Abstract
microRNAs (mirnas) spiller en avgjørende rolle i mange biologiske prosesser og avvikende uttrykt i kreft hos mennesker. Spesielt mirnas funksjon enten som tumor-suppressorer eller onkogener og synes å ha diagnostisk og prognostisk betydning. Selv om mange mirnas er dys regulert i tykk- og endetarmskreft (CRC) bare en liten brøkdel har vært preget funksjonelt. Ved hjelp av høy-throughput funksjonell screening og miRNA profilering av kliniske prøver med denne studien tar sikte på å identifisere mirnas viktig for kontroll av cellevekst og /eller apoptose i CRC. Den high-throughput funksjonell screening ble utført i seks CRC-cellelinjer transfektert med en forhånds MIR bibliotek, inkludert 319 syntetiske humane pre-Mirs. Fenotypiske endringer ble evaluert ved farging av spaltet cPARP (apoptose) eller MKI67 (spredning). I tillegg ble TaqMan Menneskelig mikroRNA Array Sett v2.0 brukes til å profilere uttrykk av 667 miRNAs i 14 normal tykktarm slimhinnen og 46 mikro stabile stadium II CRC pasienter. Blant de mirnas som induserte vekst og apoptose i CRC cellelinjer, og på samme tid var dys-regulert i kliniske prøver, ble MIR-375 valgt for videre analyse. Uavhengig
in vitro
analyse av forbigående og stabile transfekterte CRC cellelinjer bekreftet at MIR-375 reduserer celleviabilitet gjennom induksjon av apoptotisk død. Vi identifiserte YAP1 som en direkte Mir-375 mål i CRC og viser at HELLS og NOLC1 er ned-stream mål. Knock-down av YAP1 etterlignet fenotype indusert av MIR-375 over-uttrykk som indikerer at MIR-375 utøver mest sannsynlig sin pro-apoptotiske rolle gjennom YAP1 og sin anti-apoptotiske nedstrøms mål BIRC5 og BCL2L1. Til slutt,
in vivo
analyse av muse xenografttumorer viste at Mir-375 uttrykk betydelig redusert tumorvekst. Vi konkluderer med at høy gjennomstrømming screening vellykket identifisert mirnas som induserer apoptose og /eller hemmer spredning i CRC celler. Til slutt, ved å kombinere det funksjonelle screening med profilering av CRC vevsprøver vi identifisert klinisk relevante mirnas og miRNA mål i CRC
Citation. Christensen LL, Holm A, Rantala J, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et al. (2014) Funksjonell Screening Identifiserer mirnas Påvirknings apoptose og spredning i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10,1371 /journal.pone.0096767
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 24 juli 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 03.06.2014
Copyright: © 2014 Christensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den danske National Advanced Technology Foundation, John og Birthe Meyer Foundation, den danske Rådet for Independent forskning (Medical Sciences), den danske Rådet for Strategic Research, den Lundbeck Foundation og sjuende rammeprogrammet EUs (SYSCOL HELSE-F5 -2010-258236). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en vanlig ondartet sykdom og en ledende årsak til kreftdødelighet i verden. Livstidsrisikoen er ca 5% og stiger [1]. CRC er forårsaket av akkumulering av tallrike genetiske og epigenetiske forandringer. Kromosom ustabilitet fører til allele ubalanse står for 70-85% av svulstene, mens 20-15% har DNA mismatch repair feil som fører til mikro ustabilitet. De molekylære endringer i CRC har blitt nøye studert for å oppdage diagnostiske og prognostiske markører. Blant annet har mRNA-ekspresjon profilering blitt mye brukt for å identifisere differensielt uttrykte gener med prognostiske og diagnostiske implikasjoner. Men i dag ingen av disse er oversatt til klinisk praksis og dermed er det fortsatt behov for ytterligere molekylær karakterisering og klassifisering av CRC.
