Abstract
Tumor micromilieu viser ofte uttalt acidose tvinge cellene til å tilpasse sin fenotype mot forbedret tumordannelse indusert av endrede cellulære signalering og transkripsjonsregulering. I de presenterer studie mekanismer og mulige konsekvenser av crosstalk mellom ekstra- og intracellulær pH (pH
e, pH
i) og mitogenaktiverte-protein-kinaser (ERK1 /2, p38) ble analysert. Data ble erholdt i hovedsak i AT1 R-3327 prostata carcinoma-celler, men prinsippet viktighet ble bekreftet i 5 andre celletyper. Ekstracellulær acidose som fører til en rask og vedvarende reduksjon av pH-verdien
i i parallell til p38 fosforylering i alle celletyper og til ERK1 /2 fosforylering i tre av seks celletyper. Videre ble p38 fosforylering utløst av såle intracellulær laktacidose ved normal pH
e. Inhibering av ERK1 /2-fosforylering i løpet av acidose ført til nekrotisk celledød. Ingen bevis for involvering av kinaser c-SRC, PKC, PKA, PI3K eller EGFR eller endringer i cellevolumet i acidose indusert MAPK aktivering ble oppnådd. Men våre data viser at acidose øker dannelsen av reaktive oksygenforbindelser (ROS), sannsynligvis stammer fra mitokondrier, som senere utløser MAPK fosforylering. Scavenging av ROS forhindret acidose indusert MAPK fosforylering mens tillegg av H
2o
2 utvidet det. Til slutt, acidose økt fosforylering av transkripsjonsfaktoren CREB via p38, som fører til økt transkripsjonen aktivitet av en CRE-reporter til og med 24 timer etter bytte av cellene tilbake til et normalt miljø miljø. Således kan et surt mikromiljø tumor indusere en mer langvarig p38-CREB-medited endring i den transkripsjonelle programmet, som kan opprettholde den forandrede fenotype, selv når cellene forlater tumormiljøet
relasjon:. Riemann A, B Schneider , Ihling A, Nowak M, Sauvant C, Thews O et al. (2011) surt miljø fører til ROS-Induced MAPK signale i kreftceller. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10,1371 /journal.pone.0022445
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 02.04.2011; Godkjent: 21 juni 2011; Publisert: 26.07.2011
Copyright: © 2011 Riemann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Deutsche Krebshilfe (Grants 106774/106906), den BMBF (PRONET-T3 Ta-04) og Wilhelm-Roux program av Medical School, Universität Halle-Wittenberg. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
To microenvironments kan skilles med hensyn til solide tumorer: (i) vevet miljø der kreftceller ligge (patologisk vev miljø) og (ii) det lokale miljøet skapt av kreftceller (tumor mikromiljø) , som kan generere en patologisk vev miljø for nabocellene. Den patologisk vev miljø støtter tumorvekst og svulsten mikromiljøet støtter tumorprogresjon [1] – [4]. Tumor mikromiljøet er karakterisert ved oksygenmangel (hypoksi), som en konsekvens av strukturelle og funksjonelle forandringer av den vaskulære nettverket [5], hvilket fører til utilstrekkelig perfusjon av fast tumor [5], [6]. For å opprettholde energibehovet tumorceller bytte sin metabolisme til glykolyse, noe som resulterer i økt glukoseforbruk og kraftig melkesyreproduksjon. Dette fenomen kan også oppstå i tumorer når oksygentilførselen er tilstrekkelig – kjent som Warburg virkning. Nylig, ble presentert bevis som viser at skjøten isoform ekspresjon av pyruvat-kinase er nødvendig for endret metabolisme som gir en selektiv fordel for tumorceller [7]. Sammen disse funksjonene utgjør et komplekst nettverk og skape en metabolsk mikromiljøet, bestående av hypoksi, lavt blodsukker, høye laktatkonsentrasjoner og ekstracellulære acidose. pH-verdien i faste tumorer er i området på 6,5 til 6.8 [6]. Dette sure miljøet er import for tumorvekst og progresjon.
