Abstract
oksidativt stress-modulert signalveier har vært innblandet i kreftutvikling og terapi motstand. Linsen epitel avledet vekstfaktor p75 (LEDGF /p75) er en transkripsjons ko-aktivator som fremmer resistens mot stress-indusert celledød. Dette proteinet har blitt implisert i inflammatoriske og autoimmune tilstander, HIV-AIDS og kreft. Selv LEDGF /p75 fremstår som en stress overlevelse oncoprotein, det er knappe opplysninger om sitt uttrykk i humane tumorer. Denne studien ble utført for å evaluere sitt uttrykk i et omfattende panel av kreft hos mennesker. Avskrift uttrykk ble undersøkt i Oncomine kreft genet microarray database og i en TissueScan Cancer Survey Panel kvantitativ polymerase chain reaction (Q-PCR) array. Protein uttrykket ble vurdert ved immunhistokjemi (IHC) i kreft microarray (TMA) som inneholder 1735 vev som representerer én eller replikere kjerner fra 1220 enkeltsaker (985 svulst og 235 normalt vev). Totalt 21 store krefttyper ble analysert. Analyse av LEDGF /p75 transkripsjon uttrykk i Oncomine datasett avdekket betydelig oppregulering (tumor vs. normal) i 15 av 17 krefttyper. Den TissueScan Cancer Q-PCR rekke avdekket betydelig forhøyet LEDGF /p75 transkripsjon uttrykk i prostata, tykktarm, skjoldbruskkjertelen, og brystkreft. IHC analyse av TMA viste signifikante økte nivåer av LEDGF /p75 protein i prostata, tykktarm, skjoldbruskkjertel, lever og livmor svulster, i forhold til tilsvarende normalt vev. Forhøyet avskrift eller protein uttrykk for LEDGF /p75 ble observert i flere krefttyper. Disse resultatene videre etablere LEDGF /p75 som en kreft-relaterte protein, og gi en begrunnelse for videre undersøkelser med sikte på å forstå den kliniske betydningen av sitt uttrykk i spesifikke menneskelige kreft
Citation. Basu A, Rojas H, Banerjee H, Cabrera IB, Perez KY, De León M, et al. (2012) Uttrykk for stressrespons oncoproteinet LEDGF /p75 i Human Cancer: En studie av 21 tumortyper. PLoS ONE 7 (1): e30132. doi: 10,1371 /journal.pone.0030132
Redaktør: John R. Battista, Louisiana State University and A M College, USA
mottatt: 10 juni 2011; Godkjent: 09.12.2011; Publisert: 19 januar 2012
Copyright: © 2012 Basu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institutes of Health (NIH) Nasjonalt senter på minoritetshelse og helseforskjeller [NIH-NCMHD 5P20MD001632 (MDL, CAC)]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en voksende mengde bevis støtter den sentrale hypotesen om at en utvidet tilstand av mobilnettet oksidativt stress (Ascos) er en viktig medvirkende faktor til kreftutvikling [1], [2]. Mulige triggere av Ascos inkluderer livsstil og miljø-relaterte faktorer som kosthold, infeksjoner, røyking, alkohol og miljøgifter [3]. Ascos forårsaker skade på DNA, proteiner og lipider, så vel som aktivering av spenning transkripsjonsfaktorer, noe som fører til aktivering av stress, antioksidant, inflammatorisk, og pro-overlevelsesreaksjonsveier som bidrar til ondartet transformasjon, cellesyklus deregulering, motstand mot celledød og terapi, invasjon, angiogenese, metastase og [1], [2].
