Abstract
Mål
Vi har søkt å undersøke ulike molekylære undergrupper definert av genomisk ustabilitet som kan være relatert til tidlig død og tilbakefall i tykktarmskreft.
Metoder
Vi har søkt å undersøke ulike molekylære undergrupper definert av ustabilitet på mikro (MSI), endringer i metylering mønstre (CpG island methylator fenotype, CIMP) eller kopiantall variasjon (CNV) i 8 gener. Stage II-III tykktarm kreft (n = 64) ble undersøkt ved metylering spesifikke multiplex ligert probe forsterkning (MS-MLPA). Korrelasjon av CNV, CIMP og MSI, med mutasjoner i KRAS og BRAFV600E ble vurdert for overlapping i molekylære undergrupper og tidlig tilbakefall risiko ved uni- og multivariate regresjon.
Resultater
CIMP fenotype skjedde i 34% (22/64) og MSI i 27% (16/60) av svulstene, med noterte CIMP /MSI overlapping. Blant de molekylære subtyper, en høy CNV fenotype hadde en tilhørende odds-ratio (OR) for tilbakefall av 3,2 (95% CI 1,1 til 9,3, p = 0,026). Tap av CACNA1G (OR 2,9, 95% KI 1,4 til 6,0; p = 0,001), IGF2 (OR på 4,3, 95% KI 1,1 til 15,8; P = 0,007), CDKN2A (p16) (OR 2,0, 95% KI 01.01 til 03.06; P = 0,024), og RUNX3 (OR 3.4, 95% CI 1.3 til 8.7; P = 0,002) var assosiert med tidlig tilbakefall, mens MSI, CIMP, KRAS eller BRAF V600E mutasjoner ikke var. Den CNV var signifikant høyere hos avdøde pasienter (CNV i 6 av 8) sammenlignet med de overlevende (CNV i 3 av 8). Bare scenen og tap av RUNX3 og CDKN2A var betydelig i multivariabel risikomodell for tidlig tilbakefall.
Konklusjoner
En høykopiantall variasjon fenotype er en sterk prediktor for tidlig tilbakefall og død, og kan tyde på en doseavhengig forhold mellom genetisk ustabilitet og utfall. Tap av tumor suppressors RUNX3 og CDKN2A var relatert til tilbakefall-risiko og garanterer videre etterforskning
Citation. Berg M, Nordgaard O, Kørner H, Oltedal S, Smaaland R, Søreide JA, et al. (2015) Molecular Subtyper i Stage II-III Colon Cancer Definert av Genomisk Ustabilitet: Tidlig Tilbakefall risiko forbundet med en høy Copy-Number Variasjon og Tap av
RUNX3 Hotell og
CDKN2A
. PLoS ONE 10 (4): e0122391. doi: 10,1371 /journal.pone.0122391
Academic Redaktør: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE, FRANCE
mottatt: 13 oktober 2014; Godkjent: 20 februar 2015; Publisert: 16 april 2015
Copyright: © 2015 Berg et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert delvis med tilskudd fra Folke Hermansens Cancer Foundation (tilskudd # 424508 til KS for MB som postdoktor, http: //www.folke-fondet.org/Folke_Hermansen.html) og Mjaaland Cancer Research Fund (tilskudd # 424506 til KS)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en stor global helsebelastning, og utvikler gjennom oppbygging av genetiske og epigenetiske forandringer [1-3]. Genetisk ustabilitet driver prosessen fra neoplastisk formasjon til invasiv vekst og utvikling av metastaser. Dermed identifisere spesifikke molekylære endringer og deres forhold til kliniske endepunkter (sykdom fremskritt, tilbakefall eller død) kan gi bedre forståelse av sykdomsprosessen. I CRC, har tre fenotypisk ulike undergrupper er definert gjennom ustabilitet i kromosomer, mikrosatellitter eller epigenetiske forandringer [3-5].
Kopier nummer variasjon (CNV) refererer til strukturelle og numeriske endringer på kromosomnivå, mens mikro ustabilitet (MSI) oppstår når gjentatte basepar-enhetene har forskjellige antall repetisjoner i tumorceller sammenlignet med korresponderende normale celler som kan produsere et skift i leseramme med DNA. Siste er CpG island methylator fenotype (CIMP), som betegner en avvikende metylering spekteret av DNA (hypo- eller hypermethylation) som endrer genuttrykket uten direkte å involvere genetiske modifikasjoner [6-8].