microRNAs (mirnas) omfatter et rikt klasse av små (19-24 nt), ikke-kodende regulatoriske RNA-molekyler [2]. De spiller en avgjørende rolle ved regulering av genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå ved komplementær binding av miRNA tråden til den mRNA-target-sekvensen, noe som fører til enten mRNA degradering eller translasjonsbevegelse inhibering [3]. Mer enn 60% av alle proteinkodende gener inneholder konservert miRNA bindingsseter og er dermed potensielle mål av mirnas [4]. Mirnas har vist seg å være involvert i mange biologiske prosesser som celleproliferasjon, apoptose, differensiering og angiogenese [5] – [7]. I dag har mirnas vist seg å spille en viktig rolle i mange typer kreft (gjennomgått av Garzon et al. [8]). Rollen til mirnas i utviklingen av CRC har blitt intensivt studert. I 2006, Cummins og medarbeidere publiserte den første detaljerte og systematisk analyse av miRNA uttrykk i CRC, dukke opp og nedregulering av spesifikke miRNAs [9]. Siden da har flere studier har bekreftet dys-regulering av mirnas i CRC [10] – [15]. Likevel er vår kunnskap om funksjonen til de enkelte mirnas begrenset til et forholdsvis lite antall miRNAs. Funksjonell screening er blitt brukt for å identifisere mirnas som er årsaksmessig knyttet til spesifikke fenotyper (gjennomgått av Izumiya et al. [16]). I CRC har funksjonell screening vært brukt i noen få tilfeller å identifisere mirnas som påvirker celleproliferasjon og død [17], [18]. Men studien utført av Nakano et al. ble utført i en cellelinje bare og deres funn var ikke korrelert til uttrykk av miRNAs i kliniske CRC prøver. Endelig har funksjonell screening identifisert klinisk relevante mirnas i bukspyttkjertelen og testikkelkreft bakterie celle svulster [19], [20].
Den anerkjente diagnostiske og prognostiske potensialet miRNAs og behov for ytterligere systema funksjonelle analyser av miRNAs i CRC oppmuntret oss til å kombinere høy gjennomstrømming funksjonelle screening med miRNA uttrykk profilering i kliniske prøver. Ektopisk uttrykk av 319 miRNAs i 6 forskjellige CRC cellelinjer ble kombinert med miRNA uttrykk profilering av 14 normal tykktarm slimhinnen og 46 kolorektal tumorer. Disse analysene identifisert en rekke mirnas som ble vist å være forskjellig uttrykt i barnekonvensjonen og å ha en innvirkning på cellulær proliferasjon og /eller apoptose
in vitro
. MIR-375 var blant dem som er valgt for videre
in vitro Hotell og
in vivo
analyser, som bekreftet at MIR-375 reduserer tumorvekst gjennom induksjon av apoptotisk død. For å identifisere potensielle Mir-375 mRNA rettet uttrykk for MIR-375 ble korrelert til genom-wide mRNA uttrykk profiler. Korrelasjonsanalyse av både
in vitro
modellsystemer og kliniske CRC prøvene viste at uttrykket av Ja-assosiert protein 1 (YAP1) ble negativt korrelert til MIR-375. Ago2 immunoprecipitation indikerte at YAP1 er en direkte MIR-375 mål i CRC. Videre funksjonelle studier indikerte at pro-apoptotiske rollen MIR-375 mest sannsynlig blir mediert av YAP1 og sin anti-apoptotiske nedstrøms mål BIRC5 og BCL2L. Til slutt ble lymfoid spesifikke helicase (HELLS) og nukleolært og coiled-body fosfor protein 1 (NOLC1) identifisert som down-stream mål av MIR-375 potensielt spille en rolle i cellesyklusen regulere trasé.
Materialer og metoder
En fullstendig beskrivelse av materialer og metoder er gitt i tilleggsmaterialet (Methods S1).