LEDGF /p75 er en stressrespons protein som fremmer celleoverlevelse i nærvær av miljømessige stressfaktorer som induserer ascos, slik som kjemoterapi, stråling , varme, og serum sult [4] – [7]. LEDGF /p75 er også kjent som transkripsjon ko-aktivator p75 [8], PC4 og SFRS1 samspill protein (PSIP1) [9], og tett fint flekkete autoantigen av 70 kD (DFS70) [10]. Det har blitt implisert i inflammasjon, autoimmunitet HIV-1-replikasjon, og kreft [10] – [17]. Den spenning overlevelses egenskaper LEDGF /p75 synes å være knyttet til dens evne til å binde spesifikke transkripsjonsfaktorer og letter transaktivering av stress, inflammatorisk, antioksidant, og cancerassosierte gener [18] – [23]. LEDGF /p75 (530 aminosyrer) og dets mindre karakteriserte alternative spleisevariant, LEDGF /P52 (333 aminosyrer), er utledet fra LEDGF /PSIP1-genet [8], [9], [24]. LEDGF /P52 svarer til N-terminale aminosyrene 1-325 av LEDGF /p75, og inneholder et ekstra intron-avledet 8 aminosyre-tail [25]. Vår gruppe tidligere rapportert at LEDGF /p75 er oppregulert i kreftceller i forhold til normale celler, og at LEDGF /P52 uttrykkes i relativt små mengder i kreftceller, induserer apoptose når ectopically uttrykt, og antagoniserer de pro-overlevelse funksjoner av LEDGF /p75 [7], [16], [25].
Flere bevislinjer støtter den siste fremveksten av LEDGF /p75 som et oncoprotein i human cancer. For eksempel er LEDGF /p75 et mål for translokasjon i leukemier, noe som resulterer i LEDGF /NUP98 fusjonsproteiner med forbedret aktivitet [23], [26] – [29]. Dens mRNA-ekspresjon ble funnet å være oppregulert ved støt fra kjemoterapi-resistente akutt myelogen leukemi pasienter, og dens ektopisk overekspresjon beskyttet leukemiceller mot medikament-indusert celledød [30]. LEDGF /p75 platformer Menin blandet avstamning leukemi (MLL) transkripsjonsfaktor komplisert å kromatin å aktivere leukemogenesis [23]. Vår gruppe rapporterte tidligere at LEDGF /p75 er et autoantigen i prostatakreft (PCA), med forhøyet protein uttrykk i prostata tumorvev [16]. Vi observerte også at det er utenfor livmoren overekspresjon fremmet cellular overlevelse mot stress-indusert død i HepG2 lever kreftceller [7], og svekket docetaxel-indusert lysosomal celledød i PCA celler [31]. Daugaard et al. [17] rapporterte forhøyet LEDGF /p75 transkripsjon uttrykk i menneskelig bryst og blære kreft, og at dens ektopisk overekspresjon i brystkreftceller beskyttet mot narkotika-indusert lysosomal celledød og økt tumorigent potensialet i kreftcellene i murine modeller. Nylig ble det funnet forhøyede gonadotropiner vist å forbedre LEDGF /p75-avhengig aktivering av VEGF-C uttrykk, forsterke lymphangiogenesis og angiogenese av ovarietumorer [32].
Selv om avskrift uttrykk for LEDGF /p75 ble rapportert å være oppregulert i leukemi, brystkreft, blærekreft og [17], [30], er utført immunhistokjemisk (IHC) ekspresjon analyse av protein i humane tumorvevet bare for PCa [16]. Den nye rollen LEDGF /p75 som en stress overlevelse oncoprotein førte oss til å gjennomføre en omfattende analyse av mRNA og protein uttrykk i 21 store humane tumortyper, ved hjelp av kreft genet microarray databaser, TissueScan Cancer Q-PCR matrise, og IHC analyse av vev mikromatriser (TMA). Denne studien gir bevis for at LEDGF /p75 er selektivt oppregulert i humane kreftformer.
Materialer og metoder
Bioinformatikk Analyse av Oncomine Cancer Gene Microarray Database
For sammenligning av LEDGF mRNA uttrykk mellom tumor og normalt vev, valgte vi datasett fra Oncomine database (Compendia biovitenskap, Ann Arbor, MI, USA; www.oncomine.org). Disse datasett, som inneholder genet mikromatriser kreft og tilsvarende sykdomsfrie normale og /eller normale tilstøtende vev, forutsatt fold-endringsdata for genuttrykk (tumor vs normal), med p-verdier beregnet ved t-tester. Det bør nevnes at datasettene undersøkte ikke var spesifikk for LEDGF /p75, men forutsatt genekspresjonsdata for LEDGF /PSIP1-genet, som gir opphav til både p75 og P52 spleisevarianter. En totalt 81 datasett ble undersøkt for LEDGF /PSIP1 avskrift uttrykk for følgende kreftformer: blære (2 datasett), bryst (9 datasett), livmorhalsen (2 datasett), tykktarm og endetarm (3 datasett), spiserør (3 datasett), nyre (6 datasett), hode og hals (8 datasett), lever (2 datasett), lunge (9 datasett), lymfom (3 datasett), eggstokk (6 datasett), bukspyttkjertel (6 datasett), prostata (13 datasett), spyttkjertel (1 datasett), hud (5 datasett), mage (2 datasett) og livmor (1 datasett). Ingen microarray data var tilgjengelig for LEDGF /PSIP1 transkripsjon uttrykk i kreft i galleblæren, tynntarmen, og skjoldbruskkjertelen.
