Abstract
Områdespesifikke histonmodifikasjonene er viktige epigenetiske regulatorer av genuttrykk. Som deregulering av gener resulterer ofte i sammensatte lidelser, kan korrigerende modulering av stedsspesifikke histone merkene være et kraftig terapeutisk eller sykdomsforebyggende strategi. Men slik modulering av kosttilskudd forbindelser og den resulterende innvirkning på sykdomsrisiko forbli relativt uutforsket. Her undersøkte vi phenethylisothiocyanate (PEITC), en felles kosttilskudd sammensatt avledet fra cruciferous grønnsaker med kjente chemopreventive egenskaper under eksperimentelle forhold, som en mulig modulator av histonmodifikasjonene i humane tykktarmskreftceller. Denne studien rapporterer roman, dynamiske, stedsspesifikke kjemiske endringer histon H3 i et gen-promoter-spesifikk måte, forbundet med PEITC eksponering i menneskets tykktarm tumor avledet SW480 epitelceller. I tillegg PEITC dempes celleproliferasjon i en treringstrinnet og tidsavhengig måte, sannsynligvis formidlet av caspase-avhengig apoptotiske signalering. Effektene av PEITC på histonmodifikasjonene og genekspresjon endringer ble oppnådd ved lave, ikke-cytotoksiske konsentrasjoner, i motsetning til de høyere konsentrasjoner er nødvendige for å stanse kreftcelle-proliferasjon. Økt forståelse av spesifikke epigenetiske forandringer av kosttilskudd forbindelser kan gi bedre chemopreventive strategier for å redusere helse byrden av kreft og andre sykdommer hos mennesker
Citation. Liu Y, Chakravarty S, Dey M (2013) Phenethylisothiocyanate Endrer site og Arrangøren Spesifikke Histone Tail Endringer i kreftceller. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10,1371 /journal.pone.0064535
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 17 september 2012; Godkjent: 16 april 2013; Publisert: 28. mai 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Major støtte. for dette arbeidet kom fra National Institutes of Health gi [R00AT4245] (til MD). Ekstra støtte kom fra Sør-Dakota Landbruk Experiment Station gir 328100/318000 (til MD) og 3AH386 (til SC), Biologisk kontroll og analyse av Applied Photonics: South Dakota 2010 senter tilskuddet 3SG163 (til SC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er fortsatt den nest største årsaken til alle dødsfall i USA [1]. Heldigvis kan mange kosttilskudd forbindelser potent modulere ulike molekylære mål, som fører til forebygging av kreft initiering, markedsføring, og progresjon. Spesielt frukt og grønnsaker er rike kilder til biologisk aktive forbindelser som ofte har lav toksisitet, men betydelige efficacies [2]. I det siste, var kreft snevert oppfattet som en sykdom av mutasjoner, men nyere forskning knytter også sykelig tilstand med forstyrrelse av mobilnettet regulatoriske nettverk, og avbrudd av gen-funksjon og genregulering er nå både anerkjent som kjennetegner kreft [3] , [4], [5]. Derfor sykdomsforebyggende tiltak med sikte på å målrette viktige elementer av nettverkene som regulerer gen-funksjon, slik som kromatin, kan være effektive. De endringer av stedsspesifikke kromatin modifikasjoner, kjent som epigenetiske forandringer, er relevante for klinisk onkologi, som de er nært forbundet med genekspresjon og nettverks forstyrrelser i sykdomstilstanden [6], [7]. Derfor belyse rollen som kosttilskudd forbindelser tilbakestille avvik epigenetiske landskap ansvarlig for endret genuttrykk kan lette forebyggende medisinsk praksis.
