Abstract
Bakgrunn
Foreløpig kjemoterapi er begrenset meste til gentoksiske stoffer som er forbundet med alvorlige bivirkninger som følge av ikke-selektive målretting av normalt vev. Naturlige produkter spille en betydelig rolle i utviklingen av de fleste kjemoterapeutika, med 74,8% av alle tilgjengelige kjemoterapi er avledet fra naturlige produkter.
Mål
Å vitenskapelig vurdere og validere anticancer potensialet i en etanol ekstrakt av frukten av den lange pepper (PLX), en plante av
Piperaceae
familie som har vært brukt i tradisjonell medisin, spesielt Ayurveda og undersøke anticancer virkningsmekanismen til PLX mot kreftceller.
Materialer og amp; Metoder
Etter behandling med etanolisk lang pepper ekstrakt, ble cellenes levedyktighet bedømmes ved anvendelse av en vannløselig tetrazoliumsalt; apoptose-induksjon ble observert etter nukleær farging av Hoechst, binding av annexin V til ekstern fosfatidylserin og fasekontrastmikroskopi. Bildebasert cytometri ble brukt til å påvise effekten av lange pepper ekstrakt på produksjon av reaktive oksygenarter og avledning av mitokondriemembranen potensial som følge tetramethylrhodamine eller 5,5,6,6′-tetraklor-1,1 «, 3, 3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine klorid farging (JC-1). Vurdering av PLX
in vivo
ble utført ved hjelp av Balb /C-mus (toksisitet) og CD-en nu /nu immunsupprimerte mus (effekt). HPLC-analyse aktivert deteksjon av noen primære forbindelser til stede i vår lange pepper ekstrakt.
Resultater
Våre resultater indikerer at en etanol lang pepper ekstrakt selektivt induserer caspase-uavhengige apoptose i kreftceller, uten å påvirke ikke -cancerous celler, ved å målrette mitokondriene, som fører til avgivelse av mitokondriemembranpotensialet, og økning i ROS produksjon. Offentliggjøring av AIF og endonuklease G fra isolerte mitokondrier bekrefter mitokondriene som et potensielt mål for lang pepper. Effekten av PLX i
in-vivo
studier indikerer at oral administrasjon er i stand til å stanse veksten av tykktarmskreftsvulster hos immunsupprimerte mus, uten assosiert toksisitet. Disse resultatene viser at potensielt trygt og ikke-giftig alternativ som er lang pepper ekstrakt for kreftbehandling
Citation. Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Roma A, Steckle M, Guerrero J-A, et al. (2014) Evaluering av effekt Biokjemisk Mechanism av celledød Induksjon av
Piper longum
Extract Selektivt i
In-Vitro Hotell og
In-vivo
modeller av humane kreftceller. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10,1371 /journal.pone.0113250
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 29. mai 2014; Godkjent: 21 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Copyright: © 2014 Ovadje et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle dataene er presentert i form av figurer og tabeller, som kan finnes i manuskriptet
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Windsor Essex County Cancer Centre Foundation ved Seeds4Hope Grant (URL: https://windsorcancerfoundation.org/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Den medforfatter Siyaram Pandey er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Den fortsatte økningen i forekomsten av kreft innebærer et behov for videre forskning på mer effektive og mindre giftige alternativer til nåværende behandlinger. I Canada alene, ble det anslått at 267,700 nye tilfeller av kreft vil oppstå, med 76,020 dødsfall som inntreffer i 2012 alene. De globale statistikken er enda mer dire, med 12,7 millioner krefttilfeller og 7,6 millioner kreftdødsfall som oppstår i 2008 [1], [2]. Kjennetegnene på kreftceller avdekke problemer med å målrette kreftceller selektivt. Kreftceller er beryktet for å opprettholde proliferativ signalering, gå utenom veksthemming, aktivere invasjon og metastasering og motsette celledød blant andre kjennetegn [3]. Disse egenskapene utgjør ulike utfordringer i utviklingen av vellykkede anticancer behandling. Evnen til kreftceller å unngå celledød hendelser har vært sentrum for oppmerksomheten for mye forskning, med fokus sentrert på målretting ulike sårbare sider av kreftceller til å indusere ulike former for programmert celledød (PCD) i kreftceller, uten tilhørende toksisitet til ikke-kreftceller.
