Abstract
Bakgrunn
kreft i bukspyttkjertelen stamceller (cscs) representerer en liten undergruppe av kreft i bukspyttkjertelen celler som har evnen til å initiere og forplante tumordannelse. Imidlertid er de mekanismer som bukspyttkjertelen cscs vedlikeholdes ikke godt forstått eller preget.
Metoder
Expression of Notch reseptorer, ligander, og Notch signaliserer målgener ble kvantifisert i CSC og ikke- CSC populasjoner fra 8 primære humane bukspyttkjertelen xenografter. En gamma sekretase inhibitor (GSI) som hemmer Notch sti og en shRNA rettet mot Notch målet genet Hes1 ble brukt for å vurdere rollen til Notch veien i CSC befolkningen vedlikehold og bukspyttkjerteltumorvekst.
Resultater
Notch sti komponenter ble funnet å være oppregulert i bukspyttkjertelen cscs. Hemming av Notch veien ved hjelp av enten en gamma sekretase inhibitor eller Hes1 shRNA i kreft i bukspyttkjertelen celler redusert andelen cscs og tumorsphere formasjon. Omvendt, aktivering av hakk vei med en eksogen ligand Notch peptid økte prosentandelen av cscs samt tumorsphere formasjonen. In vivo behandling av ortotopiske pankreastumorer i NOD /SCID-mus med GSI blokkert tumorvekst og redusert CSC befolkningen.
Konklusjon
Notch signalveien er viktig å opprettholde den bukspyttkjertelen CSC befolkningen og er en potensiell terapeutisk mål i bukspyttkjertelkreft
Citation. Abel EV, Kim EJ, Wu J, Hynes M, Bednar F, Proctor E et al. (2014) The Notch veien er viktig å opprettholde den Cancer Stem Cell Befolkning i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10,1371 /journal.pone.0091983
Redaktør: Martin Fernandez-Zapico, Schulze Senter for Novel Therapeutics, Mayo Clinic, USA
mottatt: 06.01.2014; Godkjent: 15 februar 2014; Publisert: 19 mars 2014
Copyright: © 2014 Abel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Randy Pausch Family AACR-PANCAN Innovation Award (DMS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde vanligste årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA til tross for at den 10
th vanligste kreftdiagnose [1]. Den høye dødeligheten skyldes blant annet det faktum at de aller fleste av bukspyttkjertel kreft er diagnostisert på et avansert stadium. Men minst like viktig er at bukspyttkjertel kreft er vanligvis bare minimalt lydhør overfor kjemoterapi og strålebehandling. Det er økende bevis for at denne resistens overfor terapi er i det minste delvis på grunn av den iboende motstand av en subpopulasjon av kreftceller som er tumorigen, og deler mange egenskaper med stamceller og således blir betegnet som kreft stamceller (CSC). Cancer stamceller ble først isolert i myeloid leukemi [2] og ble vist å dele stamcelleegenskaper, slik som muligheten for selvfornyelse og evnen til å differensiere og formere seg. Senere cscs har også blitt identifisert i et bredt spekter av faste tumorer inkludert bryst, hjerne, lever, tykktarm, prostata, melanom, og pankreatiske tumorer [3] – [10] _ENREF_3. Kreft i bukspyttkjertelen stamceller (CSC) ble først isolert fra menneskelige bukspyttkjertel kreft ved hjelp av markør profilen ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ [10]. Disse markør positive cscs var i stand til å danne tumorer i NOD /SCID-mus som ble vist histologisk ligner den primære tumor, noe som tyder på multi-potens med rekonstituering av de forskjellige tumorcelletyper. In vitro bevis for en stamcelle fenotype som selvfornyelse ble demonstrert ved evnen til å danne kreftkuler
in vitro
i motsetning til ESA
– /CD44
– /CD24
– celler som ikke kunne.