epigenetisk grunnlag av genregulering er manifestert ved strukturell enhet av kromatin, nucleosome, som er en samling av histone octamers innpakket av genomisk DNA. Modifikasjoner av histoner utgjør en stor molekylær kontrollpunkt i reguleringen av genekspresjon, og disse modifikasjonene er ofte endres i-kreft [6], [7]. Blant mange kjente histon aminosyre hale modifikasjoner, metylering og acetylering av lysinrestene i histon H3 er blitt grundig studert med hensyn til genet Slå og genregulering. Dimetylering av H3 på lysin 9 (H3K9me2) og trimethylation av H3 på lysin 27 (H3K27me3) er ofte forbundet med transkripsjonen undertrykkelse og genet Slå [8]. Stedsspesifikke histon lysin metyleringer katalyseres av histon-metyl- transferaser (HMTs), og fjerning av metylgruppene katalyseres av demethylases. Tilsvarende er deacetylering av histoner i genet promotorer katalysert av histon deacetylases (HDACs) korrelert med kondensering av kromosomale domener som markerer områder av transkripsjonen inkompetanse og nedregulering av de tilhørende genene [9]. Selv om in vitro-studier av den rolle diett fytokjemikalier i å modulere nivåene av HMTs og HDACs finnes i et lite antall [10], modulering av posisjonsspesifikk H3 lysin modifikasjoner av diett forbindelser i en gen-spesifikk måte forblir forholdsvis uutforsket [11] . Her undersøkte vi H3-acetylering (H3-Ac) og stedsspesifikke H3 lysin metyleringer (H3K27me3 og H3K9me2) i forbindelse med phenethylisothiocyanate (PEITC) -mediert genuttrykk modulering i humane tykktarmskreftceller. Dette er en følge opp av våre tidligere rapporter om PEITC som et kosttilskudd forbindelse med mulige antiinflammatoriske funksjoner i forskjellige eksperimentelle modeller [12], [13].
PEITC forekommer naturlig i form av sitt glucosinolate forløper, gluconasturtiin, i grønnsaker som kål, blomkål, wintercress, og brokkoli. PEITC har vist potensial antioksidant og chemopreventive aktivitet i eksperimentelle modeller for ulike kreftformer [14], [15]. Det viste ingen åpenbar toksisitet i legemiddelsikkerhetsstudier [16] og er for tiden i kliniske studier for lungekreft behandlinger (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). I mus, vi tidligere vist at PEITC demper kolon inflammasjon og modulerer en rekke potensielle biomarkører knyttet til betennelse og tykktarmskreftutvikling. Disse biomarkører inkludert gener relatert til betennelsesreaksjon, apoptose, cellesyklusregulering, spredning, cytokin /chemokin aktivitet, og transkripsjonsregulering [12], [13].
Tykktarmskreft er den nest største årsaken til kreft -relaterte dødsfall i USA [21]. Interessant er en mekanisk forbindelse mellom kronisk betennelse og en økt risiko for kreft som følge av betennelse-indusert genetisk og epigenetisk ustabilitet nå vel akseptert [17]. Sentrale aktører i denne sammenheng inkluderer transkripsjonsfaktorer som nukleær faktor kappa B (NFkB) og signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon (statistikk), cytokiner /chemokiner og matriksmetalloproteinaser (MMP), en multigen familie av sink-avhengige ekstracellulære matrise ombygging endopeptidaser. Disse cellemediatorer, hvorav vi studert tidligere i musemodeller [12], [13], har viktige funksjoner relatert til forbikobling av adaptiv immunitet, spredning, overlevelse av maligne celler, tumor-vekst, angiogenese, invasjon og metastase [17 ], [18], [19], [20]. Den aktuelle studien undersøkte kromatin endringer i forbindelse med PEITC-mediert modulering av uttrykket av disse mediatorer i humane tykktarmskreftceller.
Materialer og metoder
Drug and Chemicals
Dimethyl sulfoxide (DMSO), lipopolysakkarid (LPS, fra
Escherichia coli
belastning Ø55: B5), penicillin /streptomycin, og phenethylisothiocyanate (PEITC) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), ble føtalt bovint serum (FBS), og TrypLE kjøpt fra Gibco (Grand Island, NY). Humant interferon-γ (IFNy) ble kjøpt fra R Konsentrasjonsavhengige virkninger av PEITC etter 48 timer på DNA-fragmentering (B); Konsentrasjonsavhengig modulering av ekspresjonen av gener knyttet til apoptose og cellesyklusen ved PEITC etter 48 timer. GAPDH ble anvendt som en kontroll for rengjøring relativ kvantifisering av endringer i genekspresjon (C); for alle eksperimenter n = 3. * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Ingen tap i celleviabilitet i 10 uM PEITC-gruppen sammenlignet med den ikke-PEITC gruppe ble observert opp til 12 timer.