Etikk erklæringen
bruk av menneskelige vevsprøver for forskningsformål ble godkjent av Divisjonsstyret ved Walter og Eliza Hall Institute of Medical Research HREC (Cohort en AUS, HREC No 12/19), etikkomiteen ved University of Pomeranian (Cohort en POL, BN-001/174/05) de Region Midtjylland komiteer på Biomedical Research Ethics (Cohort en DK, 1999/4678) og den sørlige Danmark Region komiteer på Biomedical Research Ethics (Cohort 2 DK, VF-20040047). Informert skriftlig samtykke ble gitt av alle deltakerne. Alle dyreforsøk ble godkjent av danske Animal Experiments Inspectorate (filnummer: 2013-15-2934-00861 /ACHOV)
Kliniske prøver og cellelinjer
Cohort 1 besto av totalt 46 Dypfryst mikro stabil (MSS), barnetrinn II (T2-4, N0, M0) CRC og 14 normal tykktarmsslimhinnen. En uavhengig kohort bestående av 25 normale tykktarmsslimhinnen og 63 MSS, primære stadium I-IV (T2-4, N0-3, M0 /1) CRC (kohort 2) ble brukt for validering. Pasienter og eksempel egenskaper er oppsummert i Tabell 1. Cellelinjer, vekstforhold og cellelinje autentisering kan bli funnet i tilleggsmaterialet (Methods S1).
Dyr
BALB /cAnNTac -nude immunmangelfull mus (6-8 uker, 20-22 g) ble kjøpt fra Taconic Europa (DK-4623 Ll. Skensved, Danmark). Før eksperimentene ble musene gis en tilpasningsperiode på minst 14 dager. Musene ble holdt ved de samme betingelser (dvs. konstant romtemperatur (22 ° C) og et naturlig dag /natt syklus lys. Standard laboratorie mat og vann ble gitt ad libitum.
mirna funksjonell bibliotek skjerm
celle~~POS=TRUNC sted microarray teknologi ble brukt til å generere høy tetthet forhånds miRNA transfeksjon mikromatriser som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [21]. i korthet, bibliotek holder 319 syntetiske menneskelige forhånds mirnas (Ambion pre-MIR v1.0) (Ambion , Austin, TX, USA) ble brukt til trykking av arrays. Deretter CRC celler (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, HT29, Caco2 og SW480) ble sådd på arrays og omvendt transfektert i 48 timer. Hvis du vil tillate mikroskopisk påvisning av pre-mirnas effekter påvirke celleproliferasjon og /eller apoptose arrays ble immunostained for Ki-67 (spredning markør) og for kløyvde poly ADP-ribose polymerase (cPARP) (apoptose markør). DNA ble farget ved hjelp av 4 «, 6 diamidino -2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eller SYTO60 (Invitrogen). ble utført microarray analyse med mikroskopisk avbildning av gruppene ved hjelp av scanR høyt innhold imager (Olympus) og effekten av miRNA over-ekspresjon på apoptose og celleformering ble ansett som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt, etter normalisering en z-score (z = (χ-μ) /σ) ble beregnet for scoring av de målte punktverdier. χ = normalisert flekk nivå verdi, μ = global rekke bety og σ = standardavvik (sd)
RNA og miRNA isolasjon
Total RNA ( 200 baser). ble isolert fra celle pellets og Dypfryst vevsprøve hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. De små RNA ( 200 baser) ble gjenvunnet fra gjennomstrømningsfraksjonen ved bruk av RNeasy mikropakke sammen med RNeasy MinElute spinnkolonner (Qiagen) (beskrevet i tilleggsmaterialet (Methods S1)). De små RNA fra RNAlater bevart vevsprøver ble isolert direkte ved hjelp av RNeasy Micro Kit (Qiagen).
miRNA profilering i kliniske prøver
miRNA uttrykket profilering ble utført ved hjelp av stammen løkke RT- qPCR basert TaqMan Menneskelig mikroRNA Array Sett v2.0 som angitt av produsenten (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [22]. Den NormFinder algoritme ble brukt til å finne passende referanse gener [23].
miRNA og mRNA RT-qPCR
Enkelt tube TaqMan mikroRNA eller mRNA analyser (Applied Biosystems) ble brukt til å kvantifisere enkelte modne miRNAs eller mRNA (detaljer i tilleggsmaterialet (Methods S1)). Den Applied Biosystems TaqMan analysen ID-tallet og primer som brukes for påvisning av mRNA referansen genet ubiquitin C (UBC) er oppført i tabell S1 i File S1.