Det er vel kjent at den metabolske mikromiljøet påvirker svulst celle atferd. For eksempel er effekten av strålingsterapi, fotodynamisk terapi og kjemoterapeutika svekket av tumormiljøet [8], [9]. Vekst og migrasjons egenskaper samt apoptose følsomhet kan påvirkes, også. Således fenotypen av tumorceller – og dermed av selve svulsten -, avhenger i tillegg til genetisk bestemmelse, på det metabolske mikromiljøet. Den «frø og jord» -hypothesis selv postulerer at etter oppkjøpet av alle nødvendige kreft genetiske forandringer bare dannelsen av svulsten mikromiljøet gjør at kreftceller til å vokse [10].
For en detaljert mekanistisk forståelse er det viktig å deconstruct dette mikromiljøet og bestemme effektene av de forskjellige parametere individuelt for å evaluere deres bidrag. Mens det er rikelig med litteratur om hypoksi, er viktigheten av metabolsk acidose mindre godt undersøkt. Nylig viste vi at metabolsk acidose per se forbedrer chemoresistance i prostata kreftceller i henhold normoksiske og normoglykemiske forhold [9], [11], noe som indikerer at acidose er en viktig microenvironmental determinant for svulst fenotype endringer. Dette acidose indusert stimulering av P-glykoprotein-avhengige chemoresistance avhenger MAP kinaser, men det er uklart hvordan aktivering av disse kinaser av et ekstracellulært pH-reduksjon oppstår [9]. Det kan være avhengig av intracellulære endring av pH-homeostase og dens regulering i respons til ekstracellulære acidose. Videre er det flere kandidatsignalveier som kan koble pH-endringer i MAPK aktivering, f.eks de kinaser PKA, PKB, PKC, c-Src eller EGFR [12]. Derfor er målet med denne studien var å undersøke (i) pH-homeostase av tumorceller i løpet av metabolsk acidose av mikromiljøet, (ii) mekanismene til ERK1 /2 og p38 fosforylering under disse betingelser, og (iii) den mulige forhold mellom disse to prosesser samt konsekvensene av å påvirke disse banene.
Materialer og metoder
Cell kultur
den underlinjen AT1 av rotte R-3327 Dunning prostata carcinom ble brukt som tidligere beskrevet [9]. Celler ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 37 ° C under en fuktig 5% CO
2 atmosfære og under dyrket to ganger i uken. LS513 celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, CRL-2134) ble dyrket under de samme vilkår som AT1 celler. OK celler (normale epitelceller fra nyreproksimaltubul av opossum nyre) [13] og NCI-H358-celler (human bronchioalveolar karsinom; American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; CRL-5807) ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10% FCS, MDCK-C7-celler (normale nyresamlekanal epitelceller av canine) [14] i MEM-medium supplert med 10% FCS og CHO-celler (udødelig ovarieceller fra kinesisk hamster) [15] i Hams F-12 medium supplert med 10% FCS. For alle forsøk ble celler dyrket i petriskåler (western blot) eller dekkglass (måling av pH
i) og overført til et medium uten FCS ytterligere tilskudd i 24 timer. Kontrollceller ble utsatt for bikarbonat-HEPES-bufret Ringer-oppløsning justert til pH 7,4. Intracellulær acidose ble indusert erstatter 40 mM NaCl med 40 mM melkesyre og reduksjon av klorid ved å fullstendig erstatte NaCl ved natriumglukonat (7,4 mM rest klorid). Ekstracellulære acidose (pH 6,6) ble påført ved bruk av bikarbonat-MES (morpholinoethanesulfonic acid) bufret Ringer løsning pH-justering til 6,6. Bufferkapasitet (β) er 5,9 mmol /lxΔpH for bikarbonat-HEPES bufret Ringer løsning ved pH 7,4 og 3,9 mmol /lxΔpH for bikarbonat-MES bufret Ringer løsning.