Det forblir ufullstendig forstått hvordan kreft i bukspyttkjertelen stamceller blir opprettholdt i en heterogen tumor. En mulig bidragsyter til CSC vedlikehold er Notch signalveien. I de normale utviklings bukspyttkjertelen, har hakk signalveien blitt vist å være en viktig regulator av balansen mellom selvfornyelse og differensiering [11] – [13]. Det er 4 medlemmer av pattedyr Notch-reseptor-familien (HAKK 1-4) som likeledes er behandlet og aktiveres ved hjelp av en serie av hendelser spaltningspunkter. Den modne Notch-reseptor er sammensatt av to subenheter som er generert som et resultat av en innledende spalting arrangement av furin-liknende konvertase [14]. Hakk signalveien aktivering oppstår når et hakk reseptor binder seg til en av de fem kjente hakk ligander [jagged1 (JAG1), jagged2 (JAG2), delta-lignende 1 (DLL1), delta-lignende 3 (DLL3), og delta-lignende 4 (DLL4)]. Ligandbinding fører til en konformasjonsendring i reseptoren hakk som gjør det mulig for en andre spalting av tumor nekrose faktor-alfa-omdannende enzym (TACE) [15]. En tredje spaltning arrangementet er utført av et gamma-sekretase (presenilin), som frigir det intracellulære domenet av hakk slik at det å translocate til kjernen for å aktivere ekspresjon av målgener [16].
Inhibering av Notch signale pathway resulterer i utarming av fler potente bukspyttkjertelen stamceller [11], [13]. Omvendt, forhindrer indusert Notch aktivering pankreatisk epitelial differensiering, og fører til økt vedlikehold av udifferensierte bukspyttkjertelen stamceller [12]. Basert på lignende fenotypiske egenskaper utstilt ved cscs har Notch signalveien blitt evaluert for sin rolle i CSC selvfornyelse. Både bryst og hjerne cscs har vist seg å ha økt Notch pathway aktivering [17], [18]. In vitro-inhibering av Notch signalveien i de to tumortyper resulterer i redusert selvfornyelse, vist ved reduksjon i tumorsphere formasjon. Vi antok at hakket signalveien er ytterligere oppregulert i bukspyttkjertelen CSC og bidrar til bukspyttkjertelen CSC funksjon og kreft i bukspyttkjertelen tumorgenese.
I denne studien evaluerte vi rolle hakk veien i å opprettholde den CSC befolkning og dens virkning av hemning i bukspyttkjerteltumorvekst. Vi oppdager oppregulering av flere hakk sti komponenter i bukspyttkjertelen cscs og vise at hemming av en gamma sekretase inhibitor eller shRNA til Hes1, en nøkkel Notch target gen, reduserer bukspyttkjertelen CSC selvfornyelse og tumorigenicity. In vivo behandling av etablerte ortotopiske pankreastumorer med en gamma-sekretase inhibitor reduserer tumorvekst og kombinasjon med cytotoksisk kjemoterapi ytterligere forsterker anti-tumorrespons. Våre resultater tyder på at Notch signalering er avgjørende for pancreatic CSC vedlikehold og at målretting Notch signalveien i bukspyttkjertelkreft har lovende terapeutisk potensiale.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
bukspyttkjertelen adenokarsinom vevsprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgiske prosedyrer innenfor University of Michigan Health System. Skriftlig informert samtykke fra alle forsøkspersoner ble innhentet før innsamling av vev, og alle protokoller som involverer pasientprøver ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Boards ved University of Michigan Medical School (IRBMED). Original, er papirkopier av alle skriftlig informert samtykke skjemaer holdes innenfor en sikker fil ved University of Michigan. De Institutional Review Boards ved University of Michigan Medical School (IRBMED) fastslått at denne studien er i samsvar med gjeldende retningslinjer, statlige og føderale forskrifter, og University of Michigans Federalwide Assurance (FWA) med Department of Health and Human Services (HHS). Den IRBMED også godkjent alle skriftlige samtykke dokumenter, samt samtykkeprosedyrer, for denne studien. The University of Michigan Federalwide Assurance nummer for denne studien er FWA00004969, og Study University of Michigan studien identifikasjonsnummer er HUM00025339.
