (B). I både A og B, ble Kaplan-Meier analyse brukt og
P .
Henholdsvis 0,0001,
Cox regresjonsanalyse viste at
XAF1
metylering i sera er en faktor på pasientenes overlevelse: pasienter med
XAF1
metylering hadde dårligere prognose (
p
0,0001, Hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). I tillegg kunne TNM etapper og alder på diagnose anses som påvirker faktor av prognose i magekreft, bare når effekten av
XAF1
metylering ble eliminert. Videre sirkulerende metylert
XAF1
i blodet hadde en større innvirkning på prognosen enn i TNM stadier (tabell S1).
Positiv Overgang av Sirkulasjons
XAF1
Metylering Spår Tumor tilbakefall og dårlig prognose
Blant de 202 pasientene som ble evaluert for preoperativ sirkulerende
XAF1
metylering, fikk 72 pasienter en oppfølgingsundersøkelse av sirkulerende
XAF1
metylering 2~5 ganger i intervaller på 1~6 måneder etter operasjonen. Blant 12 gående pasienter, 10 pasienter viste negativ til positiv overgang i
XAF1
metylering status i deres sera, de to andre viste alltid positivt for
XAF1
metylering, noe som tyder på at oppfølging av
XAF1
metylering i serum kan være en god markør for å forutsi tumorresidiv (tabell 3).
Diskusjoner
XAF1 product: (
XIAP
-associated faktor 1) er en roman
XIAP
bindende protein som kan forstyrre kombinasjonen av
XIAP
med caspases, opphever beskyttelsen på kreftceller og resultater i tumor celle apoptose [12 ] – [14]. Den anti-apoptose funksjon av
XIAP
er bestemt ved forholdet mellom ekspresjonsnivåer av
XIAP
mot
XAF1 product: [15]. Redusert uttrykk eller stillhet
XAF1
er en hyppig hendelse i humane tumorer [16] – [19]. I den foreliggende undersøkelse har vi først bekreftet at
XAF1
genekspresjon var signifikant nedregulert i både mRNA nivå og proteinnivå i et stort panel av primære magekreft vev, og det nedregulering av
XAF1
uttrykk var signifikant assosiert med kreft etapper, metastaser og så videre, impliserer tap av
XAF1
funksjon i tumor progresjon. Dette er konsistent med andre forskningsrapporter [17] – [19]. For å utforske de molekylære mekanismene som er ansvarlig for
XAF1
stillhet, vi undersøkte
XAF1
promoter metylering i et stort panel mage kreft vev (
n
= 202) og normale kontroller (
n
= 88) med en real-time MSP-teknologi. Vi oppdaget en høy frekvens (83,2%) av DNA hypermethylation av
XAF1
i mage kreft vev. DNA hypermethylation av
XAF1
betydelig korrelert med nedregulering av
XAF1
både mRNA og proteinnivået i magekreft vev (figur 3). I tillegg 5-Aza-CDR behandling betydelig restaurert
XAF1
uttrykk i
XAF1
forstummet mage kreft cellelinjer (figur 4). Disse dataene antyder sterkt at hyppig nedregulering av
XAF1
i magekreftceller er regulert av sin promoter hypermethylation. Interessant, behandling av mage-kreftceller med TSA, et histon deacetylase inhibitor også gjenopprettet
XAF1
uttrykk, alene eller i kombinasjon med 5-Aza-CDR behandling, noe som indikerer at histon modifikasjon kan også være involvert i
XAF1
regulering
DNA metylering kan anvendes som en potensiell svulst biomarkør i forskjellige humane cancere [3] – [11], [23]. Tilstedeværelsen av celle-fri DNA som sirkulerer i perifert blod er blitt beskrevet hos pasienter med ondartede prosesser, og aktiv frigjøring av tumor-DNA i sirkulasjon har blitt rapportert [29] – [31].