apoptose (PCD type i) har blitt studert i flere tiår, forståelsen av noe som vil forbedre den mulige utviklingen av mer effektive kreftbehandlingen. Dette er en form for celledød som er nødvendig for regulær celle utvikling og homeostase, samt en forsvarsmekanisme for å kvitte seg med skadede celler; celler gjennomgår apoptose investere energi i sin egen død for ikke å bli en plage [2]. Kreftceller unngå apoptose for å gi ekstra vekstfordel og næring, derfor dagens anticancer behandling forsøke å utnytte de ulike sårbarheter kreftceller for å utløse aktivering av apoptose gjennom enten ytre eller indre trasé [4], [5]. Utfordringene noen av de tilgjengelige kreft terapi er deres evner til å indusere apoptose i kreftceller ved å fremkalle genomisk DNA-skader. Selv om dette er utgangspunktet effektive, så de målet raskt delende celler [6], de er vanligvis ledsaget av alvorlige bivirkninger forårsaket av ikke-selektiv målretting av normale ikke-kreft-celler, noe som tyder på et behov for andre ikke-felles mål for apoptose-induksjon uten de tilknyttede toksisitet.
Naturlige helseprodukter (NHPs) har vist store løftet innen kreftforskning. De siste 70 årene har innført ulike naturlige produkter som kilden til mange legemidler i kreftbehandling. Omtrent 75% av de godkjente anticancer behandling er avledet fra naturlige produkter, en forventet statistikk med tanke på at mer enn 80% av den tredje verden befolkning er avhengig av naturlige produkter for behandling [7]. Planteprodukter spesielt inneholder mange bioaktive stoffer som er i stand til å spille bestemte roller i behandling av ulike sykdommer. Tatt i betraktning de komplekse blandinger og farmakologiske egenskapene til mange naturlige produkter, blir det vanskelig å etablere et bestemt mål og virkningsmekanismen til mange NHPs. Med NHPs frammarsj, spesielt innen kreftforskning, er det en rekke nye studier på mekanistisk effekt og sikkerhet av NHPs som potensielle legemidler mot kreft [8].
Long pepper, fra Piperaceae familien, har vært brukt i århundrer for behandling av ulike sykdommer. Flere arter av lang pepper har blitt identifisert, inkludert
Piper longum plakater (ekstrakt av som blir brukt i denne studien),
Piper betle
,
Piper retrofactum
ekstrakter av disse har blitt brukt i mange år for behandling av ulike sykdommer. En lang liste av bruksområder og fordeler er forbundet med ekstrakter av forskjellig
Piper spp
, med rapporter som indikerer deres effektivitet som gode fordøyelses agenter og smerte og betennelsesdempende midler [9]. Men det er liten eller ingen vitenskapelig validering, bare anekdotiske bevis, for fordelene forbundet med bruk av lange pepper ekstrakter. Det finnes vitenskapelige studier har blitt utført på flere forbindelser til stede i ekstrakter av lang pepper, inkludert piperines, som har vist seg å hemme mange enzymatisk narkotika bio-trans reaksjoner og spiller spesifikke roller i metabolsk aktivering av kreftfremkallende og mitokondrie energiproduksjon [10] – [13], og forskjellige piperidin-alkaloider, med fungicid aktivitet [9], [14]. Noen av disse forbindelsene har vist potent anticancer aktivitet [15], noe som tyder på at lange pepper ekstrakter kunne representere en ny NHP, med bedre selektiv effekt mot kreftceller.
