Abstract
progresjon av prostatakreft (PC) til lokalt invasive, androgen-uavhengig og metastatisk sykdomstilstander er vanligvis forbundet med behandling motstand og sykdom tilbakefall. Foreliggende studie ble gjennomført for å etablere muligheten for å bruke en kombinasjon av spesifikke onkogene produkter, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), pakt, nukleær faktor-kappaB (NF-kB) og makrofag-inhiberende cytokin-1 (MIC-1) så biomarkører og terapeutiske mål for å optimalisere behandling av pasienter med lokalisert PC på tidligere sykdomsstadier. Den immunhistokjemiske og immunfluorescens data har vist at uttrykket nivåer av EGFR, Ser
473-pakt, NF-kB P65 og MIC-1-proteinene ble betydelig forbedret i samme undergruppe av 76 tilfeller av prostata adenokarsinom prøver i løpet av sykdomsutviklingen og disse biomarkører ble uttrykt i en liten undergruppe av CD133
+ PC celler og hovedtyngden svulst massen av CD133
– PC-celler. Viktigere, alle for disse markørene ble også overuttrykt i 80-100% av 30 PC prøvene metastase benvev. Videre har resultatene indikerte at EGF-EGFR-signalveien kan gi kritiske funksjoner for selvfornyelse av side befolkningen (SP) celler begavet med stamcelleliknende funksjoner fra svært invasive WPE1-NB26 celler. Av terapeutisk interesse, målretting av EGFR, Pakt, NF-kB eller MIC-1 var også effektiv på å undertrykke basal og EGF-forfremmet prostasphere formasjon ved SP WPE1-NB26 celler, indusere oppløsningen av SP celle-stammer prostaspheres og redusere levedyktigheten av SP og ikke-SP WPE1-NB26 cellefraksjoner. Også målretting av disse onkogene produkter indusert caspase-avhengig apoptose i kjemoresistent SP WPE1-NB26 celler og forbedret sin følsomhet til den cytotoksiske effekten indusert av docetaxel. Disse funnene tyder på at den kombinerte bruk av EGFR, pakt, NF-kB og /eller MIC-1 kan representere lovende strategi for å forbedre nøyaktigheten av aktuelle diagnostiske og prognostiske metodene og effektiviteten til behandlinger av PC-pasienter med tanke på sykdommen heterogeniteten, og hindrer dermed PC progresjon til metastatiske og dødelig sykdom stater
Citation. Mimeault M, Johansson SL, Batra SK (2012) Pathobiological Konsekvenser av Expression av EGFR, Pakt, NF-kB og MIC-1 i Prostate Cancer Stem Cells og deres etterkommere. PLoS ONE 7 (2): e31919. doi: 10,1371 /journal.pone.0031919
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 24 desember 2011; Godkjent: 20 januar 2012; Publisert: 23 februar 2012
Copyright: © 2012 Mimeault et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health stipend (R01CA138791) for prostatakreft forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er fortsatt blant de hyppigst diagnostiserte solide svulster hos menn og metastatiske PC former utgjør fortsatt den nest største årsaken til kreft-dødsfall [1] – [5]. Viktige fremskritt i de senere år har ført til en tidligere diagnose og effektiv terapeutisk intervensjon ved radikal prostatektomi og /eller strålingsterapi for pasienter med lav kvalitet og organ-begrenset PC [1], [4], [6], [7 ]. Sykdomsprogresjon til lokalt avanserte, metastatiske og kastrerings-motstandsdyktig prostatakreft (CRPCs) er assosiert med behandling resistens og sykdommer tilbakefall [1], [4], [6]. Selv om dagens anti-hormonelle og kjemoterapikurer mot svært invasive og metastatisk PCer generelt har bedret livskvalitet, disse behandlinger er kun palliativ og kulminerer i døden av de fleste pasientene etter ca 12-19 måneder etter diagnose [1], [4] [6].