MTT analyse
Celler ble sådd i 96 -vel plater, reverse-transfektert og inkubert i 72 timer med pre-Mirs eller siRNAs. Cellelevedyktighet /proliferasjonen ble målt ved anvendelse av 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) (beskrevet i tilleggsmaterialet (Methods S1)). De Applied Biosystems pre-MIR og
Silencer
Velg siRNA ID og sekvensene av YAP1 sirnas fra GenePharma (Shanghai, Kina) er oppført i tabell S2 i File S1.
LDH analysen
Celler ble sådd i 96-brønners plater og omvendt-transfektert i 48 eller 72 timer med pre-Mirs eller sirnas (tabell S2 i File S1) (ytterligere detaljer finnes i tilleggsmaterialet (Methods S1)). Deretter ble cellulær død (LDH aktivitet) målt med Cytotoksisitet Detection Kit
PLUS (LDH) (Roche Applied Science).
caspase 3/7 aktivitetsanalyse
caspase 3 /7 aktivitetsanalyse ble anvendt for å måle apoptotisk død og utført i hovedsak som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene sådd ut i 24 brønners plater og omvendt-transfektert med pre-Mirs eller sirnas i 48 timer (tabell S2 i File S1). Caspase 3/7 inhibitor (z-DEVD-FMK) (Biovision, San Francisco, CA, USA) ble tilsatt 6 timer etter transfeksjon (sluttkonsentrasjon 25 uM). Caspase 3/7 aktivitet i cellelysatene, målt ved frigjøringen av AFC (eksitasjon, 400 nm, emisjon 489 nm) fra underlaget Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA), ble målt ved hjelp av en multiplate leser ; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).
Laser Capture mikrodisseksjon
Laser Capture mikrodisseksjon (LCM) ble utført på frysesnitt fra paret kreft og tilstøtende normale tykktarmsslimhinnen biopsier (beskrevet i detalj i Supplerende Material (Methods S1)). Epitelceller ble tatt på individuelle caps med Veritas 704 mikrodisseksjon Instrument (Applied Biosystems) ved hjelp av ultrafiolett laserskjæring i henhold til instruksjonene gitt av produsenten.
De MIR-375 metylering nivåer i CRC cellelinjer og kliniske prøver
Bisulfite modifisert DNA var hele genomet forsterkes og hybridisert til infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, California) over natten som beskrevet av produsenten. BeadChips ble skannet med en BeadXpress Reader instrument (Illumina) og data analysert ved hjelp av Bead Studio Metylering Module programvare (Illumina). Metylering nivåene ble gitt i betaverdier, med en betaverdi på 0 tilsvarer ingen metylering, og en tilsvarende full metylering. ID-ene for CPG områder i umiddelbar nærhet til
MIR-375
var som følger CpG1; cg00215432, CpG2; cg00218620, CpG3; cg00705280, CpG4; cg02257674, CpG5; cg04348419, CpG6; cg06214770, CpG7; cg14358282, CpG8; cg21615583, CpG9; cg22306928, CpG10; cg01822124 og CpG11; cg26394220.
ChIP analyse
chip Analysen ble utført som beskrevet tidligere [25]. Primere som brukes til å forsterke chip DNA-områder er oppført i tabell S1 i File S1.
Identifisering av potensielle Mir-375 mål basert på mRNA profilering og
i silico
mål prediksjon
mRNA profilering av MIR-375 transfekterte HCT116-celler og de kliniske prøver er beskrevet i tilleggsmaterialet (Methods S1). Plassering og antall av MIR-375 frø sekvenser (dvs. komplementær til stillingen 2-8 av miRNA) i full lengde mRNA sekvens ble kartlagt ved hjelp av sekvensdata hentet fra TargetScan v5.2 og Ensembl 62 databaser [26], [27 ].