I denne studien undersøker effekten av en etanolekstrakt Long pepper frukt (PLX) mot forskjellige kreftceller, så vel som forsøk på å belyse virkningsmekanismen, etter behandling. Resultater fra denne studien viser at PLX redusert levedyktighet av forskjellige kreftcelletyper i en dose- og tidsavhengig måte, hvor apoptose-induksjon ble observert etter mitokondrie målretting og frigjøring av pro-apoptotiske faktorer. På grunn av de lave doser av PLX kreves for å indusere apoptose i kreftcellen, var det lett å finne det terapeutiske vinduet av dette ekstraktet. Induksjonen av apoptose ble funnet å være caspase-uavhengig, selv om det var aktivering av både den ytre og indre baner, og produksjonen av ROS ble ikke vesentlig for mekanismen for celledød induksjon ved PLX. Komplekset polychemical ekstrakt av frukten av den lange pepper anlegget, som en naturlig helse produkt med enestående anticancer aktivitet, gir en måte å målrette flere sårbarheter av kreftceller. Selv i nærvær av visse hemmere, PLX var effektiv i å indusere apoptose tyder potensialet søknad for å utvikle PLX som en trygg og effektiv kreftbehandling.
Materialer og metoder
Dyrestudier ble utført i henhold til dyret omsorg komiteen protokoll godkjent av University of Windsor Animal Care komiteen; Denne protokollen og prosjektet ble godkjent av dyr vare komiteen – Protokoll nummer. AUPP 10-17), i samsvar med den kanadiske Council of Animal Care (CCAC) retningslinjer
Cell Culture
malignt melanom cellelinje G-361, menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HT-29 og HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA Cat No. CRL-1687, CCL-218 . CCL-247, henholdsvis) ble dyrket med McCoys Medium 5a (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) supplert med 10% (v /v) FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 40 mg /ml gentamicin (Gibco, BRL, VWR). Ovarial adenokarsinom-cellelinje OVCAR-3 (American Type Culture Collection, katalog nr. HTB-161) ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) supplert med 0,01 mg /ml bovint insulin, 20% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) standard (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 10 mg /ml gentamicin. Den pankreas adenokarsinom-cellelinje BxPC-3 (American Type Culture Collection, katalog nr. CRL-1424) ble dyrket i RPMI-1640 medium, supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) standard og 40 mg /ml gentamicin. Normal-avledet tykktarmsslimhinnen NCM460 cellelinje (Incell Corporation, LLC., San Antonio, TX, USA) ble dyrket i Incell er M3Base medium (Incell Corporation, LLC., Kat. Nr M300A500) supplert med 10% (v /v) FBS og 10 mg /ml gentamicin.
Alle celler ble dyrket i optimale vekstforhold av 37 ° C og 5% CO2. Videre ble alle cellene passeres for ≤6 måneder.
Long Pepper Utvinning
Ripe og tørkede indiske lang pepper frukt ble hentet fra Quality Natural Foods begrenset, Toronto Ontario. Plantematerialet ble malt opp og ekstrahert i vannfri etanol (100%) i et forhold på 1:10 (1 g plantemateriale til 10 ml etanol). Ekstraksjonen ble utført over natten på et risteapparat ved romtemperatur. Ekstrakten ble ført gjennom en P8 grovfilter, etterfulgt av et 0,45 pm filter. Løsningsmidlet ble avdampet ved bruk av en RotorVap ved 40 ° C og rekonstituert i dimetylsulfoksyd (Me
2SO) ved en slutt lager-konsentrasjon på 450 mg /ml.
Cell Treatment
Celler ble platet og vokst til 60-70% samløpet, før de blir behandlet med lange Pepper ekstrakter (PLX), N-acetyl-L-cystein (NAC) (Sigma-Aldrich Canada, kat. nr A7250), og bredspektret caspase-hemmer, Z-VAD-FMK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) ved de angitte doser og varighet. NAC ble oppløst i sterilt vann. Z-VAD-FMK ble oppløst i dimetylsulfoksyd (Me
2SO). PLX ble ekstrahert som beskrevet tidligere, rekonstituert i meg
2SO. Før behandling ble en fortynnet arbeidskonsentrasjon på 10 mg /ml i PBS fremstilt. Cellene ble behandlet med 10 mg /ml til innhentet de endelige konsentrasjoner er angitt i resultatdelen.