Mange studier har blitt utført for å etablere etiopathological årsakene til PCer. De ytre og indre faktorer predisponerer for PC utvikling inkludere intens oksidativt stress, inflammatoriske atrophies og fibrose i forbindelse med alvorlige vev skader, hormonelle deregulering og mer spesielt med stigende alder [8] – [13]. Initiering og progresjon av PC er generelt kjennetegnet ved en nedregulering av diverse tumorsuppressorgen-produkter, inkludert fosfatase tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) og p53, kombinert med en oppregulering av ekspresjon og /eller aktivitet av en rekke onkogen signaleringselementer i PC-celler [4], [13], [14]. Samspillet av komplekse signal nettverk av forskjellige tumorigen trasé igangsettes av hormoner, vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner gjennom deres beslektede reseptorer er vanligvis involvert i PC progresjon til lokalt fremskreden eller metastatisk sykdom [4], [10], [11], [ ,,,0],13], [15]. Blant de hyppigste deregulerte genprodukter, kan den forbedrede ekspresjon og aktivering av forskjellige reseptor-tyrosinkinaser, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), i løpet av epiteliale-mesenkymale overgangsprosess fører til vedvarende aktivering av mitogenaktiverte proteinkinaser, fosfatidylinositol-3′- -kinase (PI3K) /Akt, nukleær faktor kappa-B (NF-kB) og makrofag-inhiberende cytokin-1 (MIC-1) [4], [13], [14], [16] – [32]. Disse onkogene produktene kan samvirke for å fremme vekst, overlevelse, invasjon og metastasering av PC-celler, så vel som for deres anskaffelse av androgen-uavhengig (AI) og kjemoresistent fenotyper, behandling motstand og tilbakefall av sykdommen [4], [13] – [ ,,,0],16], [18] – [21], [23], [25] – [27], [30] -. [39]
I tillegg har senere akkumulere linjer av eksperimentelle data har også vist at PC stilk /stamceller, også betegnet som PC- og metastase initiere-celler, som uttrykker stamcellelignende markører så som CD133, CD44
høy, aldehyd dehydrogense «ALDH
høy» og /eller CXC kjemokin reseptor 4 kan gi kritiske funksjoner i prostata kreftutvikling, metastaser i fjerne områder og tumor ettervekst og tilbakefall av sykdommen etter behandlingsstart [4], [10], [13], [14], [40] – [58]. Det har vist seg at meget tumorigene PC stilk /progenitorceller var i stand til å gi opphav
in vitro
og
in vivo
til hoveddelen massen av differensierte PC-celler som uttrykker sekretoriske luminal fenotyper, inkludert androgen reseptor og prostatisk sur fosfatase og rekonstituere tumorene
in vivo
med en histologisk arkitektur av en Gleason grad kan sammenlignes med pasientens opprinnelige tumorer [13], [40] – [45], [47], [48] , [53]. Det har også blitt observert at PC-stammen /progenitor-celler, inkludert side populasjon (SP) isolert fra PC-celler ved hjelp av Hoechst fargestoff efflux teknikk, som har en AI fenotype, og uttrykker høye nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) multilegemiddel transportører slike som ABCG2, var også mer motstandsdyktig enn sine differensierte progenies og ikke-SP celler til de anti-hormonelle og kjemoterapeutiske behandlinger [13], [14], [50] – [52], [59]. Til tross for disse fremskrittene, er ytterligere studier nødvendig for å validere distinkte molekylære biomarkører og terapeutiske mål i PC-stammen /stamceller og deres etterkommere som kan brukes i kombinasjon for å optimalisere den terapeutiske behandling av PC-pasienter ved tidligere sykdomsstadier.