Genetiske endringer kan bære store strukturelle avvik på kromosomnivå, og /eller numeriske endringer på kritiske områder som kan resultere i tumor fremme genuttrykk. For de fleste kreftformer, er omfattende kromosom ustabiliteter (CIN) observert enten som hel kromosom kopiantall endring gjennom gevinster og /eller tap av kromosom regioner, eller som strukturendringene skaper fusjonsgener [9-11]. I motsetning til kromosom og mikro endringer eller DNA mutasjoner, ikke epigenetisk endring ikke endre DNA i seg selv, men innebærer kjemiske modifikasjoner av DNA som metylering og histonmodifikasjonene [12]. Genuttrykk reguleres gjennom ulike mekanismer, inkludert CpG-øy metylering, der økt metylering på cytosines i CPG områder reduserer genuttrykk.
Historisk MSI og CNV (CIN) ble betraktet som gjensidig utelukkende. Men mer nylig en overlapping mellom de nevnte fenotyper har blitt vist [13]. Videre synes CIMP fenotype for å være assosiert med MSI fenotype, men en kombinasjon av alle fenotyper herunder «triple negative» er blitt rapportert [5]. MSI og BRAF mutasjonsstatus er hovedsakelig observert i de samme prøvene, og begge er foreslått å være klinisk relevant [14,15]. Pasienter med svulster i MSI typen er forbundet med spesifikke kliniske, molekylære og histopatologiske funksjoner [4,16-19], og har en bedre prognose enn pasienter med CNV svulster [20]. Videre er den spesielle tumoren sted langs kolorektal kontinuum forbundet med stedsspesifikke forskjeller i den genetiske sammensetning av tumorer. For eksempel, rektalkreft er mer utsatt for CNV typen endres og coloncancere (spesielt den nære del) er mer utsatt for MSI fenotypen [17]. Undersøkelse av nåværende iscenesettelse av CRC, som i stor grad basert på lymfeknute status [21], har anerkjent mangler og avvik som er debattert [22]. Følgelig flere etterforskere foreslå alternative molekylære staging strategier [5,23-26], der grupper er basert på tilstedeværelse av CIMP, MSI, KRAS og BRAF-mutasjoner. Selv om dette har ennå ikke nådd klinisk praksis, forestillingen om at sub-områder innenfor tykktarmen kan havnen molekylære forskjeller relatert til forskjellige egenskaper er av betydning [17]. Tidligere har vi vist at lymfeknute tallene kan være avhengig av sub site sted og deres relaterte molekylære endringer, som kan være relatert til klinisk utfall [19,27]. Dermed videre utforskning av de genomiske forskjeller i node-negative og lymfeknutepositiv tykktarmskreft er av interesse å øke forståelsen av CRC og relatert sykdom atferd.
Kopier nummer varianter (CNVs) er anerkjent som en viktig type genetisk variasjon som endrer menneske fenotyper [28,29], inkludert kreft hos mennesker. Multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) er en stadig mer vanlig brukt teknikk for å bestemme relativ DNA sekvens dosering (eller kopiere nummer variasjon) [29]. MLPA er en multipleks PCR-analyse som benytter opp til 40 sonder som hver er spesifikke for en forskjellig DNA-sekvens (hovedsakelig eksoner av et spesifikt gen av interesse), for å evaluere den relative kopiantallet av hver DNA-sekvens [29]. MLPA kan også brukes for metylering status besluttsomhet, kopiere nummer analyse i segmentvis duplisert regioner, uttrykk profilering og transgen genotyping. MLPA er et kostnadseffektivt alternativ enn mer arbeidskrevende og kostbare metoder, for eksempel rekke komparativ genomisk hybridisering (aCGH) [29,30]. Videre MLPA muliggjør samtidig undersøkelse av metylering status og CNV i tumorer, slik som tidligere rapportert i retinoblastom [31].