Experimental oppsett
etter uttømming serum i 24 timer, ble celler inkubert med en av de ovennevnte buffere (1 ml) i opp til 3 timer. Alle inhibitorer eller aktivatorer som ble anvendt ble det tilsatt i løpet av denne inkubasjonsperioden.
cytosolisk pH
cytosolisk pH av enkeltceller ble bestemt ved hjelp av pH-følsomt fargestoff BCECF (2 «, 7»-bis- ( 2-karboksyetyl) -5- (og-6) -carboxyfluorescein, acetoksymetylester, Invitrogen, Paisley, UK) som tidligere beskrevet [16], [17]. I korte trekk ble celler inkubert med Ringer-oppløsning inneholdende 5 pM BCECF-AM i 15 min. Deretter ble dekkglass skylt 2 ganger med superfusjons løsning for å fjerne overskuddet av fargestoff og overført til fasen av en omvendt Axiovert 100 TV-mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Eksitasjonsbølgelengdene var 450 nm /490 nm, utsendte lys ble målt gjennom et båndpassfilter (515-565 nm). Datasøkehastigheten var en fluorescens intensitet ratio hver 10 s. Etter bakgrunn subtraksjon, ble fluorescens intensitet forholdstall beregnet. pH-kalibrering ble utført etter hvert eksperiment ved nigericin (Sigma, St. Louis, USA) teknikk [18], [19] ved anvendelse av en to-punkts kalibrering (pH 6,8 og 7,5). Kalibreringsløsninger inneholdt 132 mM KCl og 1 mm CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 10 mM HEPES og 10 mikrometer nigericin.
Cell volum
Effekten av acidose på cellevolumet ble bestemt elektronisk med en Casy celleteller (Innovatis, Reutlingen, Tyskland). Derfor cellene ble inkubert som nevnt ovenfor, avspaltes ved trypsinering, og celle-volum og levedyktighet ble målt etter 10 minutter og 3 timer i de respektive Ringer løsninger.
Western blot
Western blotting ble utført ifølge standardprotokoller. Celler ble lysert (0,1% Triton X-100 i PBS, protease inhibitor cocktail, 37 mg /l natriumortovanadat eller 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, protease inhibitor cocktail, 184 mg /l natrium-ortovanadat), celleprotein bestemt ved BCA-methode (BC analysereagensene fra Uptima), separert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran . Deretter ble membranene inkubert med antistoffer som er spesifikke for ERK1 /2, p38, MKK3 /6; fosfo-ERK1 /2, fosfo-p38, fosfo-MKK3 /6, CREB og fosfo-CREB (1:1000, Cell Signalling). Den bundne primære antistoff ble visualisert ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og ECL-systemet (Pierce /Thermo Fisher Scientific) med den Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Biorad, Munchen, Tyskland). Kvantitativ analyse ble utført med Antall One-programvaren (Biorad).
CRE-SEAP reporter gen analysen
trans ble vurdert av Mercury ™ Pathway Profilering reporter gen analysen system fra Clontech Inc. bruker sekretorisk alkalisk fosfatase (SEAP) under kontroll av definerte cis-regulerende responselementer (CRE) som reporter, i det vesentlige som tidligere beskrevet [20], [21]. I korte trekk ble cellene transfektert med en pcre-SEAP-konstruksjoner eller tomme vektorer. SEAP-aktivitet i mediet ble bestemt ved AttoPhos® system fra Promega (Mannheim, Tyskland) og normalisert til transfeksjon kontroll (ß-galaktosidase).
LDH-frigivelse
LDH-aktivitet i mediet og i cellelysatene ble målt ved hjelp av standard protokoll [22] tilpasset nedre skala (200 mL) i en multiwell leser (Infinite, Tecan, Berlin).
Caspase-3-aktivitet
Celler ble vasket en gang med PBS-buffer (4 ° C) og inkubert med 100 ul cellelyseringsbuffer (10 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 7,5) i 10 minutter på is, høstet, og sentrifugert ved 16000g i 10 minutter ved 4 ° C. 60 ul av supernatanten ble inkubert med 65 ul reaksjonsbuffer (20 mM PIPES, 4 mM EDTA, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, pH 7,4) inneholdende 42 uM DEVD-AFC (sluttkonsentrasjon) ved 37 ° C, og fluorescensen det spaltede produktet, 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC), ble målt ved 400 nm eksitasjon og 505 nm emisjonsbølgelengde ved hjelp av en flerbrønn teller (Infinite, Tecan, Berlin). Spaltede AFC ble kvantifisert ved hjelp av en kalibreringskurve ved anvendelse av kjente AFC-konsentrasjoner. Proteininnholdet ble bestemt med bicinchoninic syre analyse (Interchim, Montluçon, Frankrike) ved anvendelse av bovint serumalbumin som standard.