Vurdere effekt ved lang Pepper Extract (PLX) i kreftceller
WST-en analyse for Cell levedyktighet.
for å vurdere effekten av PLX på kreftceller, ble en vannløselig tetrazoliumsalt (WST-1) basert kolo analyse utført i henhold til produsentens protokoll (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA ), for å kvantifisere cellelevedyktighet som en funksjon av cellulær metabolisme. Samme antall celler ble sådd ut på 96-brønners klare bunn vevskulturplater deretter behandlet med de angitte behandlinger ved de angitte konsentrasjoner og varigheter. Etter behandling, ble celler inkubert med WST-1 reagens i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO2. De WST-1 reagens spaltes til formazan ved cellulære enzymer i aktivt metaboliserende celler. Den formazanprodukt ble kvantifisert ved å ta avlesninger ved 450 nm på en Wallac Victor
3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada). Cellular levedyktighet som et mål for metabolsk aktivitet ble uttrykt som prosentandeler av det løsningsmiddel kontrollgruppene.
nukleær farging.
I etterfølgende behandling, ble kjernen av cellene farget med 10 uM Hoechst 33342 fargestoff ( Molecular Probes, Eugene, OR, USA) eller 1 mg /ml propidiumjodid (PI) (Sigma Aldrich, Mississauga, ON. Canada), for å overvåke kjernemorfologi for apoptose-induksjon ved angitte tidspunkter og total celledød. Celler ble inkubert med 10 pM Hoechst fargestoff og 1 mg /ml PI i 10 minutter og mikrobilder ble tatt med en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400 x forstørrelse. Bilde-baserte cytometri ble brukt til å kvantifisere mengden av celledød oppstår med PI farging.
Annexin V bindingsanalyse.
For å bekrefte induksjon av apoptose, binding av Annexin V til ekstern fosfatidylserin på den ytre celleoverflate, ble vurdert. Etter behandling med PLX ble cellene vasket to ganger i fosfatbuffer saltvann (PBS). Deretter ble cellene resuspendert og inkubert i Annexin V bindingsbuffer (10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,6) med Annexin V AlexaFluor-488 (01:50) (Invitrogen, Canada, Cat No . A13201) i 15 minutter. I de siste 10 minutters inkubering, 10 uM Hoechst og 1 mg /ml propidiumjodid ble tilsatt til mikrosentrifugerør og inkubert i de siste 10 minutter i mørket. Mikrobilder ble tatt med 400 x forstørrelse av et Leica DM IRB invertert mikroskop (Wetzlar, Tyskland) og bildebasert cytometri ble anvendt for å kvantifisere prosentandel av programmert celledød (annexin V-positive celler) som forekommer etter behandling.
TUNEL Farging å oppdage DNA Damage og kvantifisere apoptose.
Etter PLX behandling, HT-29 celler ble merket med Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse. Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll (Molecular Probes, Eugene, OR), for å påvise DNA-skade. Celler ble behandlet med PLX eller VP-16 (som en positiv kontroll) ved indikerte konsentrasjoner og tidspunkter og analysert for fragmentering av DNA. Etter behandling ble cellene fiksert ved å suspendere dem i 70% (v /v) etanol og lagret ved -20 ° C over natten. Prøven ble deretter inkubert med en DNA-merking-løsning (10 ul reaksjonsbuffer, 0,75 ul TdT enzym, 8 ul BrdUTP, 31,25 ul dH2O) i 1 time ved 25 ° C. Hver prøve ble utsatt for en antistoff-oppløsning (5 ul Alexa Fluor 488-merket anti-BrdU-antistoff og 95 ul skylleoppløsning). Cellene ble inkubert med antistoffløsningen i 20 minutter og TUNEL-positive celler ble kvantifisert ved bildebasert cytometri.
Whole Cell ROS Generation.