den nåværende undersøkelsen ble gjennomført for å bestemme den kliniske relevansen av å bruke en kombinasjon av flere deregulerte onkogene produkter, inkludert EGFR, den fosforylert form av Akt, NF-
κ
B p65 og MIC-1 som molekylære biomarkører til forutsi risikoen for PC progresjon til lokalavansert tumor og terapeutiske mål å utrydde den totale PC cellemasse. Derfor analyserer immunhistokjemiske av uttrykket nivåer og co-lokalisering mønstre av disse proteiner ble foretatt på samme panel av PC vev og sammenlignet med ikke-maligne tilstøtende vev og normale prøver prostatavev. Videre var prostasphere dannende og -disintegration analyser og levedyktighet tester med SP-celler utrustet med stamcelle-lignende egenskaper og den ikke-SP cellefraksjon fra den svært tumorgene og invasive WPE1-NB26 cellelinje utføres med eller uten eksogent EGF i fravær eller nærvær av de spesifikke hemmende midler for disse onkogene produkter. Alt i alt viser resultatene har støttet fordelene med å kombinere disse onkogene produkter som molekylære biomarkører og terapeutiske mål for å forbedre nøyaktigheten i diagnostiske og prognostiske metodene og effektiviteten til behandlinger av PC-pasienter på tidligere sykdomsstadier.
Materialer og Metoder
Material
Den menneskelige WPE1-NB26 cellelinjen ble opprinnelig hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Foreldre WPE1-NB26-celler ble rutinemessig opprettholdt i keratinocytt serumfritt medium (SFM) supplementert med antibiotika (100 UI /ml penicillin-100 ug /ml streptomycin), L-glutamin, bovint hypofyse-ekstrakt, og epidermal vekstfaktor (EGF) i henhold til produsentens instruksjoner i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO
2. Keratinocyte-SFM, MitoTracker Red CMXRos fargestoff og alle andre kultur materialer var fra Life Technologies (Carlsbad, California). Docetaxel, partenolide, Akt-inhibitor VIII, og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), LY294002 fra Calbiochem Corp (San Diego, California) og gefitinib kom fra LC laboratorium (Woburn, MA). De polyklonale kanin anti-CD133 antistoff (H-284), muse-monoklonalt anti-CD44 (HCAM, F-4) antistoff, kanin polyklonalt anti-ABCG2 antistoff (B-25), kanin-polyklonalt anti-EGFR-antistoff (1005), geit polyklonale anti-Tyr
1173-fosfor-EGFR-antistoff (1173) erkjenner EGFR skjema fosforylert på tyrosin 1173 og kanin polyklonale anti-NF-kB p65 protein subenhet (C-20) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (i Santa Cruz, California). Musen monoklonalt anti-β-actin antistoff (klone AC-15) ble levert av Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, USA) og kaninen monoklonale anti-Ser
473-Pakt antistoff (D9E) fra Cell Signaling Technology, Inc. kanin polyklonale antistoff rettet mot kløyvet caspase-9-fragmentet ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) og mus monoklonalt anti-cytokrom
c product: (6H2) antistoff levert av Santa Cruz Bioteknologi, Inc (Santa Cruz, CA, USA). Kanin polyklonalt anti-MIC-1-antistoff ble dannet i vårt laboratorium mot den C-terminale aminosyren område av det modne MIC-1-protein, som tidligere beskrevet [27], [29]. Den fysoerytrin-konjugert monoklonalt anti-CD133 /2 antistoff (293C3) ble kjøpt fra Miltenyi Biotec. Inc. og benyttes i henhold til produsentens instruksjoner. Vectastain avidin-biotin-kompleks «ABC» metode peroksidase kit og 3,3′-diaminobenzidin «DAB» substrat kit for immunhistokjemisk farging ble anskaffet fra Vector Laboratories (Burlingame, CA).