seks genene er vist hvor det PEITC-assosierte forandringer i H3 modifikasjoner ble også observert . Gois hvor PEITC-eksponerings-assosiert H3-forandringer ble ikke observert er vist i tabell 3, men ikke i den aktuelle figuren. Virkningene av PEITC behandlinger ble målt ved hjelp av den relative mengde mRNA uttrykt av goi i de behandlede celler. MRNA-mengden ble målt ved anvendelse av sanntids RT-PCR, med GAPDH som en intern kontroll. Lave verdier gir større hemmende effekter. Verdier er gjennomsnitt ± SEM (n = 6). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Når alle verdier under den stiplede linjen tilsvarer samme kategori av
p
verdi, er individuelle stjerner utelatt for å unngå overbefolkning av figuren. Statistiske betydninger ble målt i forhold til den positive kontrollen, som er celler behandlet med LPS og ingen PEITC, viser de høyeste genet induksjons nivåer.
Histone H3 metylering endringer på promotorområdene av gener av interesse (GOI ) i SW480 celler. Kromatin fra SW480-celler ble høstet etter 5 timer med 10 uM-PEITC behandling. Resultatene chip analyser ved anvendelse av (A) anti-trimetyl-Histone H3 Lys27 (H3K27me3) og (B) anti-dimetyl-Histone H3 Lys9 (H3K9me2) antistoffer er vist. Av 13 Gois testet i SW480 celler, seks gener viste statistisk signifikante PEITC-forbundet endringer i H3K27me3 stater og ett gen viste statistisk signifikante PEITC-forbundet endringer i H3K9me2 tilstand. DNA-sekvenser ble kvantifisert ved sanntids-PCR ved anvendelse av promotorprimerne. Gjennomsnittlig prosent inngang ± SEM (n = 3) fra hvert eksperiment er plottet. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0.001 sammenlignet med positiv-kontrollceller
Histone H3 acetylering endringer på promoter regionen gener av interesse (GOI) i SW480 celler. Chromatin fra SW480 celler ble høstet etter 5 timer med 10 mm PEITC behandling. Av 13 Gois testet i SW480 celler, to gener viste statistisk signifikante PEITC-forbundet endringer i H3-Ac status. Resultatene chip analyser ved bruk av et anti-acetyl-Histone H3-antistoff er vist. DNA-sekvenser ble kvantifisert ved sanntids-PCR ved anvendelse av promotorprimerne. Gjennomsnittlig prosent inngang ± SEM (n = 3) fra hvert eksperiment er plottet. * P 0,05, *** p. 0.001 sammenlignet med positiv-kontrollceller
Representative resultater som viser tidsavhengige effekter av 10 mm PEITC behandling på STAT1 mRNA nivåer og på H3K27me3 metylering staten . SW480-celler ble behandlet med 10 uM PEITC ved de indikerte tidspunkter (A, B). De STAT1 mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH nivåer og uttrykt som en prosentandel i forhold til positiv-kontrollceller (A). Histone H3 metylering endringer på STAT1 promoter-regionen i SW480 celler ble bestemt ved hjelp av en anti-H3K27me3 antistoff for chip. DNA-sekvenser ble kvantifisert ved real-time PCR (B). Datapunkter representerer gjennomsnittet ± SEM (n = 4) fra hvert forsøk. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med positiv-kontrollceller. De grønne stiplede linjene indikerer en mulig omvendt korrelasjon (for undertrykkende tegn) mellom endringer i mRNA nivåer og H3 modifikasjon status i cellene. Tilstedeværelse eller fravær av lignende korrelasjoner for de gjenværende fem Goi er vist i figurene S1, S2, S3, S4, S5.