Bestemmelse av ekstracellulær pH, glukose og laktat
pH-verdien ble målt med en blodgass-analysator (ABL5, Radiometer, København, Danmark). For bestemmelse av konsentrasjonen av glukose, ble glukose (HK) analysesett fra Sigma (G3293) som brukes (2 eller 5 ul prøve, henholdsvis pluss 200 ul kit) i henhold til produsentens instruksjoner. Laktat ble bestemt ved hjelp av laktat reagens (Trinity) i henhold til produsentens instruksjoner (10 ul prøve pluss 100 ul kit). Hvert forsøk ble utført i hvert fall i tre paralleller.
ROS dannelse
Dannelse av reaktive oksygenforbindelser (ROS) ble vurdert med fluorescerende fargestoff DCFDA-AM (Molecular Probes, Leiden, Nederland) som reagerer med en økning i fluorescens i nærvær av H
2o
2 når esterbindingen er blitt spaltet av cellulære esteraser. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater og inkubert i 30 minutter med fargestoff etter de angitte behandlinger. Deretter fluorescens (eksitasjon 485 nm; emisjon 535 nm) ble målt ved anvendelse av en flerbrønn teller (Infinite, Tecan, Berlin, Tyskland). I tillegg tomme verdier uten celler og tomme verdier uten fargestoff ble bestemt og trukket. Økningen i fluorescens i løpet av blindverdien uttrykt pr mg protein ble anvendt som et mål for ROS formasjonen.
Bestemmelse av mitokondriell aktivitet
For å estimere mitokondrielle aktivitet, bestemt vi akkumulering av rodamin 123 etter eksponering til pH 7,4 eller pH 6,6. Etter 3 timers eksponering cellene ble inkubert i 20 minutter med 0,1 pM rhodamin 123 i HEPES-Ringer-løsning, så vel som i nærvær av 20 uM CCCP eller 2 uM nigericin [23], [24]. På slutten cellene ble lysert med 0,1% Triton X-100 og celle fluorescens bestemmes ved hjelp av en multiwell teller (Infinite, Tecan, Berlin). Mitokondriell opptak av rodamin 123 hindres i nærvær av CCCP fordi Ψ
m kollapser. I motsetning til dette, mitokondriell opptak av rodamin 123 er maksimal, i nærvær av nigericin, som kollapser pH-gradient over den indre mitokondrie-membran. Som en konsekvens hele energi fra elektrontransportkjeden blir transformert inn i Ψ
m. Således opptak av rodamin 123, i nærvær av nigericin minus opptak av rodamin 123, i nærvær av CCCP representerer et grovt overslag av mitokondriell aktivitet og eliminerer eventuelle ikke-spesifikke virkninger. Opptak av rhodamine 123 ble kalibrert ved hjelp av lysebuffer som inneholder kjente konsentrasjoner av rhodamine 123.
Material
Hvis ikke annet er oppgitt, kjemikalier var fra Sigma-Aldrich, München, Tyskland.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. For alle forsøkene, er lik N antallet kulturskåler eller celler som anvendes for å utføre målingene hvis ikke annet er oppgitt. Alle forsøkene ble utført med minst to passeringer. Statistisk signifikans ble bestemt av uparet t-test eller ANOVA, som passer. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når P . 0,05
Resultater
Intracellulær pH følgende ekstracellulære acidose
Fig. 1A viser den intracellulære pH-verdien av de forskjellige celletyper. Senking ekstracellulære pH alltid ført til en nedgang i pH
i, om enn graden av denne reduksjonen varierte sterkt mellom cellelinjene. Under kontroll forhold (pH 7,4) intracellulær pH var alltid lavere enn i den ekstracellulære rommet. Men under acidose (pH 6,6) av den intracellulære pH-verdien var høyere i de fleste cellelinjer. Denne omvendte pH-gradient har blitt beskrevet tidligere for solide svulster
in vivo product: [6] indikerer at modellen som brukes i denne studien ligner på
in vivo
situasjonen riktig. Selv om det i CHO og H358 den intracellulære pH-verdien har sunket til under den ekstracellulære pH-verdien er det indikasjoner for en utpreget net proton ekstrudering. Fra termodynamiske betraktninger i celler uten proton ekstrudere (forutsatt en membranpotensialet fra -40 mV) av den intracellulære pH vil være ca. 0,65 enheter lavere i forhold til det ekstracellulære pH. I forsøkene (pH
e 6.6) en pH
i fra ~6.0 kan forventes fra passiv distribusjon. Selvfølgelig, CHO og H358-celler ekstrudere protoner aktivt mot passiv likevekt selv om deres evne synes å være noe mindre enn de andre cellelinjer.