Etter behandling med PLX, cellene ble inkubert med 2 «, 7»-Dichlorofluorescin diacetate H
2DCFDA (katalog nr D6883, Sigma Aldrich, Mississauga ON. Canada) i 45 minutter. Celler ble samlet opp, vasket to ganger i PBS og grønn fluorescens ble observert ved anvendelse av en TALI bildebasert cytometer (Invitrogen, Canada). NAC ble brukt for å vurdere avhengigheten av PLX på ROS generasjon og levedyktighet.
Vurdering av mitokondriefunksjon Etter PLX Behandling
tetramethylrhodamine Methyl Ester (TMRM) Farging.
Hvis du vil overvåke mitokondriemembranen potensial (MMP), tetramethylrhodamine metyl ester (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) eller 5,5,6,6′-tetraklor-1,1 «, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine klorid ( JC-1) (Invitrogen, Canada) ble anvendt. Celler ble dyrket på dekkglass, ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av behandlinger på de angitte tidspunkter, og inkubert med 200 nM TMRM i 45 minutter ved 37 ° C. Mikrobilder ble oppnådd ved 400 x forstørrelse i et Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland). For å bekrefte resultatene oppnådd ved fluorescens mikroskopi, ble bildebaserte cytometri anvendt for å detektere rød fluorescens. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater og etter behandling, ble celler inkubert med TMRM i 45 minutter, vasket to ganger i PBS og plassert i TALI glir. Red fluorescens ble oppnådd ved bruk av en TALI bildebasert cytometer (Invitrogen, Canada).
Mitokondrie Isolation å vurdere mitokondrie målretting.
Celler ble samlet av trypsin, vasket en gang i kaldt PBS, resuspendert i kald hypotonisk buffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitol, 70 mM sukrose, 10 mM Leu-pep og Pep-A, 100 uM PMSF), og manuelt homogenisert. Den homogeniserte celleløsning ble sentrifugert ved 3000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble sentrifugert ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og den mitokondrielle pelleten ble resuspendert i kald reaksjonsbuffer (2,5 mM malat, 10 mM succinat, 10 uM Leu-pep og Pep-A, 100 uM PMSF i PBS). De isolerte mitokondrier ble behandlet med PLX ved de angitte konsentrasjoner og inkubert i 2 timer i kulden reaksjonsbuffer. Kontrollgruppen ble behandlet med oppløsningsmiddel (etanol). Etter 2 timers inkubering med ekstrakt ble mitokondrielle prøvene virvlet og sentrifugert ved 12000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. De resulterende supernatant og mitokondrielle pellets (resuspendert i kald reaksjonsbuffer) ble underkastet Western blot-analyse for å vurdere for den mitokondrielle frigivelse /retensjon av pro-apoptotiske faktorer.
Western blot-analyser.
Protein prøvene ble underkastet SDS-PAGE, overført på en nitrocellulosemembran, og blokkert med 5% vekt /volum melk TBST (tris-buffret saltvann Tween-20) oppløsning i 1 time. Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med en anti-endonuklease G (EndoG) antistoff (1:1000) oppvokst i kaniner (Abcam, Cat. No. ab9647, Cambridge, MA, USA), en anti-succinatdehydrogenase subenhet A ( SDHA) antistoff (1:1000) oppvokst i mus (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-59687, Paso Robles, CA, USA), eller en anti-apoptose induserende faktor (AIF) antistoff oppvokst i kaniner (1:1000) (Abcam, kat. nr ab1998, Cambridge, MA, USA). Etter primært antistoff inkubasjon, ble membranen vasket en gang i 15 minutter og to ganger i 5 minutter i TBST. Membranene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med et anti-mus eller anti-kanin-pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, USA) etterfulgt av tre 5-minutters vaskinger i TBST. Chemiluminescence reagens (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada) ble brukt til å visualisere proteinbånd og densitometry analyse ble utført ved hjelp av ImageJ programvare.
In-Vivo
Vurdering av Long Pepper Extract
Toxicity Assessment.