Immunhistokjemisk og dobbelt immunohistofluorescence analyser
Immunhistokjemiske studier vedrørende ekspresjonsnivåene og cellulær lokalisering av EGFR, Ser
473-pakt, NF-kB p65 og MIC-1 proteiner i ikke-maligne og maligne prostata vev ble utført på prostatavev mikromatriser laget av formalinfiksert og parafininnstøpte vev kjøpt fra Biomaks Inc. (Rockville, Maryland, USA) som tidligere beskrevet. De analyserte vevsprøver inkluderer PR954 vevet microarray lysbilde som inneholder like kjerner fra 36 tilfeller av pasienter med primær prostata adenokarsinom (Gleason score: 6-10; stadier T2-T4) og tilsvarende matchet ikke-maligne tilstøtende vev fra de samme pasientene, og PR483 vev microarray lysbilde som inneholder en kjerne fra 40 tilfeller av pasienter med primær prostata adenokarsinom (Gleason score: 6-10; stadier T2-T4) og 8 normale prostata vev fra obduksjon brukt som kontroller. I tillegg ble ekspresjon av alle biomarkører også analysert i 30 benmetastase vev fra PC-pasienter (Gleason score: 6-10) (TriStar Technology Group, LLC, USA). Teknikken som brukes for immunohistostaining er blitt tidligere beskrevet [36], [38], [52]. Kort fortalt ble vevssnitt deparaffinized med EZ-DeWax ™ (Bio Genex, San Ramon, California) og rehydrert bruker gradert etanol løsninger. Etter vasking av glassplatene 3 ganger med fosfatbuffer saltvann (PBS) i 5 minutter, ble vevssnitt neddykket i mikrobølgeovn antigen gjenfinning oppløsning som besto av 0,01 M citrat-buffer pH 6,0 og underkastet mikrobølgebestråling 3 ganger i løpet av 3 min. Den ikke-spesifikke immunfarging ble blokkert i fortynnet Vectastain normal hesteserum (Vector «ABC» kit) i 10 minutter, og objektglassene ble deretter inkubert med primære anti-EGFR, -Ser
473-pakt, -NF-kB p65-protein underenhet eller -MIC-1-antistoff i et fuktet kammer over natten ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble platene inkubert med biotinylert universell sekundært antistoff i 30 minutter og ettervaskes med PBS. Endogen peroksidaseaktivitet ble undertrykket ved bruk av 0,3% hydrogenperoksyd i methanol:PBS (01:01) i 10 minutter. Etter en ytterligere vask, ble platene inkubert med ABC Vectastain-løsning i 30 minutter. Vevssnittene ble neddykket i en fargeløsning som inneholdt 3,3′-diaminobenzidin «DAB» substrat som angitt i produsentens instruksjoner og skyllet 3 ganger i vann. En rødbrun farge bunnfall ble observert på vevssnitt indikerer en positiv immunoreaktivitet med den testede primære antistoff. Skinnene ble kontra med hematoxylin, dehydrert og permanent montert med vectamount permanent monteringsmedium (Vector Laboratories). Bilder som ble tatt på et Nikon Eclipse E400 lysmikroskop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) ved forskjellige forstørrelser er representative for analyserte prøvene.
For hver vev seksjon, intensiteten av immunoreaktivitets for EGFR, Ser
473-Pakt, NF-kB p65 eller MIC-1 protein ble semi-kvantitativt gradert av en urologisk patolog (Dr. Johansson) på en 0-3 skala (0 = ingen farging, 1+ = uke flekker, 2+ = moderat flekker, og 3+ = sterk farging). Prosentandelen av PC celler positive for hver biomarkør analyseres innenfor et gitt vev kjernen ble også scoret på en 1-4 skala (1 = 0-25% positive PC celler, 2 = 26-50% positive celler, 3 = 51-75% -positive celler, og 4 = 76-100% positive celler). At resultatet av fargingsintensitet, og andelen av immunreaktive PC-celler ble deretter multiplisert for å oppnå en sammensatt score i området fra 0 til 12. Den fargeintensitet av forskjellige testede proteiner i prostata adenokarsinom prøvene ble bedømt og sammenlignet med de normale prostata vev, og den verdi ble betraktet som forbedret hvis fargeintensitet var høyere ved et eller flere punkter.
i tillegg analyserer dobbelt immunohistofluorescence av det ko-lokalisering av stamcelle-lignende markør, CD133 antigen (prominin-1) med ufosforylerte EGFR eller dens aktivert Tyr
1173p-EGFR fosforylert form, Ser
473-Pakt, NF-kB p65 eller MIC-1 ble også utført på deparaffinized og rehydrert godartede og ondartede menneskelige prostata vevsprøver fra pasienter hentet fra UNMC vev bank som tidligere rapportert [52], [60]. Vevet Platene ble blokkert i nærvær av 10% geiteserum i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon med fykoerytrin-konjugert anti-CD133 antistoff pluss anti-EGFR, anti-Tyr
1173-pEGFR, anti-Ser
473 -pAkt, anti-NF-
κ
B p65 eller anti-MIC-1 antistoff i 2 timer. Objektglassene ble vasket to ganger med PBS og behandlet for immunofluorescerende deteksjon som beskrevet nedenfor for de konfokale mikroskopiske analyser av fikserte celler.