Ago2 immunoprecipitation
Scr og MIR-375 transfektert celle (~3.5 × 10
6) ble skrapt av kulturflasker på isen i milde lysis buffer (20 mM TRIS pH 7,5 , 10 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA supplert med RNase inhibitor RNaseOut (Invitrogen) og Complete mini Protease inhibitor cocktail (Roche)) og hypertonically lysert ved å øke NaCl-konsentrasjonen til 150 mM. Etter sentrifugering ved 4 ° C og 19000 * g i 10 minutter, supernatanten ble oppsamlet og underkastet immunoutfelling (10% ble anvendt for inngangsstyre) ved inkubering med monoklonalt antistoff Ago2 (11A9) (Sigma-Aldrich) -bundet Protein G-koblet magnetiske Dynabeads (Life-teknologi) (15 mg 11A9 per 25 ml perler) etter produsentens anbefaling. Anti-FLAG immunoutfelling ble utført i parallell som en negativ kontroll (antistoff F1804, Sigma). Kulene ble vasket 5 ganger i iskald vaskebuffer (50 mM TRIS, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,05% NP-40). Total RNA fra inngang, ble Ago2-IP og FLAG-IP-komplekser renset ved hjelp QIAZol (Qiagen).
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (Oppfinnsomhet Systems, Redwood city, CA, USA) ble brukt til å få innsikt i den generelle biologiske endringer innført ved ektopisk uttrykk for MIR-375. Normaliserte og filtrerte mRNA data ble lastet opp til IPA. Ved hjelp av oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base (IPKB) hvert gen var knyttet til bestemte funksjoner, stier og sykdommer, og en berikelse analyse ble utført undersøke om dataene ble beriket for gener assosiert med en bestemt funksjon. Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere betydningen av de enrichments
Protein utvinning og Western blotting
Protein utvinning og Western blotting-analyse ble utført i henhold til standard prosedyrer (detaljer i tilleggsmaterialet (Methods S1) ).
Bygging av plasmider for luciferase reporter analysen
Valgte fragmenter av 3’UTRs av HELLS (NM_018063) og NOLC1 (NM_004741) inneholder antatte MIR-375 bindingsseter ble forsterket fra normal humant genomisk DNA og klonet nedstrøms for
Renilla
Luciferase genet i siCHECK-2 vektor (Promega, Fitchburg, WI, USA). Valgte konstruksjonene ble mutert i den antatte miRNA bindende regionen ved hjelp av Quickchange Lightning Side mutagenese Kit (Agilent Technologies) i henhold til gitt protokollen. Detaljer er gitt i tilleggsmaterialet (Metoder S1) og primere som brukes for kloning og språk mutagenese er beskrevet i tabell S3 i File S1.
Luciferase reporter analysen
transfekterte HEK-293T celler ble analysert ved bruk av dual Glo Luciferase Assay System (Promega) som beskrevet tidligere [28] (detaljer er beskrevet i tilleggsmaterialet (Methods S1)). Luminescence ble oppdaget med en multiplate leser; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Renilla
Luciferase aktivitet var normalisert til
Firefly
Luciferase aktivitet for hver transfektert godt, for å korrigere for forskjeller i transfeksjonseffektiviteter og høste effektivitet.
Produksjon og karakterisering av stabil HCT116 celler med induserbar MIR-375-uttrykk
generering av stabile HCT116-celler med induserbar ekspresjon av MIR-375 er beskrevet i detalj i den tilleggsmaterialet (Methods S1). I utgangspunktet
MIR-375
ble klonet inn i 3 «UTR region av
turbo rød fluorescens protein genet plakater (TRFP) av pSBInducer10 vektor (
MIR375
_pSBInducer10). Den pSBInducer10-vektoren ble konstruert ved å erstatte lentivirale elementer i pINDUCER vektor [29] med SleepingBeauty inverterte terminale gjentagelser. Stabile HCT116_miR-375 og HCT116_Scr celle bassenger ble generert som følger. For det første, 1,5 × 10
6 HCT116-celler ble transfektert med pCMV-SB100XCO (vektor med transposase) og enten
MIR375
_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) eller
Scr
_pSBInducer10 (HCT116_scr). Førti-åtte timer etter transfeksjon puromycin (sluttkonsentrasjon 1 pg /ml) (Sigma) ble tilsatt for å selektere for stabilt transfekterte celler. Puromycin Utvalget ble utført i 5 dager. Deretter ble cellene behandlet med 50 ug /ml doksycyklin (DOX) (Sigma) i 48 timer fører til transkripsjonen aktivering av tRFP-
MIR375
kassett. Den TRFP fluorescens-markør ble anvendt som et surrogat for å sortere for cellepopulasjon som uttrykker det høyeste nivået MIR-375 etter induksjon av DOX. I korthet ble cellene som har høyest nivå TRFP (100-1000 ganger over bakgrunnsnivået i ubehandlede celler) (HCT116_miR-375H og HCT116_ScrH) isoleres ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) under anvendelse av en fire-laser FACSAriaIII (BD Biosciences, San Jose, CA) og anvendt for alle etterfølgende analyser. Dox avhengig ekspresjon av modent MIR-375 i HCT116_miR-375H-celler ble analysert ved hjelp av RT-qPCR som beskrevet tidligere. De HCT116_miR-375H celler ble fenotypisk preget hjelp xCELLigence (Roche Applied Science), caspase 3/7 analyser og YAP1 Western blotting (detaljer i tilleggsmaterialet (Methods S1)).