Seks uker gamle Balb /C-mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories og ligger i konstant laboratorieforhold til en 12-timers lys /mørke syklus, i samsvar med dyre protokoller skissert i University of Windsor forskningsetikk board AUPP 10-17). Etter akklimatisering, ble musene delt i tre grupper (3 dyr /kontroll (ubehandlet), 3 dyr /sonde kontroll (kjøretøy behandling) og 4 dyr /behandling gruppe). Kontrollgruppen ubehandlede gruppe ble gitt vanlig filtrert vann, mens den andre og tredje gruppe ble gitt 50 mg /kg /dag kjøretøy (Me
2SO) eller PLX, henholdsvis i 75 dager. I løpet av studien ble toksisitet målt ved veiing mus to ganger i uken og urin ble samlet for protein urinanalyse av urin peilepinnen og Bradford analyser. Etter varigheten av studien, ble musene avlivet og deres organer (lever, nyrer og hjerte) ble oppnådd for immunhistokjemisk og toksikologisk analyse av Dr. Brooke ved University of Guelph.
Effekt av PLX i Tumor xenograft modeller av immunsupprimerte mus.
Seks uker gamle CD-en nu /nu mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories og ligger i konstant laboratorieforhold til en 12-timers lys /mørke syklus, i samsvar med de dyre protokoller som er skissert i University of Windsor forskningsetikk board AUPP 10-17). Etter akklimatisering ble musene injisert subkutant i høyre og venstre bakben flanker med en tykktarmskreft cellesuspensjon (i fosfatbufret saltvann) ved en konsentrasjon på 2 * 10
6 celler /mus (HT-29, p53
– /-, i venstre flanke og HCT116, p53
+ /+, i høyre flanke). Tumorene fikk utvikle seg (ca. en uke), hvoretter dyrene ble tilfeldig delt inn i behandlingsgrupper på 4 mus per gruppe, en kontrollgruppe, en sonde kontrollgruppe fikk rent filtrert sterilt vann, samt gavage diett av kjøretøyet (5 mL Me
2SO i PBS) to ganger i uken. Den siste gruppen fikk filtrert vann supplert med lang pepper ekstrakt ved en konsentrasjon på 100 ug /ml, samt gavage diett av lang pepper ekstrakt (5 ul ekstrakt i PBS), to ganger i uken, svarende til 50 mg /kg /dag . Tumorene ble undersøkt hver dag ved å måle lengde, bredde og høyde, ved hjelp av en standard målepunktet, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen π /6 * lengde x bredde. Musene ble også vurdert for noe vekttap annenhver dag i løpet av studien, som varte i 75 dager, etter som ble dyrene avlivet, og deres organer og vev (lever, nyrer, hjerte og svulster) ble erholdt og lagret i 10 % formaldehyd for immunhistokjemisk og toksikologisk analyse
Hematoxylin Eosin (H E). Farging
Mus organer ble fiksert i 10% formaldehyd, hvoretter de ble cryosectioned til 10 mikrometer seksjoner og plassert på en Superfrost /Plus objektglass (Fisherbrand, Fisher Scientific). Deler av organer ble farget i henhold til en standardisert H E-protokollen [16].