Antistoffer og reagenser
Merck gamma secretase inhibitor (MK-0752) var gitt av Dr. Max Wicha (University of Michigan) og ble brukt for
in vitro Hotell og
ex vivo
studier. Gamma sekretase inhibitor RO4929097 ble vennlig levert av Roche (Indianapolis, IN) og ble brukt til
in vivo
studier. PE-konjugert mus-anti-human CD44 og FITC-konjugert mus-anti-human CD24-antistoffer ble innkjøpt fra B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC konjugert mus anti-human ESA ble kjøpt fra Miltenyi Biotech og biotinylert mus anti-mus H2K ble kjøpt fra Southern Biotech. Hes1 antistoff som brukes for Western Blot ble oppnådd fra Dr. Xing Fan (University of Michigan) eller kjøpt fra MBL International (Woburn, MA). Notch1 og spaltes Notch1 antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og β-actin antistoff ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Matrigel ble kjøpt fra B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA klone V2LHS 249784 ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Deltaet /Serrate /Lag-2 (DSL) peptid (sekvens CDDYYYGFGCNKFCRPR) ble syntetisert ved University of Michigan Proteinstruktur Facility.
Protocol godkjenning
Animal protokoller ble godkjent av Universitetskomiteen for Bruk og stell av dyr (UCUCA) ved University of Michigan og lentivirus protokoller ble godkjent av Institutional biosikkerhet Committee (IBC) ved University of Michigan.
Utarbeidelse av enkeltcellesuspensjoner av kreftceller
enkelt~~POS=TRUNC celle~~POS=TRUNC av tumorceller ble fremstilt som beskrevet [10] med de følgende modifikasjoner. Primær menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom xenograft vev ble hakket helt og deretter suspendert i 200 Enhet /ml ultra kollagenase IV (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) i Medie 199 (Invitrogen, Carlsbad, California). Etter enzymbehandling ved 37 ° C i 45 til 60 minutter og mekanisk dissosiasjon ved å pipettere hvert 15. minutt med en 10 ml pipette, spaltet og dissosierte celler ble filtrert gjennom et 40 um nylonmaskecelle struping (BD Franklin Lakes, New Jersey) og vasket med HBSS (Invitrogen, Carlsbad, California) to ganger. Cellene ble deretter resuspendert i 2% FBS i HBSS for eksperimenter.
Strømningscytometri
Strømningscytometri ble utført som beskrevet tidligere [10]. Dissosierte celler ble tellet og overført til 5 ml rør, vasket med HBSS /2% FBS to ganger og resuspendert i HBSS /2% FBS ved en konsentrasjon på 1 million celler per 100 ul. Sandoglobin (1 mg /ml) ble tilsatt til prøven i en fortynning på 1:50, og prøven ble inkubert på is i 20 minutter, deretter vasket to ganger med HBSS /2% FBS. Antistoffer PE-konjugert mus-anti-humant CD44, FITC-konjugert mus-anti-human CD24, APC konjugert mus anti-human ESA og biotinylerte mus anti-mus H2K ble tilsatt ved den fortynning som beskrevet, og prøven ble inkubert i 45 min på is og deretter vasket to ganger med HBSS /2% FBS. Streptavidin konjugert med APC-Cy7 ble tilsatt ved fortynningen av 1:200 og prøven ble inkubert på is i 15 minutter. Etter vasking to ganger med HBSS /2% FBS, ble cellene resuspendert i HBSS /2% FBS inneholdende 3 mM 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Flowcytometri ble gjort ved hjelp av en FACSAria (B.D., Franklin Lakes, NJ). Side scatter og termin scatter profiler ble brukt til å fjerne celle dubletter
Kvantitativ PCR
Grunning for Notch sti komponenter ble valgt ut fra en primer bank. (Wang Seed, 2003) og syntetisert av Invitrogen (Carlsbad, California). Total RNA ble ekstrahert fra sorterte kreft stamceller og ikke-kreftstamceller med en RNeasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA) som beskrevet. Revers transkripsjon av cDNA ble utført ved hjelp av High-Capacity cDNA revers transkripsjon Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) som beskrevet. qPCR ble utført på Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) ved hjelp av en Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California) per produsentens instruksjoner, med alle reaksjoner normalisert til GAPDH. Betingelsene som ble benyttet for qPCR var 95 ° C vent i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 20 sek.