Menneskelig «TissueScan Cancer Survey Panel» Q-PCR Array
Vi brukte menneskets TissueScan Cancer Survey Panel 96-i «Q-PCR array (CSRT-101, OriGene Technologies Inc., Rockville, MD, USA) for intern analyse av LEDGF /p75 mRNA uttrykk i 96 vev som dekker 8 store kreft hos mennesker ( bryst, tykktarm, nyre, lever, lunge, ovarie, prostata, skjoldbruskkjertel og). Denne rekken besto av første-tråd komplementær DNA (cDNA) fra 9 individuelle tilfeller av hver krefttype og 3 tilfeller av tilsvarende normale tilstøtende vev. Produsenten gitt begrenset pasient clinicopathological informasjon (alder, kjønn, tumorstadium, pTNM scenen), uten pasient identifikatorer.
Q-PCR ble utført i 96-brønners PCR array-plater (OriGene) ved hjelp av MyiQ termosykleren (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med primere som er spesifikke for den LEDGF /p75 spleisevariant (forover 5′-TGCTTTTCCAGACATGGTTGT-3 «og 5′-revers CCCACAAACAGTGAAAAGACAG-3′), og iQ SYBR grønn Supermix (Bio- Rad). I korte trekk ble 30 pl av PCR-blanding, som omfattet 15 ul av 2 x konsentrat-blanding, 13 ul dobbeltdestillert vann og 1 pl av hver av forover og revers primere (10 pmol /ul), tilsatt til hver av de 96 brønnene av PCR-array-plater. PCR-amplifikasjon ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. mRNA-ekspresjon ble normalisert ved hjelp av ekspresjonen av husholdningsgenet humane beta-aktin, som primere (forover 5»-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3 «og 5′-revers AGGTCCAGACGCAGGAT GGCATG-3») ble levert i TissueScan Cancer Q-PCR kit matrise ved en konsentrasjon på 10 pmol /ul. For dataanalyse ble ΔΔCt metode som brukes. Brett endringer ble beregnet som differansen i genuttrykk mellom svulster og tilsvarende normale tilstøtende kontroller.
RNA interferens-mediert knockdown av LEDGF /p75
PC-3 prostata kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket som anbefalt av leverandør i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. Forbigående knockdown av LEDGF /p75 i PC-3-celler ble utført ved anvendelse av Amaxa nucleofection metode (Amaxa, Lonza) som tidligere beskrevet [21]. LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) og egge siRNA duplex (siSD, negativ kontroll) ble syntetisert ved Integrerte DNA Technologies (IDT). Den siLEDGF /p75-sekvensen tilsvarte nukleotidene 1340-1360 (5′- AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 «) i forhold til det første nukleotidet til startkodonet av den LEDGF /p75 åpen leseramme [21]. Denne sekvensen korresponderer til en region i den C-terminale ende av LEDGF /p75 ikke deles av LEDGF /P52. Sekvensen for siSD var 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 «[21]
Antistoffer og Immunoblotting
Følgende antistoffer ble brukt. Mus monoklonale anti-β-aktin (Sigma-Aldrich), og anti-LEDGF (1:1000, BD Biosciences); kanin polyclonals anti-LEDGF /p75 (1:1000, Novus Biologicals); anti-LEDGF /p75 (1:1000, Bethyl); og pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundære IgG-antistoff (Zymed). Vi har også brukt en LEDGF /p75-spesifikt kanin polyklonale antistoff som ble utviklet ved W.M. Keck Autoimmune Disease Center of The Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA). Dette kanin-antistoff, opprinnelig betegnet anti-DFS /LEDGFp75 # 5087 antistoff (heretter referert til som Scripps-Ab5087), ble reist mot et rekombinant, avkortet DFS70 protein som genereres fra en partiell cDNA-klon, pDFS6.1, som kodet for den C-terminale region av LEDGF /p75 [10]. For å identifisere et antistoff som er spesifikk bare for den LEDGF /p75 spleisevariant, undersøkte vi reaktiviteten av alle de ovennevnte kommersielle og ikke-kommersielle LEDGF antistoffer ved immunoblotting ved bruk av cellelysatene fra PC-3-celler med siSD og siLEDGF /p75.