Phytochemical Analyse av Long Pepper Extract ved HPLC
HPLC-analyse av den lange pepper rå ekstrakt ble utført ved University of Ottawa i Arnason lab. Totalt fem kjente piperamides ble analysert og sammenlignet med det ubehandlede lang pepper ekstrakt. De ekstrakter og piperamide standarder ble analysert på en Luna C18-5u-250 x 4,6 mm kolonne ved 45 ° C ved en strømningshastighet på 1,0 ml /min med en mobil fase bestående av H
2O og metanol som beskrevet i tabell 1 . kromatogram profiler ble brukt til å oppdage eventuelle forskjeller mellom et utvalg standard kjente piperamides i grove lange pepper ekstrakter.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble gjentatt minst tre uavhengige ganger . Representative fluorescens bilder ble vist, der det er hensiktsmessig. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism programvare 288 6,0. Middelverdien og standardavviket av tre uavhengige eksperimenter ble analysert for kvantifisering av data. Den t-test og toveis Anova ble brukt for statistisk analyse
Resultater
Etanolisk Utdrag av Long Pepper (PLX) Effektivt og selektivt Reduserer levedyktigheten til Induserer apoptose i kreftceller i et Dose Tid avhengig måte
Det første trinnet i å forstå effekten av lang pepper ekstrakt i denne studien var å vurdere effekten av PLX på levedyktigheten til kreftceller. Etter behandling med økende konsentrasjon av PLX ved økende tidspunkter, ble celler inkubert med et vannløselig tetrazoliumsalt, som blir metabolisert til en rød formazanprodukt av levedyktige celler med aktiv metabolisme. Dette produktet kan deretter bli kvantifisert ved absorbans-spektrometri. Vi observerte effekten av urene PLX redusere levedyktigheten til kreftceller, inkludert tykktarmen (HCT116), bukspyttkjertel (BxPC-3), eggstokk-kreft (OVCAR-3) og melanomceller. Denne effekten var dose og tidsavhengig (figur 1). For å vurdere anticancer aktivitet PLX videre, ønsket vi å vurdere sin rolle i celledød og dens selektivitet til kreftceller. Våre resultater viser at PLX er i stand til selektivt å indusere celledød i kreftceller (tykktarm, bukspyttkjertel og leukemi) i en dose- og tidsavhengig måte, som kjennetegnes ved økningen i propidiumjodid-positive celler i kreftceller behandlet med PLX (Figur 2) . Videre denne effekten var selektiv, som normale kolon epitelceller vært upåvirket av denne behandlingen, i samme konsentrasjoner og tidspunkter (figur 2B). Disse resultatene ble kvantifisert ved anvendelse av bildebasert cytometri for å bestemme prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose og total celledød. Vi observerte en 30-40% økning i annexin V-positive celler, etter PLX behandling og en 80-100% PI positiv økning i den samme celleprøver, noe som bekrefter induksjon av apoptose, som følge av nekrose i dyrkede kreftceller (figur 3).
Colon (HCT116), eggstokk (OVCAR-3), ble bukspyttkjertelen (BxPC-3) kreft og melanom (G-361) celler behandlet med et urent ekstrakt av etanolisk lang pepper (PLX), hvoretter de ble inkubert med WST-1 celle-levedyktighet fargestoff i 4 timer. Absorbans ble avlest ved 450 nm og uttrykt som en prosent av kontrollen. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra quadruplicates av 3 uavhengige eksperimenter. ** P . 0,0001
(A) Ved å følge behandling av humant pankreatisk (BxPc-3) kreft og T-celle leukemiceller med PLX, ved angitte tidspunkter ble cellene inkubert med propidiumjodid og vurderes for induksjon av celledød ved bildebasert cytometri. (B) Lignende forsøk ble utført i humane tarmkreftceller (HT-29) og normal tykktarm epitelceller (NCM460). Fluorescens mikroskopi ble anvendt for å vurdere induksjon av celledød som kjennetegnes ved tilstedeværelse av propidium jodid-positive celler. Bilder ble tatt på 400 × forstørrelse på en fluorescerende mikroskop. Målestokk = 15 mikrometer.
bildebasert cytometri ble anvendt for å kvantifisere apoptotisk induksjon (% Annexin V positiv), fulgt av nekrose (% PI positiv) i E6-1 og HT-29 celler etter PLX behandling. Mangelen på annexin V eller PI farging ble anvendt som en indikasjon på levende celler etter behandling (% Annexin V /PI-negative celler) (* P 0,05, ** P 0,003, *** P 0,0001). (E) For å ytterligere bekrefte induksjon av apoptose.