Tumorsphere kulturer
Etablert kreft i bukspyttkjertelen tumorspheres [10] ble opprettholdt i sfæren media som beskrevet tidligere [19], [20] med modifikasjoner [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, California), 1% N2 Supplement (Invitrogen, Carlsbad, California), 2% B27 supplement (Invitrogen, Carlsbad, California), 1% Antibiotika Anti-fungal (Invitrogen, Carlsbad, California), 10 ng /ml BMP4 (Sigma), 10 ng /ml LIF (Sigma), 20 ng /ml humant bFGF- 2 (Invitrogen, Carlsbad, California), alle i 01:01 DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, California)]. Tumorspheres ble passert hver 6. dag. For aging, ble tumorspheres dissosiert med 0,05% trypsin for 2-5 minutter og deretter umiddelbart vasket to ganger med 40 ml PBS. Cellene ble deretter ført gjennom en 40 mikrometer nylon mesh celle sil, telte og belagt i frisk sfære medium i Costar ultra low-vedlegg 6 brønners plater (Corning, Lowell, MA).
GSI behandling av tumorsphere celler
Tumorspheres ble dissosiert til enkeltceller og re-suspendert i sfæren medium som inneholder GSI på de angitte konsentrasjoner for de angitte tidsperioder. Celler ble så observert under et mikroskop eller høstet for analyse.
Western blotting
celler ble behandlet med eller uten GSI ved forskjellige doser ble lysert i lyseringsbuffer (20 mM Tris pH 7,5 /150 mM NaCl /12 mM EDTA /10% glyserol /1% Triton X-100) som inneholder en proteasehemmer cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved anvendelse av en Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Femti ug protein ble blandet med et likt volum av 2x ladningsbuffer SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) og kokt i 5 minutter før påføring av prøven til SDS-PAGE. Etter SDS-PAGE, ble proteinet gelen blottet på en nitrocellulosemembran Hybond C ekstra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, Pennsylvania) ved bruk av en Bio-Rad-blotting-apparat (BioRad, Hercules, CA) i en time. Blottet ble blokkert med 5% tørrmelk i TBST i en time, vasket to ganger i TBST, og deretter inkubert med antistoffer (1:1000) i 5% BSA ved 4 ° C over natten. Blottet ble vasket tre ganger i TBST og deretter inkubert med peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i 5% tørrmelk ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking tre ganger i TBST, ble blottet inkubert i 5 minutter med SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL) og røntgenfilm (Denville Scientific, Metuchen, NJ) ble deretter utviklet.
shRNA transductioin
Lentivirus konstruerer pGIPZ vektor som inneholder Hes1 shRNA eller kontroll shRNA ble gjort i Vector kjernen ved University of Michigan. Transduksjon ble utført ved hjelp av en ViraDuctin Lentivirus transduksjon Kit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, California) som beskrevet.
apoptose analysen
Tumorsphere celler transduced med kontroll eller Hes1 shRNA ble dyrket i sfæren media inneholdende 4 mikrogram /ml puromycin i 4 dager fulgt av trypsinering og PBS vasking. Celler ble filtrert gjennom et 40 mikrometer nylonnetting for å oppnå en enkelt cellesuspensjon. De resulterende enkle celler ble fiksert med iskald 50% etanol i PBS over natten. Cellene ble deretter farget med PI og FITC-annexin V ved hjelp av en Annexin V:. FITC apoptose Detection Kit II kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, California)
DSL behandling av tumorspheres
Spheres var dissosiert til enkeltceller og re-suspenderes i sfære medium inneholdende DSL peptid ved indikerte konsentrasjoner for de angitte tider. Behandlet celler ble observert i henhold mikroskop eller høstes for analyse.