Dermed er målet med denne studien var å undersøke forekomsten av molekylære undergrupper i stadium II og III tykktarmskreftpasienter som bruker MLPA å bestemme metylering mønster og CNVs i et definert probe sett, og å vurdere sitt forhold til aggressiv sykdom atferd, definert som tidlig tilbakefall ( 3 år) etter operasjonen
Materialer og. metoder
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
studiet kohorten er avledet fra en rekke av 213 stadium i-III kirurgisk behandlet tykktarm kreft ved Stavanger universitetssjukehus i løpet av en fire års periode, med detaljer som beskrevet tidligere [ ,,,0],32]. Studien ble godkjent av regional etisk komité (# 197,04) og alle pasienter ga informert samtykke før inkludering. Alle pasientene ble operert med kurativ hensikt. Pasienter med lymfeknute positive (pN +) stadium III sykdom som var fysiologisk tilpasning (for eksempel ECOG funksjonsstatus 0-1), ble tilbudt adjuvant behandling i henhold til nasjonale retningslinjer på det tidspunktet.
For det aktuelle prosjektet, et under -cohort av pasienter med tykktarmskreft stadium II og III ble rekruttert. Pasienter som hadde enten en oppfølging på minst 36 måneder på tidspunktet for valget (= 3 år, da 90% av tilbakefall forekommer), eller som hadde dødd av CRC ved oppstart av det aktuelle prosjektet var kvalifisert. Totalt 64 pasienter oppfylte disse kriteriene, og ble tatt med for MLPA analyse.
Følg opp ble utført ved hjelp av 11-sifret personnummer og tilgang til elektroniske pasientfiler for noen tegn til tilbakevendende sykdom eller en kritisk hendelse relatert til tykktarmskreft. Utvalget var basert på informasjon tilgjengelig på 3 år følge opp, noe som utelukker enhver pasient med kortere oppfølging ved begynnelsen av undersøkelsen. Gjentagelse ble definert som enhver lokoregional eller systemisk tilbakefall av sykdommen på tidspunktet for oppfølging.
DNA ekstraksjon
DNA fra de 64 pasienter tumorprøver ble ekstrahert og isolert fra friskt frosset vev ved hjelp av DNeasy Mini kit eller AllPrep DNA . RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), som beskrevet tidligere [33]
multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA)
multiplex ligation avhengige sondere forsterkning prosedyre, ved hjelp av SALSA MS-MLPA kit ME042-B1 CIMP probe mix (for å påvise metylering status i promotorområdene av 8 forskjellige gener, RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 og CACNA1G) som gitt i Tabell 1, ble utført i henhold til leverandørenes anbefalinger (MRC-Holland, Amsterdam, Nederland), og som tidligere beskrevet [34]. Som aktiverende mutasjon av BRAF
V600E er tett forbundet med CIMP positivitet [35], en mutasjon spesifikk probe er inkludert i SALSA MS-MLPA kit som påviser V600E (1799T A) somatisk mutasjon dersom dette er til stede i prøven.
fra alle 64 DNA-prøvene, 100 ng DNA ble varme-denaturert i et totalt volum på 5 ul Tris-EDTA-buffer, og videre utført som anbefalt av leverandøren. Kort sagt ble en blanding av probe-blanding (ME042, MRC-Holland, Amsterdam, Nederland) og buffer tilsettes til det denaturerte DNA og prober ble tillatt å hybridisere til DNA ved 60 ° C i 16 timer. Hver prøve ble delt i to rør: hvorav den ene ble ligert, mens den andre ble ligert og deretter spaltet ved hjelp av metylering følsomme restriksjonsenzym
HhaI
. Begge reaksjoner ble deretter utsatt for en PCR-reaksjon ved bruk av en termosykler (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og fragmentanalyse utført på en kapillar-sequencer (ABI 3130
xl
, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
ekstraherte DNA fra normal tykktarmsslimhinne ble anvendt som en normal referanse (n = 12 prøver). I tillegg ble de kolorektal kreft kommersielle cellelinjer Caco-2 og HT-29 brukes som kreft kontroller (se saksdokumenter, S1 datafil, og S1 og S2 figurene).