Immunoblotting ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [21]. I korthet totale proteiner fra PC3-celler med siSD og siLEDGF /p75 ble separert ved SDS-PAGE (4-12% NuPAGE, Invitrogen) etterfulgt av overføring til polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Millipore). Membranene ble blokkert med 5% tørrmelk oppløsning i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 1 time og probet med primære antistoffer. Etter flere vaskinger med TBS-T, ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer i 30 minutter og deretter vasket på nytt med TBS-T. Proteinbånd ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Amersham).
Immunhistokjemisk analyse av kreftvev Mikromatriser
Menneskelige kreft microarray (TMA), kommersielt tilgjengelige fra National Disease Forskning Interchange (NDRI, Philadelphia, PA , USA), IMGENEX Corp (San Diego, California, USA) og US Biomaks Inc. (Rockville, MD, USA), ble brukt for IHC analyse av LEDGF /p75. Flere forskjellige TMA ble brukt til å øke antallet tumor vevstyper og prøvestørrelsen (tabell 1). Kort, kjøpte vi NDRI omfattende pan-kreft TMA inneholder dupliserte kjerner av 642 unike tilfeller (522 tumorvev av 20 store krefttyper og 120 sykdomsfrie normale og /eller normale tilstøtende eksemplarer) i en 5 lysbildeserie (TS-en, TS -2, TS-3, TS-4 og TMA5). Hver av pan-kreft TMA IMH-326, IMH-327 og IMH-328 (IMGENEX Corp), inneholdt 59 eksemplarer av ulike krefttyper, mens TMA IMH-336, IMH-337 og IMH-338 (IMGENEX Corp.) inneholdt tilsvarende 59 matchet normale tilstøtende vev.
Vi brukte også TMA IMH-303 (IMGENEX Corp.), som inneholder 40 PCA vev og 9 matchet normale tilstøtende vev. Åtte ytterligere TMA fra US Biomaks ble anvendt, hver inneholdende multiple vevsprøver av en enkelt tumortype (bryst, tykktarm, nyre, lunge, lever, bukspyttkjertel, prostata, skjoldbruskkjertel), så vel som tilsvarende sykdomsfrie normal kontroll og /eller normal tilstøtende vev. Produsentene av disse TMA tilgjengelig begrenset basis clinicopathological informasjon (alder, kjønn, tumorstadium i noen tilfeller) som korresponderer med vevet kjerner, uten pasient identifikatorer. Ingen informasjon var tilgjengelig på pasienten rase eller etnisk opprinnelse, neo-adjuvant behandling, kirurgisk teknikk, år, kirurgi, institusjoner som har samlet inn vev, antall institusjoner, følge opp rutiner og vev håndtering teknikker. Den begrensede pasienten følger opp data knyttet til TMA forhindret Kaplan-Meier overlevelsesanalyse.
TMA ble farget ved hjelp av en Biogenic i6000 auto-Stainer (Biogenex Corporation, Fremont, CA, USA) som beskrevet tidligere [16] , [33]. Kort fortalt ble parafin vevssnitt i TMA lysbilder deparaffinized og lysbildene ble nedsenket i Citra-Plus antigen henting løsning (Biogenex Corp.). Antigen gjenfinning ble utført ved mikrobølgeovnen lysbildene i 2 min ved 100% effekt, etterfulgt av 10 min med 20% effekt. Objektglass ble deretter avkjølt i antigenet henting løsning i 20 minutter. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset ved behandling med 3% hydrogenperoksid i 10% metanol, og kraftblokk © universell sperre reagens (Biogenex Corp.) ble anvendt for å blokkere ikke-spesifikk proteinbinding.