(A) pH
i målt under kontrollbetingelser (pH 7.4 ) og under ekstracellulære acidose (pH 6,6) (N = 3-7). (B) pH-gradienten i AT1-celler under kontroll (pH 7,4) og sure (pH 6.6) forhold for to forskjellige tidspunkter; sirkel: pH
e, firkantet: pH
i
Endringen av den intracellulære pH raskt følger ekstracellulære acidose og var stabil over flere timer.. For eksempel, i AT1 celler intracellulære pH (pH
i) ble hurtig dråpevis fra pH 7,22 ± 0,08 til pH 6,75 ± 0,09 i løpet av 10 minutter (Fig. 1B). Denne pH-endringen ble opprettholdes over 3 timer (Fig. 1B), men reversible når du bytter tilbake til en fysiologisk pH
e (for regulering av pH-homeostase i AT1 cellene se fig. S1). Nedgangen i pH
e under 3 timers inkubasjon resultatene fra den omfattende dannelsen av melkesyre (Warburg effekten, fig. S2).
Acidose-indusert MAPK-aktivering i ulike celletyper
å utsette cellene for å moderere ekstracellulære acidose som fører til en markert aktivering av ERK1 /2 og p38 MAP-kinaser. Fig. 2A viser fosforylering av både kinaser etter inkubering av AT1-celler i tre timer ved en pH-verdi på 6,6. Analysere tidsforløpet viser at fosforylering ble observert allerede etter 5 minutter og varte opp til 3 h (fig. 2B). Effekten på p38-aktivering ble observert i et bredt spekter av forskjellige tumor eller normale vev cellelinjer (Fig. 2C). Disse funnene tyder på at p38 fosforylering av acidose er økt i forskjellige celler uansett om avledet fra tumor eller normalt vev, og pekte på en universell mekanisme for stress-indusert signalering. I motsetning til dette ble acidose-indusert ERK1 /2-aktivering ikke observert i alle celletyper som er undersøkt og er ikke relatert til tumordannelse av cellene (fig. 2C), selv om intracellulære pH-verdien ble redusert i alle cellelinjer. Således, endringer i pH
i synes ikke å være en universell trigger for acidose-indusert ERK1 /2 fosforylering. For både MAPK ingen kvantitativ korrelasjon mellom pH
i eller endringer i intracellulær pH og p38 eller ERK1 /2 fosforylering for de forskjellige celletyper ble observert (fig. S3). Samlet utgjør disse resultatene førte til den konklusjon at bulk intracellulær pH eller endringer i pH
i er ikke de viktige regulatorer for ERK1 /2 fosforylering indusert av ekstracellulære acidose, men fungere som universell trigger for p38 fosforylering. Siden prinsippet mekanismer (intracellulær forsuring, p38 fosforylering) ble observert i AT1-celler ble ytterligere forsøk utført med denne celletype.