In vivo
tumorvekst analyse
HCT116_miR-375H celler (3,5 × 10
6 celler per injeksjon) ble suspendert i 200 mL PBS og injisert subkutant i venstre flanken av bedøvet mus (n = 12). Musene ble delt i to grupper med 6 dyr i hver gruppe: A; MIR-375 (+ DOX) og gruppe B; kontroll (- DOX). Tumorene ble målt med jevne mellomrom (lengde og bredde) av den samme observatør. For å indusere ekspresjon av MIR-375, DOX (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) ble tilsatt til drikkevannet til musene i gruppe A, når tumorene nådde en størrelse på ca 50 mm
3. Musene i gruppe B ble gitt vanlig drikkevann. Den DOX behandling ble utført i 14 dager. Fire mus ble tatt ut av studien før DOX behandling (to hadde meget raskt voksende svulster og to hadde svulster som sluttet å vokse) dvs. n = 4 i gruppe A og B. Den estimerte tumor volum (EV) ble beregnet som EV = lengde x (bredde)
2 × 1/2. EV ble plottet mot antall dager etter oppstart av DOX behandling og xenograft vekstkurver ble generert.
Statistisk analyse
Betydningen av miRNA uttrykk endringer ble analysert med Mann Whitney U test i multi Experiment Viewer (MeV) matrise analysator programvare [30]. Den hierarkiske clustering av forskjellig uttrykt miRNAs ble utført ved hjelp av Gene Cluster 3.0 [31]. Bare, mirnas som ble uttrykt i mer enn 80% av prøvene ble tatt. Varme kartene ble generert med Java Utforsker [32]. Elevens uparet
t
-test ble brukt for å sammenligne miRNA induserte endringer med respektive kontroller i MTT analysen, LDH analyse, apoptose analyse, RT-qPCR analyse og
in vivo
tumorvekst analyseverktøy. Student «s paret t-test ble anvendt for RT-qPCR-analyse av microdissected vevsprøver. En
p
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
High-throughput screening identifiserer en rekke mirnas som induserer apoptose og /eller hemmer spredning i CRC celle. linjer
for å identifisere mirnas med den mest konsekvente påvirkning på vekst og /eller overlevelse av CRC kreftceller vi utført en high-throughput screening i seks CRC cellelinjer, ved hjelp av et bibliotek som holder 319 syntetiske menneskelige pre-miRNAs. Forhånds MIR induserte endringer i cPARP og Ki-67 ble brukt for å identifisere mirnas den induserte apoptose og /eller inhibere proliferasjon respektivt. Utdeling av z-skår for hver pre-Mir er vist i figur S1. Z-poeng rang produkter ble brukt til å identifisere konsistensen av pre-miRNA effekter på tvers av alle testede CRC-cellelinjer [33]. Rang produkt Top-40 pre-Mirs er oppført i tabell S4 i File S2 (økt cPARP) og tabell S5 i File S2 (redusert Ki-67). Flere av Top-40 rangert mirnas har tidligere vist seg å påvirke enten apoptose og /eller spredning
in vitro plakater (en undergruppe av disse er vist i tabell S6 i File S1).