TMA-objektglass ble inkubert over natten med Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75-antistoff [16], etterfulgt av 3 vaskinger i PBS. Platene ble deretter inkubert med Flerledds © biotinylert sekundært antistoff (Biogenex Corp.) i 20 minutter, fulgt av inkubering med streptavidin-peroksydase koblet super Etikett © (Biogenex Corp.) i 20 minutter. Farging ble oppdaget av peroksidase aktivering av 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) chromagen (Biocare Medical, Concord, CA, USA). TMA ble kontra lett med hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO, USA) og montert med Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). For negativ kontroll det primære antistoff ble utelatt og erstattet med kanin pre-immunserum. Vevssnitt ble undersøkt under et Olympus BX50 mikroskop, og bildene ble anskaffet ved hjelp av en digital Spot RT3 ™ -kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). Immunostained TMA ble scoret blindt for LEDGF /p75 immunoreaktivitets av et styre sertifisert patolog. En fire-lags poengsystem (0 = negativ 1 = svak 2 = moderat 3 = sterk) ble anvendt for å vurdere fargeintensitet. Vev med score til 0-1 ble vurdert til å ha lav intensitet flekker, mens vev med score til 2-3 ble ansett å ha høy intensitet farging. Vevsprøver som viste dårlig kvalitet ble ekskludert fra analysene. Disse studiene ble utført under godkjenning av Institutional Review Board.
Statistical Analysis
t-test ble brukt for å vurdere betydningen av endringen i mRNA uttrykk mellom svulsten og normal tilstøtende kontroll prøvene i TissueScan Cancer Q-PCR matrise. Statistisk analyse av IHC data og deres forhold til pasientens kliniske resultater ble utført ved anvendelse av SAS software-pakke (versjon 9.2; SAS Institute). For enkel statistisk analyse, ble vevsprøver gruppert i to kategorier basert på deres score. «Low» farging ble bestemt som sammenslåtte fargeintensitet score til 0 og 1, mens «høy» flekker hadde samlet score på 2 og 3. Forskjell i uttrykk nivåer av LEDGF /p75 protein mellom tumorer og normalt vev ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test.
for å kontrollere for falske positiver, som kan oppstå i flere-hypoteser-testing studier, falske funnrate (FDR) justerte p-verdier ble også beregnet. FDR er en kvantifisering av feil brukes ofte i flere sammenligninger. Den styrer den forventede andel av feilaktig avvist nullhypotese. Med andre ord, styrer FDR brøkdel av positive deteksjoner som er falsk. Sammenhenger mellom uttrykk nivåer av LEDGF /p75 og clinicopathological parametere ble bestemt ved hjelp av Fishers eksakte test (for alder og kjønn) og Kendalls tau korrelasjonsanalyse (for svulst scenen). Sannsynlighetsverdier
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Reproduserbarhet gjentatte kjerner ble vurdert av Cochran-Mantel-Haenszel test som testet for homogenitet mellom replikater.
Resultater
LEDGF /p75 transkripsjon er oppregulert i ulike humane krefttyper
i silico-analyse av LEDGF /PSIP1 mRNA-ekspresjon i kreftvev ble utført ved anvendelse av kreft genet microarray datasett fra databasen Oncomine at sammenlignet cancervev i normale vev (enten sykdomsfrie normal og /eller normal ved siden av). Som oppsummert i tabell 2, har vi observert en statistisk signifikant (
P
0,05) oppregulering av LEDGF /PSIP1 karakter i noen av de tilgjengelige mikroarray datasett fra kreft i bryst, livmorhals, tykktarm, spiserør, nyre, hode og hals, lever, lunge, lymfom, eggstokk, bukspyttkjertel, prostata, spyttkjertel, hud, og mage. Den sammenleggbare økningen var større enn 2 i kreft i bryst, livmorhals, hode og nakke, nyre, hud, mage og (tabell 2). Økningen var beskjeden (mellom 1 og 2) i colorectal, esophageal, lever, lunge, eggstokk, bukspyttkjertel, prostata, og spyttkjertel kreft. ble oppdaget Ingen endringer i LEDGF /PSIP1 transkripsjon uttrykk i blæren (5 datasett) og livmor (1 datasett) kreft. Ingen av de ovennevnte 17 krefttyper viste betydelig nedregulering av LEDGF /PSIP1 transkript i en hvilken som helst datasettet. Ingen datasett var tilgjengelig sammenligne svulst vs vanlig uttrykk for LEDGF /PSIP1 avskrift i galleblære, tynntarm og skjoldbrusk kreft.