(A) typisk western blot for fosforylert og samlet protein av ERK1 /2 og p38 i AT1-celler etter en inkubasjonstid på 3 timer i enten pH 7,4 eller pH 6,6. (B) Tid løpet av acidose indusert ERK1 /2 og p38 fosforylering i AT1 celler. Verdiene er fosforylert protein dividert med total protein, er 180 min HEPES-Ringers pH 7,4 definert som 100%. (N = 3-10). (C) Virkning av sure betingelser for ERK1 /2 og p38 fosforylering presentert som% av kontroll (pH 7,4) i forskjellige cellelinjer. (N = 5-12); (*) P. 0,05
Effekt av acidose på cellelevedyktigheten
For å kunne vurdere ulike mekanismer for celledød proteininnholdet per tallerken (totalt celle levedyktighet), induksjon av apoptose (caspase-3-aktivitet) og nekrose (LDH-release) ble analysert. Acidose per se fremkalte ingen signifikant endring i celleoverlevelse (fig. 3). Likevel, rose når ERK /2 pathway ble inhibert nekrotisk celledød i betydelig grad, noe som fører til et tap av celler. Caspase-3-aktivitet ble ikke berørt, noe som tyder på noen endring av apoptose rate. Inhibering av p38-reaksjonsveien var praktisk talt uten virkning. Disse data indikerer at acidose-indusert ERK1 /2 fosforylering aktiverer en rednings program hindrer nekrotisk celledød. I dag har den komplett sett av eksperimenter i denne serien kun blitt utført på AT1 celler. Av denne grunn er det fortsatt åpne hvorvidt de trinn acidose-indusert ERK1 /2-aktivering, fulgt av nekrose foregår i alle cellelinjer som en generell mekanisme. Siden noen cellelinjer ikke viser en aktivering av ERK1 /2 av acidose (fig. 2C) kan det være mulig at ERK1 /2-avhengighet av cellelevedyktighet på minst kvantitativt forskjellig mellom ulike cellelinjer. Her blir ytterligere forsøk er nødvendig.
(A) Celleproteininnhold, (B) caspase-3-aktivitet (apoptose) og (C) LDH-frigjøring (nekrose) av AT1-celler etter 3 timer inkubering ved forskjellig pH-verdi med eller uten inhibitorer av ERK1 /2 (U0126) eller p38 (SB203580) bane (N = 12-18); (*) P. 0,05
Intracellulær forsuring og p38 fosforylering
Virkningen av intracellulær forsuring under hemming av bikarbonat transport av DIDs og /eller ekstra belastning med laktat på MAPK aktivering var undersøkt. Ved en normal ekstracellulære pH (7,4) enten isoleres hemming av bikarbonat transport (200 uM DIDs) eller inkubering av cellene med laktat (40 mM) resulterte i en temmelig svak surgjøring med 0,1 pH-enheter (Fig. 4A). Imidlertid er kombinasjonen av begge behandlingene senket pH markert med 0,3 enheter. Analysere MAPK-aktivering under disse betingelser viste at sålen inhibering av bikarbonat transport av DIDs eller eksponering av AT1-celler til laktat ved fysiologisk ekstracellulære pH var ikke tilstrekkelig til å endre p38 eller ERK1 /2 fosforylering (Fig. 4B), mest sannsynlig fordi pH
i gjen meget hurtig i nærvær av ekstracellulære laktat (fig. S1B). Samtidig tilsetning av DIDs og laktat resulterte i signifikant økt p38 fosforylering (Fig. 4B). Disse data støtter hypotesen om at flere endringer i intracellulær pH mediere den stimulerende virkningen av ekstracellulært acidose på p38, men ikke på ERK1 /2. ERK1 /2 fosforylering er stimulert av en redusert ekstracellulært pH, men ikke ved redusert intracellulær pH (Fig. 4B).
(A) Langtidseffekter (3 h) av eksponering for DIDs (200 mm) og /eller tilsetning av 40 mM laktat (N = 14-56) på pH
i. pH-endringer sammenlignet med kontrollbetingelser (pH 7,4) (*) p 0,05. (B) Forhold av fosforylert MAPK /total protein som% av kontroll (pH 7,4); N = 3-7 for ekstra fordel; N = 4-9 for fosfor-p38; (*) P. 0,05