De rådata fra analysen var analysert ved hjelp Coffalyser.NET (beta-versjon, MRC-Holland, Amsterdam, Nederland).
Definisjoner
CIMP.
Kriterier for scoring av CIMP fenotype var mer enn 20 % metylering av minst en tredjedel av sondene i løpet av minst tre av de fem genene i Weisenberger panelet [35], som tidligere beskrevet [34].
CNV.
for CNV fenotype score, ble alle åtte gener undersøkt brukt. Kopier nummer variasjon (CNV) ble brukt som en proxy for kromosom ustabilitet (CIN) i studien. Tap og gevinst ble definert ved hjelp av relative forholdet mellom prøven vs referanse for en sonde var mindre enn 0,7, eller høyere enn 1,3, henholdsvis. For region analyse ble aberrasjon i en eller flere sonder som definert CNV av regionen, og en høy CNV fenotype hvis fem eller flere av de åtte regioner (1p36.11, 3p22.2, 5q31.1, 9p21.3, 11p15. 5, 15q24.2, 16p13.13 og 17q21.33) var avvikende.
MSI.
MSI fenotype ble undersøkt basert på Bethesda panel av gener ved hjelp av fragment analyse, som tidligere beskrevet [36]. Videre ble metylering status for MLH1-genet ved hjelp av MLPA brukes til å korrelere metylering status i forhold til MSI. I det følgende refererer MSI status til resultatene fra Bethesda panel, mens MLH1 forsket av MLPA metoden omtales som MLH1 metylering.
mutasjonsanalyser
KRAS mutasjonsanalyser ble utført som tidligere beskrevet i [37]. BRAF mutasjonsstatus ble fastsatt basert på to ulike metoder. En, MLPA metoden [34], karakterisert ved at BRAF mutasjoner spesifikk probe genereres et signal hvis V600E mutasjon var til stede, og; andre, ved hjelp av konvensjonell PCR og sekvensering analyse, som beskrevet tidligere [38].
Etikk
Etisk godkjenning for studien ble innhentet fra Regional etisk komité, og alle pasienter samtykket til inkludering i studien, som tidligere beskrevet [19].
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av
Statistiske Package for Social Sciences
(IBM SPSS v. 20). Beskrivende data presenteres som tall og priser (%) eller median med interkvartilt områder (IQR), hvis ikke annet er angitt. Mann-Whitney U-test ble brukt for å sammenligne kontinuerlige data mellom gruppene når data ikke har en normalfordeling. Fishers eksakte test ble brukt for 2×2 tabeller for å sammenligne kategoriske data, og odds ratio (OR) presenteres med 95% konfidensintervall (95% KI) for vesentlige risikofaktorer. En multippel logistisk regresjonsanalyse med både fyll og forovermodellering ble utført for å evaluere uavhengige risikofaktorer for tidlig tilbakefall (ja /nei) som en dikotom variabel. Kjønn og alder ble inkludert i modellen, og modellene ble kontrollert for CIMP, CNV og MSI samt KRAS, BRAF mutasjonsstatus. Vesentlige faktorer som finnes på univariate risiko-analyser ble inkludert i prognosemodellen. En Hosmer-Lemeshow godhet-of-fit testen ble utført for å indikere stabilitet av modellen [39], og bidrag til modellen variasjon evaluert av R-kvadrat statistikk for logistisk regresjonsanalyse. Alle testene var tosidig og en P 0,050 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Klinisk informasjon om tilbakefall og overlevelse
Av de 64 pasienter, 58% var kvinner. og median alder var 76 år på tidspunktet for kirurgi. Clinicopathological og molekylære data for de inkluderte pasientene er vist i tabell ble observert 2. Tidlig tilbakefall hos 26 pasienter (41%), hvorav 16 hadde systemisk tilbakefall, 7 hadde lokoregionalt tilbakefall, og tre hadde både lokoregionalt og systemiske tilbakefall . Blant de 26 pasienter med residiverende sykdom, 15 (58%) hadde dødd av sykdommen (23% av studiekohorten) på tidspunktet for undersøkelsen inkludering. Som forventet, 66% av fase III (node positiv) pasienter opplevde tilbakefall sammenlignet med 23% i stadium II, for en OR på 6,9 (95% KI 2,2 til 21,3; p 0,001).
mikro ustabilitet og mutasjons data
MLPA analyser fra tumorprøver var teknisk vellykket i alt 64 inkluderte pasienter, med hensyn til metylering analysen, kromosomanalyse, og BRAF
V600E mutasjon analyse. I tillegg KRAS mutasjon analysene var vellykket for alle 64 pasienter, og 60 (94%) hadde en vellykket MSI status.