Isolering av SP og ikke-SP cellefraksjoner og CD133
+ PC-celle subpopulasjon fra menneskelig tumorigent og invasiv WPE1-NB26 cellelinje ved flowcytometri
foreldre WPE1-NB26 celler (1 x 10
6 celler /ml) ble farget med Hoechst buffer som inneholder en endelig konsentrasjon på 2 mg /ml fluorescerende Hoechst fargestoff ved 37 ° C i 2 timer. De små subpopulasjoner av SP og ikke-SP-celler ble isolert ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) som tidligere beskrevet [52], [60], [61]. Analysene og sortering av levedyktig SP og ikke-SP celle fraksjonene ble gjort ved hjelp av en FACS Aria flowcytometer med en DIVA programvare (Becton Dickinson biovitenskap). De SP og ikke-SP-celle-fraksjoner ble samlet opp etter FACS og ekspresjonsnivået av CD133 stamcelle-lignende men da uten åpen ytterligere fenotypiske og differensierings endringer i disse to dyrkede celle subpopulasjoner ble oppnådd ved å opprettholde cellene i serumfritt keratinocyttkulturmedium inneholder eksogene EGF (10 ng /ml) før bruk.
Immun analyserer
SP og ikke-SP cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [36], [38], [60 ]. Proteinkonsentrasjonene ble beregnet ved anvendelse av en detergent-kompatibel proteinanalysesett fra Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Prøvene som tilsvarer 20 ug proteiner ble oppløst ved elektroforese på en 8 eller 10% SDS-polyakrylamidgel under reduserende betingelser. Proteinene ble overført til en Immobilon-P-membran overføring og blokkert i 5% fettfri tørrmelk i PBS i 2 timer og underkastet den standard immundeteksjon prosedyre. Ved slutten av inkubasjonen ble blotten skylt i TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,05% Tween) og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i 1 time . Antistoff-antigen-komplekser ble visualisert ved hjelp av forbedret kjemiluminescens (Amersham Biosciences).
Konfokalmikroskopi analyserer
SP og ikke-SP cellefraksjoner fra WPE1-NB26 cellelinje ble dyrket på et lavt tetthet på sterilisert dekkglass i 24 timer, vasket med PBS og fiksert i is-kald metanol ved -20 ° C i 2 minutter [36], [38], [52]. Cellene ble blokkert i 10% geiteserum i 30 min, og inkubert med fykoerytrin-konjugert monoklonal anti-CD133 /2 antistoff (293C3), muse-monoklonalt anti-CD44 (HCAM, F-4) antistoff, kanin polyklonalt anti-ABCG2 antistoff ( B-25), kanin-polyklonalt anti-EGFR-antistoff (1105), geit polyklonalt anti-Tyr
1173-pEGFR antistoff (1173), kanin-monoklonalt anti-pakt antistoff (D9E), kanin-polyklonalt anti-NF-kB-antistoff ( C-20), kanin-polyklonalt anti-MIC-1-antistoff eller monoklonalt mus anti-β-aktin-antistoff (klon AC-15) fortynnet i PBS i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vaskinger med PBS ble cellene deretter inkubert med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-mus, FITC-konjugert esel anti-geit og /eller Texas rød-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc ., West Grove, PA) i 1 time. I tillegg ble SP-celler behandlet med andre cytotoksiske midler i løpet av 4 dager farget med MitoTracker Red CMXRos i fuktet kammer ved 37 ° C i mørke i 30 minutter før fiksering og farging av SP-celler med muse-monoklonalt anti-cytokrom c-antistoffet i 1 time, etterfulgt av en inkubering med FITC-konjugert geit anti-mus i 1 time. Deretter ble alle PC-celler ble vasket en gang med PBS, kjerner motfarget med diamidino-2-fenylindol (DAPI) og montert på objektglass i anti-fading Vestashield monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Immunfluorescens farging ble observert under et konfokal laser scanning mikroskop (LSM 410, Zeiss, Göttingen, Tyskland).