miRNA uttrykk profilering av kliniske prøver
for å adressere
in vivo s
ignificance av miRNAs identifisert i high-throughput funksjonell screening vi profilert uttrykket av 667 unike miRNAs i 14 normal tykktarm slimhinner og vev prøver fra 46 kliniske stadium II CRC prøver. I alt ble 53 mirnas uttrykt forskjellig mellom normal slimhinne og CRC (Mann Whitney U test p≤0.01 og 1.5≤FC
(log2) ≤-1,5) (figur 1 og tabell 2). En undergruppe av 25 mirnas viste økt uttrykk i CRC svulster i forhold til normal slimhinne mens 28 miRNA ble nedregulert i CRC svulster. Ved å kombinere resultatene av miRNA profilering av kliniske prøver med resultatene av high-throughput funksjonell screening vi identifisert 10 mirnas som ble differensielt uttrykte i kliniske CRC-prøver og samtidig induserte fenotypiske forandringer i funksjonell screening (Top-40 rangeres) (Tabell 2 og Tabell S6 i File S1). I tillegg åtte dys-regulerte mirnas indusert fenotypiske endringer i minst én cellelinje, men var ikke Høyt 40 rangeres (tabell 2). Elleve av de ovennevnte miRNAs ble nedregulert og dermed disse mirnas er tumorsupressorproteinene kandidater. Til slutt, 20 av de dys-regulerte mirnas ble ikke inkludert i pre-miRNA biblioteket fra Ambion og dermed deres evne til å indusere fenotypiske endringer kan ikke bli analysert i denne studien (tabell 2). I konklusjonen, identifiserte vi 11 mirnas som ble nedregulert i CRC prøver og samtidig indusert spredning og /eller hemmet apoptose i CRC cellelinjer og dermed disse mirnas er potensielt involvert i kolorektal tumorigenesis.
hierarkisk clustering av miRNAs med betydelig forskjellig uttrykk mellom kolorektal adenokarsinomer og normale tykktarmsslimhinnen prøver (p≤0.01). Radene representerer individuelle mirnas og kolonnene representerer individuelle vevsprøver. Skalaen representerer intensiteten av genekspresjon (log2 skala som strekker seg mellom -2,98 og 2,98) (p-verdier og FCS finnes i tabell 2). De mirnas merket med blått ble funnet å hemme spredning og /eller indusere apoptose i high-throughput skjerm (Top-40 rangert mirnas).
Validering av fenotyper identifisert i høy- gjennomstrømming skjermen
For å validere de identifiserte fenotyper, de mirnas som ble nedregulert i kliniske prøver og Top-40 rangert i fenotype skjermen (MIR-150, MIR-375, miR23b, MIR-138, speil 139-5p og MIR-9) ble utsatt for detaljert funksjonsanalyse ved hjelp av HCT116, HT29, LS174T TR4, DLD1 TR7 og SW480 tykktarmskreft cellelinjer. Vi har nylig publisert en detaljert funksjonell analyse av MIR-139-5p og dermed MIR-139-5p var ikke inkludert i disse analysene [25]. Ektopisk ekspresjon av MIR-375, MIR-9 og MIR-138 signifikant reduksjon i levedyktigheten av mer enn en cellelinje (MTT reduksjon ved 20% og p≤0.05) (figur 2A (HCT116) og fig S2), er mulig på grunn til en generell anti-proliferativ eller pro-apoptotiske rollen til disse miRNAs. MIR-150 og Mir-23b bare redusert levedyktigheten til en cellelinje (DLD1 TR7). Av de øvrige mirnas, ble MIR-375 identifisert som en apoptose som induserer mirnas i high-throughput skjerm. For å validere dette funnet, gjennomførte vi LDH og caspase 3/7 analyser i transfekterte CRC cellelinjer. MiR-375 økte Caspase 3/7 aktivitet og viste sammenfallende økning i cellulær død (LDH-frigivelse) i både HCT116 og DLD1 TR7 (Fig 2B og C, og fig S3). Videre kan apoptotisk død indusert av MIR-375 inhiberes med z-DEVD-FMK (Caspase 3/7 inhibitor) (figur 2D) som viser at den induserte apoptose er avhengig av Caspase 3/7 aktivitet. Som konklusjon, bekreftet validerings analyse anti-proliferative rolle MIR-9 og MIR-138, og den apoptose induserende kapasitet av MIR-375 som er identifisert i high-throughput-analyse. Ovennevnte mirnas har tidligere vist seg å være dys-regulert i kreft hos mennesker og for å redusere spredning og /eller indusere apoptose
in vitro plakater (Tabell S6 i File S1). MIR-375 og MIR-138 er ikke funksjonelt preget i detalj i CRC. Til slutt, MIR-375, MIR-138 og MIR-9 ble valgt ut for videre analyse på grunn av deres nedregulering i kliniske prøver og deres evne til å indusert fenotypiske endringer
in vitro
.