Ex vivo GSI behandling av tumorspheres og implantasjon i NOD /SCID mus
Enkeltceller dissosiert fra tumorspheres ble dyrket i sfæren medium som inneholder DMSO eller 8 uM GSI i 48 timer før den ble dissosiert med trypsin og farget med DAPI og et antistoff til H2K. Celler ble sortert ved hjelp av FACS og DAPI negativ og H2K negative celler ble oppsamlet for å oppnå et rent bor, human bukspyttkjertelkreft cellepopulasjon. Etter vasking med HBSS, sorterte cellene ble resuspendert i medium sfære. Celleviabilitet ble validert ved hjelp av trypanblått (Invitrogen, Carlsbad, California). Førti tusen celler i 50 ul medium ble blandet med et like stort volum av Matrigel og injisert subkutant i midflank region av NOD /SCID-mus ved å bruke en 23 gauge nål. Fem mus ble injisert for hver behandlingsgruppe. Tumorstørrelse ble målt ukentlig. Svulster fikk ikke lov til å overstige 2 cm i diameter før avlivning. I tillegg dyr ble overvåket daglig av University of Michigan veterinær ansatte og ofret på noen tegn til ubehag eller vekttap. På slutten av studien dyrene ble avlivet av karbondioksid kvelning fulgt ved halshugging for å sikre død.
ortotopiske Implantasjon av bukspyttkjerteltumorceller i NOD /SCID-mus og GSI behandling
bukspyttkjertelen kreftceller inkubert med luciferase-uttrykker lentivirus over natten ble vasket med serumfritt HBSS og suspendert i en PBS /Matrigel-blanding (01:01 volum) ved en konsentrasjon på 10 millioner celler /ml for implantasjon. Mus ble anestetisert med en intraperitoneal injeksjon av 100 mg /kg ketamin og 5 mg /kg xylazin, og en liten venstre subcostal innsnitt ble utført. 500000 bulk tumorceller i et volum på 50 ul ble injisert inn i hale i bukspyttkjertelen ved anvendelse av en 30-gauge nål. Buprenorfin ble administrert hver 6. time for første 24 timer etter kirurgi for å lindre smerte. Behandling med kjemoterapi ble startet 2 uker etter at tumorene var påvisbare. Tre individuelle lav passasje menneskelige bukspyttkjertelen xenografttumorer ble inkludert i analysen. Det var 4 grupper av mus: kontroll, RO4929097 (GSI), gemcitabin, og GSI pluss gemcitabin, med fem mus per gruppe. Dyrene ble evaluert av bioluminescent bildebehandling og tumorvekst ble evaluert ukentlig. GSI (30 mg /kg) ble administrert ved oral føring ved frekvensen til 5 dager på 2 dager av. Denne planen ble brukt til å minimere GSI-indusert diaré sekundært til slimcellehyperplasi [21]. Gemcitabin (50 mg /kg) ble levert ukentlig ved intraperitoneal injeksjon, som tidligere beskrevet [22]. Behandlingen ble gitt i 4 uker ved hvilket tidspunkt dyrene ble avlivet ved karbondioksid kvelning, etterfulgt av cervikal dislokasjon for å sikre døden. Før ofre ble dyrene overvåkes daglig av University of Michigan veterinær ansatte og ofret på noen tegn til ubehag eller vekttap. Obduksjon ble utført og svulster ble skåret ut for analyse.
Bioluminescent Imaging
Bioluminescent avbildning av implanterte ortotopiske svulster hos mus ble utført ved hjelp av en Xenogen IVIS 200 Imaging som System (Xenogen biovitenskap, Cranbury, NJ) tidligere beskrevet [23].
Immunohistochemistry
Vevsprøver ble fiksert i 10% fosfat-bufret formalin og innstøpt i parafin. Formalinfikserte, parafininnstøpte seksjoner ble kuttet med 4 um tykke, montert på poly-L-lysin-belagte objektglass (Sigma), og tørket over natten ved 37 ° C. Seksjonene ble deretter avvokset i xylen, rehydrert i henhold til standard histopatologiske prosedyrer, og farget med H E. Immundeteksjon ble gjort ved hjelp av DakoCytomation LSAB + Kit i henhold til produsentens protokoll (Dako, Danmark). Glassene ble deretter kontra med Hematoxylin og dekket med VectaMount Monterings Media (Vector Labs, Burlingame, California). Hver farget delen ble så evaluert ved mikroskopi.