Prostasphere dannende og oppløsning analyser
SP og ikke-SP cellefraksjoner isolert fra svært tumorgene og invasive WPE1-NB26 cellemasse ble holdt i serumfritt keratinocyttkulturmedium. Den selvfornyelse kapasitet på SP celler
versus
den ikke-SP cellefraksjon isolert fra den svært tumorigent og invasiv WPE1-NB26 cellelinjen ble anslått av deres evne til å danne ikke-heftende aggregater utpekt som prostaspheres i serum -fri kultur forholdene under ultra-lav festeplate (Corning, Invitrogen). For prostasphere dannende analyser, 500 levedyktige SP eller ikke-SP-celler erholdt etter cellesortering ble suspendert i serumfritt-keratinocytt-medium uten eller med eksogen EGF (10 ng /ml) på en 6-brønners ultra-lav festeplate i fravær eller tilstedeværelse av ulike rusmidler. De testede legemidler inkluderer en spesifikk hemmende middel av EGFR (gefitinib), PI3K (LY294002), pakt (pakt inhibitor VIII), NF-kB (partenolide) og MIC-1 (anti-MIC-1-antistoff), så vel som den aktuelle kjemoterapeutiske narkotika docetaxel. Alle prøver ble belagt i tre eksemplarer. Etter 7 dagers inkubasjon, ble antallet prostaspheres dannet ble talt og de representative bilder av SP WPE1-NB26 celle-stammer prostaspheres fotografert ved hjelp Accu-omfang fasekontrastmikroskop ved en forstørrelse på 200 ×.
i tillegg, for oppdeling analysene, ble 500 levedyktige SP WPE1-NB26 celler dyrket i serumfrie dyrkningsbetingelser under en ultra-lav festeplaten i løpet av 7 dager for dannelse av prostaspheres og deretter de testede legemidler ble tilsatt til kulturmedium og inkubert for 4 ekstra dager. På dag 11 ble de representative bilder av desintegrerte prostaspheres fotografert ved hjelp Accu-omfang fase-kontrast mikroskop med en forstørrelse på 200 ×.
TUNEL analysen
Terminalen deoxynucleotidedyl transferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse ble utført for å påvise DNA-fragmentering indikativ for apoptotisk celledød indusert ved testede cytotoksiske midler på SP WPE1-NB26 celle subpopulasjon. Etter vask av faste SP WPE1-NB26 celler med PBS ble cellene inkubert i TdT reaksjonsblandingen bestående av nukleotid-merking mix (TUNEL Label) inneholder fluorescein-dUTP og -dNTPene pluss TdT enzym (Roche Diagnostics, IN) i fuktet kammer på 37 ° C i mørke i 1 time. De SP-cellene ble vasket tre ganger i PBS og inkubert med et primært antistoff rettet mot det spaltede capsase-9-fragmentet i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av en inkubasjon med FTIC-konjugat sekundært antistoff i 1 time. Etter tre skyllinger med PBS ble cellene kontra med DAPI for atom flekken og visualisert ved confocal fluorescens mikroskopi som ovenfor nevnt.
Celleviabilitet analyser
For celleviabilitet analyser, SP og ikke-SP celle-fraksjoner isolert fra de WPE1-NB26 cellelinje ble sådd på 96-brønners plater i en tetthet på 3 x 10
4 celler per brønn i et totalt volum på 200 ul fri-serum keratinocyttkulturmedium som tidligere nevnt [36] , [38], [52]. Etter 3 dager, SP og ikke-SP WPE1-NB26 celler var ubehandlet eller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av testede legemidler inkludert gefitinib, LY294002, pakt inhibitor VIII, partenolide, anti-MIC-1-antistoff eller docetaxel, alene eller i kombinasjon. Etter 72 timers inkubering ble celle-levedyktighet anslås ved en MTT kolorimetrisk test.