Immunoblot-analyser som viser undertrykkelse av total cellulær STAT1 samt aktivert atom pSTAT1 i respons til PEITC behandlinger i SW480-celler på en konsentrasjonsavhengig måte. (A) Immunoblot. (B) Densitometrisk analyser av immunoblot. Celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av PEITC i 5 timer før til 4 timer LPS-aktivering. Ustimulerte celler og stimulerte celler tjente som negative og positive kontroller. Band intensiteter ble normalisert til p-aktin. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3) av tre separate forsøk. * P 0,05, ** p. 0,01
DNA fragmentering analyse for påvisning av apoptose
SW480 celler behandlet med ulike konsentrasjoner av PEITC ble inkubert i 48 timer før høsting genomisk DNA bruker DNAzol (Invitrogen, Grand Island, NY), etter produsentens protokoll. DNA-fragmentering ble visualisert under anvendelse av 1,5% agarose-gel-elektroforese og farging GelRed (Biotium, Hayward, CA).
Total RNA ekstraksjon, rensing, og cDNA-syntese
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Grand Island, NY), etter produsentens anvisninger. RNA ble kvantifisert ved absorpsjonsmålinger ved 260 og 280 nm ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer-system (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). RNA ble deretter behandlet med DNase (Invitrogen Inc.), etter produsentens retningslinjer for å fjerne alle spor av DNA-kontaminering. CDNA ble syntetisert ved hjelp av 3 mikrogram av RNA for hver prøve ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), etter produsentens protokoll. RNA ekstraksjon, rensing, og cDNA syntese ble utført som tidligere beskrevet [13].
Real-Time Kvantitativ PCR
De syntetiserte cDNA ble fortynnet fire ganger. To mikroliter av hver fortynnet prøve ble tilsatt 0,5 mL av gen-spesifikke primere og 12,5 mL av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosciences, Foster City, CA) og sluttvolum brakt til 25 fil ved å tilsette sterilt destillert vann. PCR-amplifikasjoner ble utført på en MX3005P system (Roche /Stratagene) under anvendelse av en syklus ved 50 ° C i 2 minutter, en syklus på 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C , og en siste syklus med 95 ° C i 1 minutt, 55 ° C i 30 s, og 95 ° C i 30 s som beskrevet [13]. NTC (ingen mal kontroll), no-RT kontroll, og PEITC-bare kontroller ble benyttet som passer for kvalitetskontroll. Alle prøver ble kjørt in duplo. Genspesifikke, intron-dekkende primerne anvendt i denne studien, er beskrevet i tabell 1 (for PEITC konsentrasjonsavhengig mRNA-ekspresjon) og tabell 2 (for CHIP eksperimenter). Beregninger av relative uttrykk nivåer ble utført ved hjelp av ΔΔC
t-metoden [25]. Dataverdier er middelverdier av minst tre uavhengige forsøk og er uttrykt som den relative mRNA-mengden i forhold til en positiv kontroll, som er normalisert til en verdi på 1,0.
Western Blot analyse
for immunblot analyser, IFNy-primet, PEITC-behandlede SW480-celler ble aktivert med LPS i 4 timer og høstet ved hjelp av RIPA-lysebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na
2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na
3VO
4, 1 ug /ml leupeptin). For kjerneekstrakt forberedelse og proteinkonsentrasjonen besluttsomhet, ble produsentens (Thermo Scientific, Rockford, IL) protokoller for NE-PER Nuclear Utvinning reagenser og Pierce BCA Protein Assay kit fulgt. Proteiner (50 mikrogram /kjørefelt) ble separert med 12% SDS-PAGE og produktene var elektro-overført til polyvinyldene (PVDF) membraner (Thermo Scientific, Rockford, IL). Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time, vasket tre ganger i PBS, inkubert med primært antistoff (kanin-anti-β-aktin fra Santa Cruz Biotechnology, og kanin-anti-STAT1 og anti-fosforylert STAT1 [Ser727] fra Millipore) over natten, vasket tre ganger i Tween-20 (0,1% i PBS) og inkubert med 800 Dylight anti-kanin-sekundært antistoff fra Li-Cor i 1 time, alt ved romtemperatur. Etter skylling i Tween-20 (0,1% i PBS) ble blotter avbildes med en Odyssey infrarød bildesystem (Li-Cor).