Acidose-indusert ERK1 /2 og p38 fosforylering er uavhengig av fosfatase aktivitet, men avhenger av MAPK kinaser MEK1 /2 og MKK3 /6, henholdsvis
Siden økt fosforylering kan enten være et resultat av økt kinase aktivitet eller av redusert fosfatase hastighet virkningen av fosfatase hemning på acidose indusert MAPK aktivering ble studert. Når tyrosine- eller theronine /serin-fosfataser ble inhibert ved anvendelse av enten ortovanadat (100 uM) eller ocadaic syre (100 nM) virkningen av ekstracellulært acidose på ERK1 /2 og p38 fosforylering var additiv (fig. S4). I alle forsøkene pp38 uten fosfatase-inhibitorer ble indusert ved den faktor på 3-4 (fig. S4 og S5) sammenlignes med det man finner i tidligere forsøksserie (fig. 2C). Således er det usannsynlig at effekten av acidose er mediert ved endringer av fosfatase-aktivitet. Et viktig steg i ERK1 /2-aktivering er oppstrøms kinase MEK1 /2, som integrerer de fleste av de signalveier som konvergerer på ERK1 /2 [12]. Når MEK1 /2 ble inhibert med 10 uM U0126, ble grunnlinje fosforylering av ERK1 /2 reduseres betydelig og effekten av acidose ble opphevet (fig. S5). U0126 forhindret acidose-indusert ERK1 /2 fosforylering selv i nærvær av de to fosfatase-inhibitorer ortovanadat og ocadaic syre, noe som indikerer at MEK1 /2 er vesentlig for den effekt som observeres. p38-aktivering ble ikke hemmet av U0126 (fig. S5), men i løpet av 3 timer acidose (pH 6,6) kinase MKK3 /6, som er oppstrøms for p38, ble fosforylert i en pH-avhengig måte (Fig. 5). Til sammen våre data tyder på at acidose indusert effekter på MAPK ikke avhengig av endringer i fosfatase aktivitet, mens MEK1 /2 er avgjørende for ERK1 /2 aktivisering og økt p38 fosforylering skyldes økt aktivitet av MKK3 /6 under sure forhold.
Verdiene angir forholdet mellom fosforylert protein (pp38 eller perk) delt på totalt protein (p38, ERK). Disse verdier er deretter blitt normalisert til forholdet mellom kontrollforsøk ved pH 7,4. (*) P 0,05 versus pH 7,4. (N = 4).
Acidose-indusert MAPK aktivisering er ikke avhengig av EGFR, PKC, PKA, PI3K eller Src-familie kinaser
For å avsløre mulige signalveier som fører fra ekstracellulære acidose til en aktivering av ERK1 /2 og p38, ble flere lovende mål analysert ved å blokkere dem med spesifikke hemmere. Rollen av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), protein kinase C (PKC), proteinkinase A (PKA), fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) og Src-familien av tyrosinkinaser ble studert ved bruk av AG1478, Bisindolylmaleimide I (BIM), Rp-isomer, henholdsvis LY294002 og PP2,. Alle disse kinaser kan spille en viktig rolle i tumorvekst og progresjon. Imidlertid har ingen av inhibitorene viste en signifikant virkning på acidose-indusert ERK1 /2 eller p38-aktivering som vist i fig. S6 og S7, selv om maksimal konsentrasjon ble brukt.
cAMP har en potensiell dobbel effekt på MAPK signaliserer [12], [25]. Aktivering av PKA av cAMP kan føre til inhibering av MEK1 /2 og /eller Raf-1 (C-Raf). Men aktivering av EPAC av cAMP aktiverer B-Raf via Rap1. Anvendelse av membranen permeable analog dibutyryl-cAMP (db-cAMP, cAMP-klemme)
per se
ført til redusert ERK1 /2, men ikke p38 fosforylering (Fig. S7). I tillegg effekten av ekstracellulær acidose ble fullstendig opphevet. Stimulering av endogen cAMP dannelsen av forskolin (aktivator av Adenylyl cyclases) fremkalte en lignende effekt som db-cAMP (Fig. S7). Dermed ERK1 /2, men ikke p38 signal er cAMP-sensitive og effekten er sannsynligvis mediert av PKA muligens via hemming av C-Raf.