Frekvensen av mutasjoner i KRAS, BRAF
V600E og tilstedeværelse av MSI per antall denaturert gener eller per antall kromosomavvik er presentert i figur 1A og 1B, henholdsvis.
(A) Fordeling vs antall denaturert gener (ingen hadde metylering i alle genene, og dermed åtte vises ikke). (B) Fordeling vs antall gener med kromosomavvik
MSI ble funnet i 16 (27%) av prøvene. Metylering av MLH1 ble påvist i 17 (28%) prøver, og metylering av MLH1 og MSI ble samtidig observert i 14 (23%) av pasientene (p 0,001, Fishers eksakte test). MSI og CIMP fenotype, samt BRAF
V600E mutasjon, og MLH1 metylering var signifikant statistisk forbundet med høyresidig tumor plassering (p 0,01, s 0,01, s 0,01 og p = 0,01 for MSI, CIMP , BRAF
V600E og MLH1 meth, henholdsvis ved hjelp av Fishers eksakte test)
median antall denaturert gener varierte betydelig mellom MSI og MSS (mikro stabil) prøver, (7 og 2, henholdsvis. p p 0,01), større svulst størrelse og mindre enn 5 cm (3 og 2, p = 0,04), og mannlige og kvinnelige kjønns (2 og 4; p = 0,03)
BRAF
V600E mutasjon ble observert i 15 (23%) prøver, 11 innenfor MSI gruppen, noe som indikerer en betydelig samvariasjon mellom de to avvik, (p. 0,01). Videre BRAF
V600E mutasjoner var signifikant assosiert kvinnelige kjønn (p = 0,02), metylering av MLH1 (p 0,01), og CIMP fenotype (p 0,01). BRAF resultater ble validert ved å demonstrere BRAF-vekt i det hele tatt (n = 12) og normale prøver i Caco-2-cellelinjen, men med BRAF
V600E mutasjon er tilstede i HT-29 cellelinjen, som forventet.
Mutasjoner i KRAS ble påvist i 20 prøver (33%), hvorav åtte prøvene var negative for CNV, CIMP og MSI. Mutasjoner i både KRAS og BRAF coexisted i to prøver, og i tre tilfeller KRAS mutasjon og MSI ble samtidig observert.
Genome kompleksitet
Prøvene ble kategorisert for alle fenotyper, og gruppert basert på deres kombinerte molekylære fenotyper. Overlapping mellom alle fenotypiske undergrupper ble observert. De kombinerte tumor fenotyper for alle pasienter avdødes og leve er presentert i tabell 3 og figur 1A og 1B og Figur 2A-2C, respektive.
(A) Den totale studiepopulasjonen (B) Pasienter i live uten gjentakelse (overlevende for 3 år), (C) Pasienter med tidlig tilbakefall eller død (innen 3 år etter operasjonen)
Sammenligning frekvenser av kombinerte fenotyper viste statistisk signifikant forskjell for den. overlevende gruppen sammenlignet med den avdøde (p = 0,037, binær logistisk regresjon). Av notatet, trippel negative og den eneste CNV fenotype var forskjellig mellom de avdøde pasienter og de overlevende: 13% vs 41% og 40% vs 18%, henholdsvis (figur 2B og 2C). Isolert MSI og CNV side om side i bare en prøve (2%), mens 4 andre pasienter hadde også CIMP (trippel positiv, 6%). MSI og CIMP var til stede i de samme prøvene i 10 (16%) tilfeller, mens CIMP og CNV ble observert i fem (8%) prøver. MSI og CIMP fenotyper oftest presentert i kombinasjon med andre fenotyper, og henholdsvis som den eneste fenotypen for bare én (2%) og to (3%) tilfellene. I motsetning til dette CNV fenotype eksisterte som eneste fenotypen til 15 (23%) av prøvene.