uttrykk for LEDGF /p75 avskrift ble videre undersøkt eksperimentelt i åtte solide tumortyper (bryst, tykktarm, nyre, lever, lunge, eggstokk, prostata og skjoldbruskkjertel) ved hjelp av TissueScan Cancer Q-PCR matrise, som inneholdt kreft vevsprøver fra 12 individuelle donor tilfeller (n = 9 for hver krefttype, n = 3 for tilsvar normalt vev). Primere som var spesifikke for LEDGF /p75 ble anvendt i disse forsøkene. Som vist i figur 1, er en statistisk signifikant (
P
0,05) oppregulering av LEDGF /p75-transkript ble observert i prostata (2,38 fold,
P
= 0,002), thyroid (1,85 fold
P
= 0,031), bryst (2,26 ganger,
P
= 0,037) og kolon (2,04 ganger,
P
= 0,047) kreft. Selv om nivået av LEDGF /p75-transkript ble forhøyet ( 1,02 ganger) i andre krefttyper (med unntak av leverkreft) brette forandringene var ikke statistisk signifikant. Leversvulster viste en svak downregulation (-1,24 ganger) i LEDGF /p75 avskrift uttrykk, men nedgangen var statistisk ubetydelig.
Data ble analysert ved hjelp av ΔΔCt metoden med verdier normalisert til p-aktin nivåer. Y-aksen representerer den induksjon fold av LEDGF /p75 mRNA-nivå i åtte krefttyper (n = 9) sammenlignet med samsvarende normale tilstøtende vev (n = 3) i matrisen. Feilfelt viser omfanget av standard feil. *
P
0,05.
P
verdier ble bestemt med t-test.
Valg av LEDGF /p75-spesifikke antistoffer for IHC
For å identifisere et antistoff som er spesifikk for LEDGF /p75, og som kan brukes av IHC å vurdere uttrykket nivåer av dette proteinet i kreft TMA, vi evaluert ved immunoblotting spesifisiteten av tiden tilgjengelige anti-LEDGF antistoffer. Tre kommersielt tilgjengelige anti-LEDGF antistoffer (Bethyl, BD og Novus) og en ikke-kommersiell antistoff (Scripps-Ab5087) mot LEDGF ble undersøkt ved immunblotting i PC-3-celler med og uten forbigående knockdown av proteinet (figur 2). PC-3-celler transfektert med siSD tjente som kontroll. Immunoblotting analyse indikerte at alle de 3 kommersielle antistoffer mot LEDGF reagert med både p75 og P52 varianter. Men Scripps-Ab5087 antistoff påvises bare LEDGF /p75 og ble derfor valgt for IHC studier.
Celler ble transfektert med siLEDGF /p75 induserer forbigående knockdown av LEDGF /p75. PC-3 celler transfektert med lite forstyrrende egge RNA duplex (siSD) servert som tilsvarende kontroll. Immunoblotting analyse testes den spesifikke reaktiviteten av alle antistoffer mot LEDGF /PSIP1. Alle blot parene (siSD og siLEDGF /p75) for hvert antistoff ble avledet fra samme blot.
LEDGF /p75 protein er overuttrykt i forskjellige menneskelige krefttyper
Vi utførte IHC analyse av LEDGF /p75 protein uttrykk i tumorvev ved hjelp av et omfattende panel av TMA som inneholder hele 2330 vev kjerner, inkludert 1754 svulster vev kjerner fra over 35 store typer kreft hos mennesker og tilsvarende 576 ikke-tumor (normal og ikke-kreft inflammatorisk ) vev kjerner (tabell 1). Vi ekskludert fra vår statistisk analyse slike tumortyper som hadde mindre enn 5 tumorvev kjerner eller /og hadde ingen tilsvarende ikke-tumorvev. De ikke-kreft inflammatorisk vev kjerner ble også ekskludert fordi ikke alle krefttyper hadde tilsvarende inflammatorisk vev. Noen vev kjerner kunne ikke scoret på grunn av dårlig vev kvalitet. Til slutt ble 21 tumortyper inkludert i statistiske analyser (tabell 3). Disse omfattet totalt 1735 vev som representerer én eller replikere kjerner fra 1220 individuelle giver tilfeller med 985 kreftsaker og 235 ikke-krefttilfeller.