( A) Cellular levedyktighet (MTT analyse): data er presentert som ± sd. av minst 3 uavhengige eksperimenter hver med tre biologiske replikater og normalisert til Scr. * P-verdi 0,05 og MTT reduksjon 20%. (B) Cellular død (LDH-frigivelse-analyse): Den cellulære død ble uttrykt som prosentandelen av frigjort LDH ut av totalt cellulært LDH. I det minste to uavhengige eksperimenter ble utført og utført i tre paralleller. Resultatet av en representant eksperimenter ± sd. er vist. * P-verdi 0,05. (C) Induksjon av apoptose (Caspase 3/7 aktivitet): Den Caspase 3/7 aktivitet i lysatet av pre-miRNA transfekterte celler ble undersøkt ved hjelp av fluorometrisk kinetisk analyse og uttrykt i forhold til den Caspase 3/7 aktivitet i «Scr» transfektert celler. Data er presentert som ± SD. på minst 2 uavhengige eksperimenter hver med tre biologiske replikater. * P-verdi 0,05. (D) Hemming av MIR-375 indusert apoptose av caspase 3/7 inhibitor z-DEVD-FMK. Caspase 3/7 aktivitet ble målt som beskrevet i (C). Z-DEVD-FMK (DEVD) (25 uM) ble tilsatt til cellene seks timer etter transfeksjon. Ikke behandlede celler (NT), Lipofectamine bare (Lipo) og pre-Mir miRNA forløpermolekyler-negativ kontroll # 1 (SCR) ble inkludert som negative kontroller i alle analyser. De forhånds MIR-145 transfekterte celler ble inkludert som en positiv kontroll for gjennomføring av MTT-analysen. (E) for nedregulering av MIR-375 er et resultat av redusert ekspresjon i epitelceller svulsten. Uttrykk av MIR-375 i laser capture microdissected kolorektal kreft vev. Uttrykket ble analysert i epitel og stromale celler fra sammenkoblede kolorektal adenokarsinomer (n = 3) og tilstøtende normal (n = 3) kolon mukosa LCM biopsier ved hjelp av RT-qPCR. Kolonnene representerer bety uttrykk i tre prøver ± sd.
Påvisning av MIR-375, MIR-138 og MIR-9 i laser microdissected kolorektal vev
For å belyse den cellulære opprinnelse av MIR-375, MIR-138 og MIR-9, målte vi til uttrykk i laser fanget microdissected kolorektal adenokarsinomer og tilstøtende normalt tykktarmsslimhinnen (Figur 2E og figur S4). Disse analysene viste at i normal tykktarmsslimhinne MIR-375 ble uttrykt på et høyere nivå i epitelcellene enn i stromaceller (p = 0,02) (figur 2E). Mens i adenokarsinom MIR-375 ble uttrykt på sammenlignbare nivåer i epitelceller og stromale celler (p = 0,27). I tillegg MIR-375-ekspresjon i normale epitelceller var signifikant høyere enn ekspresjon i epitelceller fra adenokarsinom (p = 0,03). Samlet indikerer disse resultater at nedregulering av MIR-375 i CRC er et resultat av en reduksjon i den MIR-375-ekspresjon i epitel-celler i tumoren. MIR-9 og MIR-138 ble uttrykt hovedsakelig av stromale celler fra både normal tykktarm slimhinnen og adenokarsinomer (figur S4). Disse resultatene er i samsvar med tidligere publiserte miRNA uttrykket profiler av laser-microdissected normal slimhinne, adenomer og adenokarsinomer [34].