Blant de ulike fenotyper, trippel positive og negative trippel ble de to grupper viser færrest tilbakefall, 0 /4 (0%) og 4/22 (18%), henholdsvis. For de andre fenotypiske grupper, tilbakefallene varierte 40-100%. Videre ble hyppigheten av trippel negativer i pasientgruppen uten tilbakefall (18/35) funnet å være signifikant forskjellig fra tilbakefall gruppen (4/25), p = 0,007.
Avvik og risiko for tidlig tilbakefall
i CIMP fenotype, en statistisk signifikant sammenheng ble observert med kvinnelige kjønns (p = 0,001), høyresidig plassering av svulsten (p = 0,001), og i tumorer som viser MSI fenotypen (p 0,01 ).
Den høye CNV fenotypen ble observert i 25 (39%) av 64 prøver, og er assosiert med tilbakevendende sykdom. Høy CNV fenotype ble funnet i 14 av 25 (56%) gjentagelse, men bare 11 av 39 (28%) av dem i live, for en tilhørende odds-forhold på 3,2 (95% CI 1,1 til 9,3, p = 0,026)
Statistisk signifikans ble også observert i antall kromosomer avvikende gener mellom avdøde pasienter og overlevende (CNV median 6, IQR 3-7 vs CNV median 3, IQR 1-5; p = 0,001)., fig 2A
det var flere avvik i tidlig tilbakefall gruppe samlet ved separat sammenligner antall avvikende prober for hvert gen mellom pasienter uten tilbakefall og de med tidlig tilbakefall, fig 3. forskjellen i antall avvikende posisjoner mellom overlevende og døde for CDKN2A, IGF2 og CACNA1G var statistisk signifikant, fig 4B. Når du bruker dikotomisert status (avvikende /normal) for hvert gen, avvik i CACNA1G (p = 0,007), CDKN2A (p = 0,003) og RUNX3 (p = 0,032) var signifikant assosiert med sykdom relatert død.
(A) Boksplott som viser antall avvikende gener i avdøde pasienter (høyre) og overlevende (til venstre). (B) Boksplott som viser antall avvikende kromosom posisjoner i hver av genene studert, i tilbakevendende (eller døde) pasienter (til høyre) og pasienter med ingen tidlig tilbakefall (til venstre).
Røde barer representerer tapte regioner og blå søylene representerer gevinster. Linjer som illustrerer gevinster og tap i pasienter i live 3 år (blå og lilla, henholdsvis), og pasienter døde av sykdom (grønn og rød, henholdsvis)
Mer spesifikt, tap av CACNA1G dratt en OR på 2,9 (95% CI 1,4 til 6,0, p = 0,001) for tilbakefall, som 18 av 30 (60%) av pasientene med dette CNV dukket opp igjen i forhold til bare 7 av 34 (21%) med normal status. Tap av IGF2 var forbundet med en ELLER på 4,3 (95% CI 1,1 til 15,8; p = 0,007), som 23 av 47 (49%) dukket opp igjen, sammenlignet med to av 17 (12%) med normal status. Tap av CDKN2A hadde en ELLER på 2,0 (95% CI 1,1 til 3,6, p = 0,024), med 61% tilbakefall for de med tap, sammenlignet med 30% for de med normal status. Til slutt, tap av RUNX3 var forbundet med en OR på 3,4 (95% CI 1.3 til 8.7; P = 0,002). Med tilbakefall forekommer hos 64% med tap mot 16% av de med normal status
Det var ingen signifikant forskjell mellom trinn II og III med hensyn til hyppigheten av de tre forskjellige molekyl fenotyper (MSI, CNV og CIMP), og de kombinerte fenotyper, samt BRAF og KRAS mutasjoner. Inaktivering av CACNA1G grunn av metylering ble observert oftest i BRAF mutert og MSI tumorer (p≤0.01), og som oftest i tumorer som befinner seg i den proksimale kolon.
multivariabel modellering av tidlig-tilbakefall risiko
i en multippel logistisk regresjonsmodell med variablene CNV, CIMP, MSI, KRAS, BRAF, scene, tumor lokalisering og kjønns, den eneste variabelen som ble beholdt i modellen for tilbakefall risikoen var scenen. Analysere kreft-dødsfall som et utfall ved hjelp av de samme variablene, ble CNV status inkludert sammen med scene i modellen, men med brede konfidensintervall for de justerte ORS.