Flow cytofluorometriske analyser
SP WPE1-NB26-celler ble dyrket ved en tetthet på 5 x 10
5 celler på 25 cm
2 retter som beskrevet tidligere. De SP-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av legemidler som ble testet, alene eller i kombinasjon med 5 nM docetaxel i løpet av fire dager. Den apoptotiske effekt som induseres av midler som ble testet på SP WPE1-NB26-celler ble beregnet etter DNA-farging av hver prøve med propidiumjodid ved FACS analyser som tidligere beskrevet [36], [38], [52].
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av studentens
t
-test for å sammenligne resultatene med
P
verdier 0,05 indikerer statistisk signifikante forskjeller. Mer spesifikt ble immunhistokjemiske data analysert ved hjelp av Windows-versjon 9.6.4.0. programvare. De sammensatte scorene til biomarkør uttrykk ble ansett som kontinuerlige variabler og sammenlignet ved hjelp av Student tosidige t test forutsatt ulik varians for uavhengige utvalg.
Resultater
Immunhistokjemisk analyse av uttrykket nivåer av EGFR, Ser
473-Pakt, NF-kB p65 og MIC-1 signalelementer i ikke-maligne og maligne vevsprøver av prostata
resultatene fra immunhistokjemiske analyser har antydet en veldig svak til undetectable farging for EGFR, Ser
473-pakt, NF-kB p65 og MIC-1 i normale prostatiske vev av biopsi og tilstøtende ikke-ondartet prostatavevet fra PC-pasienter (figur 1). I motsetning til dette ble en forsterket uttrykking av alle disse biomarkører påvist i 66-75% av tilfellene av 76 prostata adenokarsinomer (Gleason score = 6-10) analysert
versus
normal prostata vev og i forbindelse med trinnene ( T2-T4) av den sykdomsprogresjon (tabell 1). Nærmere bestemt ble en svak cytoplasma og membranen immunofarging for EGFR-proteinet detektert bare i et lite antall av basal og luminale prostata epitelceller i ikke-ondartet prostatavevet, mens dens ekspresjon varierte fra moderat til sterk i cytoplasma og membranen hhv i de ondartede epitelceller lokalisert i de mellomliggende og luminale kamrene i en undergruppe av foretrukne prostata adenokarsinom prøver (Figur 1a). Fargeintensitet forbundet med EGFR-protein-ekspresjon ble forbedret i 68% av tilfellene av 76 primær prostata adenokarsinom prøver som ble analysert, sammenlignet med den normale prostatavev fra biopsi (tabell 1). Videre er sammensatt score verdien oppnådd for EGFR uttrykk i PC-prøver (3,4 ± 0,4) var signifikant bedre enn verdien for normale prostata vev (0,4 ± 0,2); * P 0,0001) (figur 2a). Som vist i figur 1 b og c, den aktiverte Ser
473-pakt fosforylert form ble også overuttrykt i 66% av 76 tilfeller av prostata- adenokarsinomer analysert og funnet i cytoplasma i PC-epitelceller, mens en forsterket uttrykking av p65 subenheten NF-kB transkripsjonsfaktor forekom hos 75% av 76 tilfeller av prostata- og adenokarsinomer ble hovedsakelig funnet i cytoplasma og kjerner av PC-epitelceller. De sammensatte poengsum verdiene oppnådd for Ser
473-Pakt og NF-kB p65 uttrykk i PC-prøver (3,3 ± 0,4 og 2,7 ± 0,3) ble betydelig forbedret i forhold til verdien for normale prostata vev (0,3 ± 0,1 og 0,3 ± 0,2; p 0,0001), henholdsvis (figur 2b og c). I tillegg ble en sterkere positiv farging også sett for MIC-1-proteinet i cytoplasma og nær membranen i PC-epitel-celler, så vel som for utskilt MIC-1 i tumor stroma i 71% av 76 tilfeller av prostata adenokarsinomer sammenlignet normal og tilstøtende ikke-ondartet prostata vev analysert (figur 1D). Den sammensatte poengsum verdien oppnådd for MIC-1 uttrykk i PC-prøver (. 3,7 ± 0,4) ble betydelig forbedret i forhold til verdien for normale prostata vev (0,4 ± 0,3; * p 0,0001) (figur 2d). Viktigere, har resultatene også indikert at Ser
473-Pakt, NF-kB p65 og MIC-1 ble co-uttrykkes med EGFR i samme undergruppe tilsvarende om lag 54-62% av prøvene PC vev analysert som tyder på at disse onkogene signaliseringselementer kan alle samvirker for å fremme den maligne transformasjon av PC-epitelceller i løpet av sykdomsprogresjon til en lokalt avansert sykdomstilstand (tabell 1).