Resultatene fra IHC analyse av sammenslåtte score for LEDGF /p75-proteinet uttrykket (dvs. høye = score 2-3 vs lave = score 0-1) i tumorvev sammenlignet med normalt vev er vist i tabell 3. det var signifikant overekspresjon av LEDGF /p75-protein i prostata, tykktarm, skjoldbruskkjertel, leveren, og livmor tumorer (
P
0,05) (tabell 3 og figur 3). Forhøyede uttrykk nivåer i brystsvulster kom nær statistisk signifikans (
P
= 0,087). Korrigert for forekomst av falske positiver, bare prostata, ble skjoldbruskkjertelen, og lever svulster funnet å vise betydelig overekspresjon av LEDGF /p75 protein (FDR justert
P
0,05).
Tissue microarrays ble farget med antistoff mot LEDGF /p75, og de enkelte kjernene ble blindt scoret ved hjelp av følgende skala: 0 = ingen farging, 1 = lav farging, 2 = moderat farging, 3 = sterk farging. Scoret vev ble samlet inn i to grupper: lav flekker (score 0 og 1, mørke barer) og høy flekker (score 2 og 3, lys barer). Prosentandelen av prøvestykkene i de to fargekategorier ble plottet for tumorvev sammenlignet med normalt (inkludert sykdomsfrie vanlige og normale tilstøtende vev). *
P
0,05; **
P
0,01.
P
verdier ble bestemt med Fishers eksakte test.
Prosentandelen av tumorvev med høy (score 2-3) LEDGF /p75 protein uttrykk var 70,5% i skjoldbruskkjertelen, 68% i lever, 38,3% i prostata, 30,2% i livmor, og 25% i tykktarm kreft, sammenlignet med 12,5%, 31,3%, 0%, 0%, og 6,3% henholdsvis i de tilsvarende normale vev (tabell 3) . Det var fire typer kreft (bryst, cervix, eggstokk, og spyttkjertel) hvor frekvensen av tumorer som viser høy LEDGF /p75 protein ekspresjon var omtrent 20% eller større, og de tilsvarende normale vev viste liten eller ingen ekspresjon av proteinet. Men når vi sammenlignet forskjeller i LEDGF /p75 uttrykk (høy vs lav uttrykk) mellom svulst og normalt vev,
P
verdier nådde ikke signifikans. Interessant, når vi sammenlignet forskjeller mellom tumor og normalt vev med hensyn til LEDGF /p75 uttrykk (score 1-3) vs ingen uttrykk (0 poeng),
P
verdier for brystkreft og livmorhalskreft nådd betydning (
P
0,05, data ikke vist). Sammenligning av de replikere kjernene viste ingen signifikant forskjell (
P
= 0,6226) mellom gjentak, noe som tyder på høy reproduserbarhet mellom replikere kjerner.
Figur 4A viser representative tumorvev kjerner immunostained med Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75 antistoff. De representative IHC bildene samsvarer med prostata, tykktarm, og vev kjerner thyroid tumor med lav (score 0-1) og høy intensitet (score 2-3) farging. Som nevnt ovenfor, er disse tre tumortyper viste betydelig oppregulering av både transkripsjon (TissueScan Cancer Q-PCR array) og protein (IHC). Figur 4B viser representative IHC bilder av sykdomsfrie normal prostata og tykktarm vev (fra ikke-kreft donorer), så vel som prostata og kolon tumorprøver med deres matchede tilstøtende vev. Den skjoldbruskkjertelkreft TMA ikke har matchet tilstøtende vev for spesifikke skjoldbruskkjertelen svulster. Det ble observert at de «normale» vev tilstøtende til prostata og tykktarm tumorvev hadde moderat LEDGF /p75 flekker, sammenliknet med forholdsvis lav intensitet farging av sykdomsfrie normale vev. En annen interessant observasjon var at LEDGFp75 farging ble distribuert i både kjernen og cytoplasma i de fleste kreft undersøkte vev.