Vi introduserer de uavhengige genet avvik signifikant assosiert med tidlig tilbakefall risiko (tap av RUNX3, CDKNA2A, CACNA1G og IGF2) og kontrollerende for de ovennevnte molekylære subtyper og alder, kjønn, scene og svulst plassering, avslørte en endelig modell som inkluderte bare RUNX3 og CDKN2A sammen med scenen som predikator for tidlig tilbakefall (tabell 4 ). En Hosmer-Lemeshow egnethetstest (Chi-kvadrat 3,844; p = 0,572) indikerte en robust modell. R-kvadrat statistikk (Cox Snell og Nagelkerke) ble rapportert mellom 0,316 og 0,427, noe som indikerer at modellen forklarte mellom 31,6% og 42,7% av variasjonen i estimering av risiko
Diskusjon
.
i denne studien undersøkte vi samhandling og overlapping mellom molekylære undergrupper i tykktarmskreft med utvikling av tidlig tilbakefall etter operasjonen. Som beskrevet, det er overlapping mellom flere molekylære egenskaper som kompliserer klart skille mellom gruppene for molekylær og klinisk relevans. Ved hjelp av MLPA for et panel bestående av 8-gener, demonstrerte vi at genet doseringseffekten av metylering og kromosomale avvik er delvis forbundet med molekylært signatur og nærværet av mutasjoner, og er også relatert til risikoen for tidlig tilbakefall. I tillegg til fase III, var tidlig tilbakefall forbundet med tap av RUNX3 og CDKN2A, som begge er kjente tumorsuppressorgener i CRC og som tidligere er rapportert å være assosiert med klinisk resultat i CRC [40-43]. Dette kan potensielt benyttes som prognostisk informasjon i tillegg til dagens TNM-staging system for å unngå feilklassifisering, som lymfeknute status (definisjon av node negativ eller positiv sykdom) har flere ulemper, som har vært diskutert i detalj andre steder [21,22] . Også definere pasienter med risiko for tidlig tilbakefall kan lette målrettet og bedre tilpasset overvåking etter operasjonen [44].
For tykktarmskreft, er tre brede molekylære fenotyper beskrevet, inkludert CNV, MSI og epigenetiske forandringer [3,7 , 8]. Forskere har foreslått forskjellig klassifisering av 3, 4 og 5 grupper i det siste [14,24-26], men ingen har ennå ikke nådd klinisk praksis. Omfanget av overlapping mellom disse fenotypiske gruppene har blitt [5,14,16,25,45-47] undersøkt, men de kliniske implikasjonene av de molekylære fenotyper er så langt uklart. Bruken av forskjellig metodikk, definisjoner, scoring kriterier, og forskjeller i type pasientmaterialet undersøkt foreta sammenligninger vanskelige, noe som understrekes av overlapp funnet i denne studien. I tillegg, og som vi har dokumentert nylig, bruk av ulike kriterier for CIMP-status kan avviker med bruk av inkluderte gener og prober [34], og således genererer forskjellige resultater mellom undersøkelser, som hindrer sammenligning.
totalt ble MSI observert hos 27% av tykktarm kreft. Dette er i tråd med andre studier hvor endetarms kreft ikke er inkludert, som tykktarm kreft har en høyere forekomst av MSI. Både MSI fenotype og MLH1 metylering ble funnet i 14/60 prøver (23%). To prøver viste MSI fenotype uten MLH1 metylering, og tre prøver viste MLH1 metylering uten MSI. Den omfattende overlapping mellom disse funksjonene støtter det faktum at MLH1 inaktivering årsaker MSI. Imidlertid har et avvik i MLH1 metylering og MSI også blitt observert av andre [48,49], og illustrerer at flere DNA mismatch-reparasjonsgener inkludert MLH1 årsaken MSI. Tvert imot, betyr metylering av MLH1 ikke nødvendigvis føre til svekkelse av mismatch reparasjon av veier.