Microarray deler av ikke-maligne og maligne prostata vevsprøver ble probet med et anti -EGFR, -Ser
473-Pakt, -NF-kB p65 eller -MIC-1 antistoff etter blokkering med serum. Alle seksjonene ble undersøkt under et mikroskop og immunoreaktiviteten ble bedømt ved mørkebrun farging. Representative bilder av fargede vevsprøver av normal prostata, ikke-maligne tilstøtende vev fra prostata tumor og prostatisk adenocarcinoma oppnådd for (a) EGFR, (b) Ser
473-pakt, (c) NF-kB p65 og (d) MIC-1 er vist på original forstørrelser av × 100 og × 400. Pilene viser lokalisering av basal celler i normal og ikke-ondartet prostata epitel og farging oppdaget for disse biomarkører i prostata adenokarsinom vevsprøve. Videre er positiv farging detektert for utskilt MIC-1 protein i stromal kammer tilstøtende til prostatatumorvevet er også indikert.
Box plott som viser ekspresjonsnivåene av (a) EGFR, (b) Ser
473-Pakt, (c) NF-kB p65 og (d) MIC-1 i løpet av PC progresjon til metastatisk sykdom etapper. *,
P
0,0001, indikerer en betydelig økning mellom de sammensatte score på prostata- adenokarsinom og PC bein metastase eksemplarer i forhold til sammensatte score på normale prostatavevet
Viktigere, en positiv farging varierer fra moderat til sterk innen cytoplasma og i nærheten av membran eller i kjerner ble også påvist for EGFR, Ser
473-Pakt, NF-kB p65 og MIC-1 i PC-celler i 80 -100% av beinmetastase vev analysert fra 30 PC-pasienter (Gleason score = 6-10) (figur 3; tabell 1). Videre MIC-en immunofarging varierte fra meget svak til moderat intensitet ble sett i stroma av PC beinmetastase vev (figur 3d). De sammensatte score på uttrykket av alle disse biomarkører i bein metastase vev fra PC-pasientene var også bedre enn de målte verdiene for normal prostata vev og prostata adenokarsinom speciments (figur 2; * p 0,0001)
. microarray deler av PC vevsprøver bein metastase ble undersøkt med anti-EGFR, -Ser
473-Pakt, -NF-kB p65 eller -MIC-1 antistoff etter blokkering med serum. Alle seksjonene ble undersøkt under et mikroskop og immunoreaktiviteten ble bedømt ved mørkebrun farging. Representative bilder av farget prøvene PC benvev innhentet for EGFR, Ser
473-Pakt, NF-kB p65 eller MIC-1 er vist på original forstørrelser av × 100 og × 400.
Double immunohistofluorescence konfokalmikroskopi analyser av uttrykket nivået av CD133 stamcelleliknende markør og dens samlokalisering med EGFR, Ser
473-Pakt, NF-kB P65 og MIC-1 signalelementer i ikke-maligne og ondartet prostatavevet prøver
for å få eksperimentelle bevis på potensialet implikasjon av uttrykksmuligheter og /eller aktivering av EGFR, Pakt, NF-kB p65 og MIC-1 i ondartet transformasjon av CD133
+ voksen prostatic stilk /stamceller i CD133
+ PC stilk /stamceller, har vi også preget samlokalisering av CD133 stamcelleliknende markør med disse onkogene signal elementer i ikke-maligne og maligne prostata vev fra pasienter (figur 4) .