TUNEL analysen
TUNEL analyse ble gjort ved hjelp av Promega TUNEL analysen kit (Promega, San Luis Obispo, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Apoptotiske cellekjerner ble visualisert som et gul-grønt fluorescent signal etter fluorescens mikroskopi. Cellekjerner ble kontra med DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA).
Andre reagenser
RO4929097 for in vitro arbeidet ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, Texas).
Oligonukleotider for QRT-PCR
De følgende sekvenser ble anvendt: Hes1 5′-GAGAGGCGGCTAAGGTGTTTG-3 «og 5′-CTGGTGTAGACGGGGATGAC-3′, 5»-GLI1 GGCTGGACCAGCTACATCAAC-3 «og 5»-TGGTACCGGTGTGGGACAA-3- «, 5′-GLI2 GCAAATGAAAGCCAGGGAAC-3′ og 5»-ATCTCAGGAAGGCGATGAAC-3 «, 5′-PTCH1 TATCCAGCACTTACTTTACGACCT-3′ og 5»-ATCCTGAAGTCCCTGAAGCC3 «, og GAPDH 5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′ og 5»-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3- «.
Statistisk analyse
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SE Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av Student
t
test og
Χ
2 analyser eller Mann-Whitney U test der det er hensiktsmessig, og definert som
P
0,05.
Resultater
Notch signalveien er oppregulert i bukspyttkjertelen kreft stamceller
Notch signalveien har vist seg å være aktivert på kreft i bukspyttkjertelen celler [24]. Vi antok at Notch signalveien komponenter kan bli ytterligere oppregulert i bukspyttkjertelkreft stamcelle undergruppe. Ved hjelp av primære humane kreft i bukspyttkjertelen xenografter fra 8 ulike pasientsvulster vi evaluert uttrykk nivåer av Notch signalveien komponenter i kreftstamceller i forhold til bulk tumorceller. Svulster fra xenotransplantater ble isolert og behandlet i enkeltcellesuspensjoner som ble deretter sorterte basert på trippel-markør profil CD44 + /CD24 + /ESA + for å få cscs og separat non-cscs (figur 1A). Kvantitativ RT-PCR-analyse av RNA erholdt fra cscs og ikke-cscs for ekspresjon av komponentene i Notch signalveien ble utført. Resultatene tyder oppregulering av Notch pathway komponenter i cscs over at ikke-cscs (figur 1B). Cscs i 6 av 8 tumorer uttrykte minst en Notch-reseptor på et nivå 1,5 ganger i løpet av ikke-CSC. Tilsvarende ble minst ett hakk ligand oppregulert 1,5 ganger i CSC over ikke-CSC i seks av åtte svulster. Av notatet, hadde vi ikke påvise uttrykk av enten Notch4 reseptoren av DLL3 ligand i enten CSC eller ikke-CSC avdelinger i noen av de primære xenografter testet (data ikke vist). Det var en gjennomsnittlig 1,75 ganger større ekspresjon av Notch veien målgenet Hes1 i cscs sammenlignet med ikke-cscs. Disse resultatene tyder på at cscs differensielt uttrykker økte nivåer av Notch pathway komponenter, og at reaksjonsveien er tilsvarende aktivert som vist av forsterket ekspresjon av Hes1.
A. Flowcytometri analyse. Dissosierte lav-passasje menneskelige kreft i bukspyttkjertelen xenograft celler ble farget med DAPI og antistoffer mot H2K, ESA, CD44 og CD24. DAPI positive døde celler og H2K positiv museceller ble begge fjernet fra analysen. CSC befolkningen (med overflate markør ESA
+ /CD44
+ /CD24
+) ble styrt av både P5 og P7, og den ikke-CSC befolkningen fra P6. B. transkripsjonsnivåer av Notch pathway komponenter i CSC i forhold til hos ikke-CSC oppnådd ved qPCR, normalisert til GAPDH. Gjennomsnittlig ganger endring mellom svulster er representert ved en vannrett linje.