BRAF
V600E mutasjon status ble spådd å bruke både konvensjonell DNA-sekvensering og MLPA med spesifikke prober for punktmutasjon. Begge resultatene var i 100% samstemmighet, og viser MLPA metodikk for å være pålitelige.
Mutasjoner i BRAF
V600E og KRAS ble opprinnelig rapportert som gjensidig utelukkende [50]. En dobbel aktivering av MAPK-reaksjonsveien er blitt foreslått for å lede til differensiering og cellealdring, i stedet for å fremme veksten som er resultatet av en enkelt mutasjon [51]. Men for to pasienter i vårt utvalg serien, ble mutasjoner funnet å eksistere, om enn med tall for lave til å tillate noen klinisk tolkning.
Pasienter med tidlig tilbakefall viste tallmessig mer kromosomavvik (Fig 3 og 4) . Dette støtter forslaget om at CNV kunne forutsi en dårligere prognose [52], som angitt av et høyt CNV i denne studien. For stadium II pasienter, den numeriske forskjellen i kromosomavvik mellom tilbakefall og ingen gjentakelse var statistisk signifikant (p = 0,022), som var den numeriske forskjell for avdøde eller gjenlevende pasienter (p = 0,007). Denne forskjellen kan ikke observeres for stadium III pasienter. Som stadium II pasienter er vanligvis behandles med kirurgi alene, kan dette brukes som en prognostisk markør for tilbakefall, og potensielt som et hjelpemiddel når du velger scene II pasienter som vil ha nytte av adjuvant behandling. Imidlertid bør resultatene tolkes med forsiktighet basert på utvalgsstørrelsen og validert i større pasient serien å bli bekreftet.
En interessant observasjon er at kromosomavvik, snarere enn metylering selv, av gener som inngår i CIMP panel synes å være de viktigste for klinisk resultat av sykdom. Dette innebærer at genene i CIMP panelet har tumor suppressor aktivitet, og at deres mekanistisk funksjon er viktig med hensyn til tykktarmskreft, og ikke bare for metylering. Faktisk er både RUNX3 og CDKN2A (også kalt p16) kjent tumorsuppressorgener. Avvik i RUNX3 har blitt rapportert som en tidlig hendelse i kolorektal kreft progresjon [40]. Den normale aktiviteten i CDKN2A (også kjent som p16) genet er som en svulst suppressor, hindre ukontrollert celleproliferasjon ved å initiere cellesyklus og apoptose. Den prognostiske betydningen av CDKN2A inaktivering i kolorektal kreft har vært studert, men ingen klare assosiasjoner har blitt funnet [43]. Videre normal funksjon av CACNA1G påvirker celleproliferasjon og apoptose, og forstyrrer dette kalsiumsignalisering kan være viktig i kreft, ettersom disse fremgangs lede videre fremdrift i cellelivet. Dette indikerer sin instrumental betydning, og at formålsløse CACNA1G vil skifte cellene over til en mer aggressiv funksjon [53]. Dessuten er protein hormon IGF2 involvert i utvikling og vekst av cellen, og er involvert i kreftutvikling [54,55].
Når du skal undersøke antall denaturert stillinger, var det betydelig mer metylering i MSI svulster har sammenlignet MSS, og i BRAF muterte prøvene sammenlignet med vill-type. Dette er mest sannsynlig fordi metylering av CRC-kritiske gener forårsaker MSI i ikke-familiær kolorektal kreft [56]. Men antall denaturert stillinger var også statistisk signifikant større i store svulster i forhold til mindre, og i svulster fra kvinner i forhold til menn.
Konklusjoner
Stage II-III tykktarmskreftpasienter som opplever tidlige kreft tilbakefall etter operasjonen hadde signifikant flere kromosomavvik (median seks vs. median på 3 for levende pasienter) enn pasienter uten tegn til sykdom på 3 år oppfølging. Tap av tumorsuppressorgener RUNX3 og CDKN2A (p16) ser ut til å holde viktig klinisk informasjon i tillegg til node-status (stadium III, lymfeknutepositiv sykdom).