OGR1 er ikke avgjørende for MAPK fosforylering i et surt mikromiljø
for å belyse mekanismen av pH-avføling for MAPK-aktivering videre rollen til G-protein-koblede reseptorer, i stand til å avføle ekstracellulære protoner /pH, er blitt undersøkt. Av disse har ovariecancer G-protein-koblet reseptor 1 (OGR1) blitt vist å aktivere MAPK-reaksjonsveien [26]. Det er ingen spesifikke inhibitorer for OGR1 tilgjengelig, men det har vist seg at proton-indusert aktivering av ERK1 /2 av OGR1 blir opphevet ved um kobber-ion-konsentrasjoner. Selv om dette ikke er en spesifikk hemming kan den brukes til å forfalske hypotesen om OGR1 engasjement. I nærvær av 10 pM CuCl
2 en økning i ERK1 /2 og p38 fosforylering ble sett på som ble ytterligere forsterket av ekstracellulære acidose (fig. S8A). Dermed OGR1 betyr mest sannsynlig ikke megle effekten av ekstracellulære acidose på MAPK signal
En rolle for Na
+ /K
+ -.? ATPase i acidose indusert ERK1 /2 aktivisering
en annen mulig mekanisme for pH- «avføle» ville være den Na
+ /K
+ – ATPase, et enzym som hemmes av acidose og kan indusere MAPK-aktivering enten via endringer i cellulær homeostase eller elektrolytt ved å signalisere via EGFR [27], [28]. Fig. S8 viser at acidose indusert hemming av Na
+ /K
+ – ATPase kan bidra til ERK1 /2 fosforylering i AT1 celler. Men siden cellevolumendringer som er en del av signalkaskade [29] var ganske heterogene for de ulike cellelinjer, argumenterer mot en avgjørende rolle for acidose indusert ERK1 /2 fosforylering.
Effekt av ROS i acidose indusert MAPK aktivering
Siden reaktive oksygenforbindelser (ROS) kan fungere som et intracellulært signalmolekyl [30], vi analysert om ROS produksjonsendringer i løpet av ekstracellulære acidose. Utsette celler til ekstracellulært acidose indusert ROS dannelse (Fig. 6A). For å skille mellom virkningene av ekstra- og intracellulære forsuring cellene ble ytterligere inkubert med laktat og DIDs ved normal ekstracellulære pH der kombinasjonen av begge stoffene hadde den sterkeste virkning på den intracellulære pH (fig. 4A) og fremkalte en signifikant økning i ROS dannelse (fig. 6B). Scavenging ROS med Tiron redusert ROS nivå under kontroll tilstand (pH 7,4), så vel som i løpet av acidose (fig. 6A og B). DPI (diphenyleneiodonium klorid), en hemmer av flavoproteins, for eksempel NO syntase eller NADPH oksidase, ikke redusere ROS formasjon.
(A) ROS formasjon under ekstracellulære acidose med anvendelse av ROS åtseletere Tiron, DPI eller rotenon (N = 9-12). (A) ROS formasjon (målt ved DCF-DA fluorescens) i løpet av intracellulær acidose (indusert av laktat + DIDs, se figur 4A.) Med anvendelse av ROS-scavengers Tiron, DPI eller rotenon (N = 3). (C) Relativ mitokondriell aktivitet (målt ved hjelp av rhodamin 123 opphopning) ved kontrollbetingelser (pH 7,4) og i løpet av ekstracellulære acidose (pH 6,6); N = 12. (*) p. 0,05
I nærvær av rotenon, en hemmer av mitokondrie-komplekset Jeg ble ROS dannelse forbedret under sure men ikke under kontroll forhold (figur 6A og B. ), stimulerer dvs. acidose rotenon-indusert ROS formasjon. Disse resultatene har blitt bekreftet ved hjelp av mitokondriene spesifikke fluorescens probe MitoSox. Med denne sonden mitokondriell ROS dannelse økes i nærvær av rotenon til 236 ± 44% ved pH 7,4, men til 903 ± 219% ved pH 6,6 (n = 6; p 0,05) som bekrefter en sterk innvirkning av sur pH-verdi på ROS-produksjon i mitokondriene . Disse data utelukker mitokondrielle elektrontransportsystem revers som en kilde til ROS men er indikativ for en øket NADH /NAD
+ forhold som utløser [31]. Kompleks I bringer superoksid anion, i nærvær av NADH og denne generasjonen forsterkes av rotenon og ΔpH tvers av mitokondriemembranen. En grov aktivering av mitokondriell aktivitet kunne ikke påvises (Fig. 6C).
I oppstartsfasen cellene med H
2o
2, en relativt stabil ROS molekyl, førte til en doseavhengig aktivering fortrinnsvis av p38 MAP kinase (fig. 7B). ERK1 /2 fosforylering ble også økt. Inkubering av cellene med Tiron som er i stand til markert å redusere ROS formasjonen (fig. 6A og B) hemmet både p38 og ERK1 /2-aktivering (fig. 7A og B), som viser at ROS-dannelsen er på oppstrømsiden av MAPK-fosforylering.