Notch pathway hemming
Basert på observasjonen om at Notch signalveien komponenter er oppregulert i bukspyttkjertelkreft og spesielt bukspyttkjertelen CSC vi videre studert bidraget fra Notch pathway aktivering til bukspyttkjertelen CSC funksjon. Gamma sekretase katalyserer spalting tredje trinn av Notch-reseptor som frigjør hakk intracellulære domenet. Dette trinnet gjør at Notch-reseptor for deretter translocate til kjernen og aktivere Notch signalering, noe som resulterer i oppregulering av mål-genekspresjon. Inhibering av gamma-secretase med en gamma-sekretase inhibitor kan således blokkere aktiveringen av Notch signalveien. Inkubasjon av kreft i bukspyttkjertelen tumorspheres med økende doser av GSI redusert ekspresjonsnivåer av Notch målgenet Hes1 på en doseavhengig måte (figur 2A, B) (p 0,001 vs kontroll). Etter å ha bekreftet at GSI kan hemme Notch signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler, vurderte vi neste effekten av Notch pathway hemming spesielt på CSC rommet. Kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med GSI viste en signifikant reduksjon i cscs med ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ markør profil sammenlignet med ubehandlede celler (2,76 ± 0,16% kontroll sammenlignet med 1,43 ± 0,15% med GSI p = 0,013) (figur 2C, D). Dette resultat antyder en rolle for Notch bane aktivering i CSC vedlikehold.
A. Primære bukspyttkjertelcancercelle tumorspheres (avledet fra pasient 5) ble dyrket i sfære medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av GSI som indikert i 48 timer før Western blot-analyse med et antistoff til Hes1 eller β-aktin. B. Kvantifisering av Hes1 mRNA nivåer følgende GSI behandling i 48 timer (* p 0,001 vs. kontroll). C. kreft i bukspyttkjertelen celler i sfæren medium ble behandlet med kontroll kjøretøy (DMSO) eller 8 mikrometer GSI i 48 timer. FACS analyser av kontroll DMSO behandlede celler (
øvre panel
) og GSI behandlede celler (
nedre panel
). CSC befolkningen med overflate markør for ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ ble identifisert av disse cellene i både porter P5 og P7. D. Kvantifisering av ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ CSC befolkning følgende DMSO og GSI behandling (* p = 0,013 vs. DMSO).
En av de definere funksjoner i cscs er selvfornyelse som kan analyseres in vitro ved å måle tumorsphere dannelse gjennom flere passasjer. Pankreas cscs identifisert med markøren profilen ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ har evnen til å danne kuler i ikke-adherente betingelser som skiller dem fra ikke-kreft-stamceller som mangler denne evne til [10]. Etter å ha observert doseavhengig inhibering av hakk vei med økende doser av GSI og en resulterende reduksjon i prosentandelen av pankreatisk CSC, evaluerte vi den funksjonelle virkning på CSC funksjon ved å teste effekten av GSI i tumorsphere analyser. I samsvar med en doseavhengig effekt på Notch sti inhibering, behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med GSI forårsaket en doseavhengig reduksjon i primær tumorsphere formasjon frekvens (figur 3A, s 0,01 vs. kontroll)
A.. Kreft i bukspyttkjertelen celle tumorspheres dyrket i 5 dager i sfæren medium som inneholder angitte konsentrasjoner av GSI. Representative bilder av primær tumorspheres som utviklet seg fra 1000 celler per brønn dyrket med økende konsentrasjoner av GSI. Kvantifisering av antall primær tumorspheres (svarte søyler) dannet ved hver konsentrasjon med 1000 celler seeded per brønn (* p 0,01 vs. kontroll). Sekundær tumorsphere dannelse (grå søyler) fra tumorspheres behandlet med GSI ble dissosiert til enkeltceller, vasket, og dyrket i 5 dager i normal sfære medium uten GSI (** p 0,01 vs. kontroll). B. Tumorspheres behandlet med GSI ved økende konsentrasjoner farget med propidiumjodid (PI) og FITC-Annexin V (ANV) og analysert ved strømningscytometri for å evaluere graden av apoptose (* p. 0,05 8 um sammenlignet med kontroll, ** p 0,01 16 mikrometer vs. kontroll). C. Celle syklus analyse av pankreas tumorspheres behandlet med DMSO kontroll eller GSI på 0, 24, 48 og 72 timer. (* P 0,01 vs. kontroll). D. kreft i bukspyttkjertelen celler dyrket med enten 8 uM GSI eller bærerkontroll (DMSO) i 48 timer injisert subkutant i NOD /SCID-mus. Representative bilder av mus implantert med celler fra de angitte behandlingsgruppene tatt 21 dager etter injeksjon. Piler angir plassering av tumorene. Serial tumorstørrelser målinger fra mus behandlet med DMSO kontroll eller GSI ved angitte tidspunkter. N = 5 (* p 0,01 vs. kontroll).