A. Representative bilder av immunhistokjemisk farging (lav intensitet, score 0-1, høy intensitet, score 2-3) for LEDGF /p75 i prostata, tykktarm, og skjoldbrusk svulster (Scale bar-40 mikrometer; forstørrelse = 200 ×). B. Representative bilder av LEDGF /p75 farging av ikke-sykdoms normal prostata og tykktarm vev, og i tumorvev og deres matchet tilstøtende vev (Scale bar-40 mikrometer; forstørrelse = 400 ×). TMA ble farget med LEDGF /p75 spesifikt kanin antistoff Scripps-Ab5087, som indikert i materialer og metoder. Identiske kamerainnstillingene ble brukt i innsamling og prosessering av bilder for en bestemt vevstype.
De tilgjengelige clinicopathological karakteristikker av pasienter med krefttyper viser betydelig LEDGF /p75 overekspresjon er oppsummert i Tabell 4. Antall av vevsprøver for tykktarm og prostata kreft er forskjellig i settene diskutere alder og kjønn på grunn av manglende data i den kommersielt tilgjengelige TMA. Data om alder manglet for 4 kjerner i prostatakreft TMA mens data om sex manglet for 2 kjerner i tykktarmskreft TMA. Korrelasjon mellom disse egenskaper og LEDGF /p75 protein ekspresjon avslørte at overekspresjon av dette proteinet i leveren og skjoldbruskkjertel tumorer var signifikant assosiert med yngre alder (
P
0,05) (tabell 4). Median alder av pasienter som er representert i TMA var 62 år for tykktarmskreft, 53 år for leverkreft, 66 år for prostatakreft, 48 år for skjoldbruskkjertelkreft og 70 år for livmorkreft. Ingen av de fem tumortyper oppviste signifikant sammenheng mellom økt LEDGF /p75 ekspresjonen, kjønn eller økt TNM tumorstadiet. De begrenset pasientoppfølgingsdata knyttet til TMA utelukket korrelere LEDGF /p75 uttrykk med pasientoverlevelses utfall.
Den kryssplattform analyse av LEDGF /p75 uttrykk i ulike humane tumortyper er oppsummert i Tabell 5. transkripsjon og proteinuttrykk for hver tumortype sammenlignes på tvers av ulike plattformer brukes:. i silico, Q-PCR og IHC
Diskusjoner
Denne studien ble gjennomført som en del av vårt kontinuerlige arbeid med å forstå de biologiske og kliniske betydningen av LEDGF /p75 uttrykk i menneskelig kreft. Våre resultater indikerte betydelig oppregulering av både LEDGF /p75 transkripsjon og protein i prostata, tykktarm og skjoldbruskkjertelen svulster, utledes ved analyse av karakterutskrift uttrykk i Oncomine kreft genet microarray database (når tilgjengelige data) og TissueScan Cancer Q-PCR array, og analyse av protein uttrykk ved IHC i TMA. Den observerte oppregulering av LEDGF /p75 i prostatakreft er i tråd med våre tidligere rapporter om at dette proteinet er målet for autoantistoffer hos noen pasienter med PCA er oppregulert i begge PCA cellelinjer og vev, og fremmer chemoresistance i PCA cellelinjer når ectopically overexpressed [16], [31].
Betydelig oppregulering av LEDGF /PSIP1 transkripsjon ble også observert hos noen Oncomine datasett for kreft i bryst, livmorhals, spiserør, nyre, hode og nakke, lever, lunge, lymfom, eggstokk, bukspyttkjertel, spyttkjertel, hud, og mage. Men bare fire av åtte tumortyper (prostata, tykktarm, bryst og skjoldbruskkjertelen) viste signifikant oppregulering av LEDGF /p75 avskrift i TissueScan Cancer Q-PCR array. Selv om andre tumortyper (nyre, lunge, og eggstokkene) utstilt 1,02 fold LEDGF /p75 transkripsjon heving i denne tabellen, oppregulering var ikke statistisk signifikant. Disse forskjellene mellom Oncomine databasen og TissueScan Cancer Q-PCR matrise kunne tilskrives den lille utvalgsstørrelsen i de siste, metodisk /plattform variasjoner, analyse av LEDGF /PSIP1 vs LEDGF /p75, og bruk av urelaterte svulst datasett. [17].