DNA fragmentering er en viktig biokjemisk funksjon i apoptose. For ytterligere å bekrefte dette induksjon av apoptose, for å TUNEL merking påvise DNA-fragmentering ble ansatt. Kvantifisering resultater fra bildebasert cytometri viser effekten av PLX å indusere apoptose, følgende DNA-fragmentering i HT-29 colon cancerceller i en tidsavhengig måte. VP16, en kjent kjemoterapeutisk middel med DNA-ødeleggende evner, ble anvendt som en positiv kontroll (figur 4).
TUNEL Merkingen ble brukt til å påvise DNA-fragmentering. Etter PLX og VP16 (som en positiv kontroll for DNA-skade) behandling ble cellene merket med DNA-fargeløsning og kvantifisert ved bildebasert cytometri. Behandlede celler ble sammenlignet med kontrollen ubehandlet celleprøve. (**** P 0,0001).
I tillegg apoptoseinduksjon i ulike kreftceller, melanom (G-361), eggstokkreft og tykktarmskreft (HT-29) celler, ble bekreftet av Annexin -V bindingsanalysen. Denne induksjon av apoptose ble bekreftet å være selektiv til kreftceller, som normale tykktarmceller (NCM460) forble upåvirket av PLX behandling. Dette ble indikert ved kjerne kondensasjon, cellemorfologi og eksternalisering av fosfatidylserin til den ytre paknings av cellemembranen, som indikert ved farging Hoechst, fase-kontrast og binding av annexin V fargestoff henholdsvis (figur 5A og B). Selektiviteten av PLX til kreftcellene ble ytterligere bekreftet av WST-1 celle-levedyktighet analyse som viste at PLX var meget effektiv ved slike lave doser, ble en terapeutisk vindu lett observert (figur 5C). Behandling av HT-29 med 0,20 mg /ml effektivt redusert levedyktighet med ca. 90%, mens NCM460 celler holdt seg på 100% levedyktighet ved samme dose. Dette indikerer at PLX kan være mer effektiv ved svært lave doser, noe som reduserer sjansene for toksisitet forbundet med behandling
Etter behandling med PLX, celler (Ovarian;. OVCAR-3, melanom, G-361 og Normal tykktarm epitel-celler (NCM460) ble merket med Hoechst for å karakterisere atom morfologi og Annexin-V for å detektere apoptotiske celler (A) og cellulær morfologi ved fasekontrastmikroskopi (B),. Bildene ble tatt med 400 x forstørrelse av et fluorescerende mikroskop Målestokk = 15 um. (C) ved å følge PLX behandling, HT-29 tykktarmskreftceller og ikke-kreft NCM460 celler ble inkubert med WST-1 celle-levedyktighet fargestoff i 4 timer og absorbansen ble avlest ved 450 nm og uttrykt som en prosent av kontroll . Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter ** p .. 0,0001
PLX induserer caspase-uavhengige apoptose i humane kreftceller
Kaspaser er cystein asparaginsyre proteaser som spille en dominerende rolle som døds proteaser [17]. deres rolle i forskjellige celledødsprosesser fremdeles kontroversiell, og deres aktivering eller inhibering kan være avgjørende for progresjon av inhibisjon av celledødsveier [18], [19]. For å vurdere rollen til kaspaser i vårt studium, etter behandling med 0,10 mg /ml PLX, ved angitte tidspunkter, ble BxPc-3-celler samlet opp, vasket og inkubert med lyseringsbuffer for å oppnå cellelysat. Cellelysatet ble inkubert med caspase-substrater, som er spesifikke for hver kaspase (3, 8 og 9) og inkubert i en time. Fluorescens-avlesninger ble oppnådd ved bruk av et spektrofluorometer. Våre resultater tyder på at PLX er i stand til å aktivere begge baner (ytre og indre apoptose) i en tidsavhengig måte. Dette ble observert som hurtig aktivering av kaspaser-3, 8 og 9 ble observert så tidlig som i en time, etter behandling (figur 6A).
Etter behandling med 0,10 mg /ml PLX, ved angitte tidspunkter, BxPc -3-celler ble samlet opp, vasket og inkubert med lyseringsbuffer for å oppnå cellelysat.