For å finne ut om den observerte hemming av tumorsphere formasjonen ble bevart etter transient eksponering til Notch hemming, ble behandlet tumorspheres dissosiert til enkeltceller og re -cultured i normal sfære media uten GSI. Spesielt, ble virkningen på tumorsphere formasjon bevart selv etter fjernelse av gamma-sekretase inhibitor, som vist ved redusert generering av sekundære tumorspheres (figur 3A, p 0,01 vs kontroll).
En effekt av GSI videre apoptose kan forklare denne reduksjonen i tumorsphere formasjon. Faktisk, observerte vi en økt forekomst av apoptose basert på PI og AnnexinV farging av celler fra i tumorspheres behandlet med GSI forhold til kjøretøy behandlet tumorspheres (figur 3B, p 0,05 8 mikrometer vs. kontroll, p 0,01 16 mikrometer vs. kontroll). Dette resultatet tyder på at apoptose bidrar til redusert tumorsphere dannende evne av cellene behandlet med GSI. Vi utførte også cellesyklusanalyse i fravær og nærvær av GSI som viste økt akkumulering av celler i G1 med GSI sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,01). Nedsatt cellesyklusprogresjon kan derfor også bidra til reduksjon i ferd med inhibering av Notch signalveien med GSI (figur 3C) tumorsphere.
For videre å bekrefte dette observerte funksjonell virkning av in vitro-hemming Notch bane, vi studert enten forbehandling med GSI kunne hemme tumordannelse in vivo. I denne analysen vi forbehandlet kreft i bukspyttkjertelen celler etablert som tumorspheres med GSI i 48 timer og deretter implantert levedyktige, behandlede celler subkutant inn i NOD /SCID-mus (5 mus pr gruppe). Celler som var ubehandlede dannet tumorer 5 dager tidligere enn det som er forbehandlet med GSI og vokste betydelig større (p 0,01) enn de som kommer fra cellene forbehandlet med GSI (figur 3D)
Notch sti-inhibering ved hjelp av Hes1. shRNA
Som observert i figur 1B, mRNA nivået av Hes1, et direkte mål /effektor av Notch-signalering, ble oppregulert i cscs sammenlignet med ikke-cscs i flere primær xenografter. Oppregulering av Hes1 ble konsekvent observert i xenografter, i motsetning til andre Notch mål som Hey1 og Heyl (data ikke vist). For å kunne vurdere om de observerte effektene av GSI var spesielt resultat av å hemme Notch signalveien og ikke off-target effekter, brukte vi lentiviral konstruksjoner som uttrykker kontroll og Hes1 shRNA spesifikt mot Hes1. Knockdown av Hes1 av shRNA ble bekreftet på både mRNA (p .001 vs kontroll) og proteinnivåer (figur 4A, B) og ikke påvirke oppstrøms Notch1 cleavage (figur 4B). Nedregulering av Hes1 medførte redusert tumorsphere dannelse (figur 4C, D, p 0,001 vs. kontroll). Gir ytterligere bevis på at Notch pathway aktivisering bidrar til bukspyttkjertelen CSC funksjon
A. Kreft i bukspyttkjertelen celler transduced med enten kontroll eller Hes1 shRNA høstet etter dyrkning i 4 dager. Hes1 transkripsjonsnivåer kvantifisert ved QRT-PCR, normalisert til GAPDH (* p 0,001 vs. kontroll). B. Cellelysater var Western strøket for Hes1, Notch1, kløyvde Notch1, eller β-aktin.