Kvantitativ Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
Celler ble sådd ved en tetthet på ~3-5 x 10
6 per brønn i 6-brønners plater 18-24 timer før behandling, deretter skylt to ganger med kald PBS og høstet etter behandling [26]. Brikken Analysen ble utført ved anvendelse av en modifisert versjon av en tidligere publisert metode [27]. Cellene ble suspendert i iskald Buffer 1 (0,06 M KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, 15 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 0,3 M sukrose, 180 ug aprotinin, 5 mM natriumbutyrat, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) og Buffer 2 (0,8% NP40 + Buffer 1) i 10 minutter på is. Cellesuspensjoner ble tilsatt til nye rør inneholdende Buffer 3 (0,06 M KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, 15 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 1,2 M sukrose, 180 ug aprotinin, 5 mM natriumbutyrat, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT). Etter at prøvene ble sentrifugert, ble kjernene oppsamlet og re-suspenderes i MNase fordøyelse buffer (0,32 M sukrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,6, 4 mM MgCl
2, 1 mM CaCl
2, 0.1 mM PMSF, 5 mM natriumbutyrat), inkubert i et 37 ° C vannbad i 6 minutter, og 20 ul 0,5 M EGTA tilsatt for å stoppe reaksjonen. På denne måte ble det kromatin spaltet til et gjennomsnitt DNA lengde på 300-800 bp. Etter sentrifugering av supernatanten inneholdt den første løselige fraksjon av kromatin, S1. Pelleten ble resuspendert i dialysebuffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,6, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 5 mM natriumbutyrat), plassert på is i 1-2 timer, og sentrifugert. Den resulterende pellet var den andre løselige fraksjon kromatin, S2. Aliquoter av de to kromatin fraksjoner (10-20 ug S1 og S2 10-20 ug) ble blandet, volumet ble fortynnet til 1 ml med Chip inkuberingsbuffer (Abcam), og blandingen ble underkastet immunoutfelling med spesifikke antistoffer, med rotasjon natten over ved 4 ° C. Immunoutfelt Kromatin ble hentet ved hjelp av protein-A sepharose og renset ved hjelp av en DNA-rensende slurry (Diagenode, Denville, NJ). En porsjon av hver immunopresipitert DNA-templat (100-150 ng) ble benyttet for kvantitativ real-time PCR-analyse ved bruk av sekvens-spesifikke gen-promotorprimerne (tabell 2). PCR-amplifiserte DNA-immunopresipitert signal ble normalisert til PCR-signal fra ikke-immunopresipitert inngangs DNA [28]. Resultatene oppnådd ved utfelling med kontroll IgG signaler ble subtrahert fra de signaler som oppnås med de spesifikke antistoffer. Beregninger var basert på gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter, og resultatene er uttrykt som en prosentdel av inngangs (figurene 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).
Statistisk analyse
den statistiske betydningen av behandlingsgruppene ble vurdert av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts posthoc analyse for sammenligning av individuelle behandlingsgruppen med kontrollgruppen. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. En sannsynlighet (
p
) verdi på 0,05 eller mindre ble ansett for å være kriteriet for en betydelig forskjell.
Resultater
Effekt av PEITC på genekspresjon i humane celler
for å revurdere genuttrykket resultatene som svar på PEITC behandlinger oppnådd i vår tidligere studie av mus makrofager [12], gjennomførte vi analyseoptimaliseringer ved hjelp av tre humane cellelinjer: den menneskelige monocytic cellelinje THP-1 og menneske kolon epiteliale cellelinjer HT-29 og SW480. Optimalisering inkludert induksjon parametere av den inflammatoriske respons i celler behandlet med LPS eller LPS + IFNy og utvalg av ikke-cytotoksiske PEITC konsentrasjon og eksponeringsvarigheter. Informasjon eksisterte ikke i litteraturen om PEITC virkninger i SW480 og THP-1 celler. I forrige undersøkelse [12] ble 21 LPS-indusert gener trykt tre ganger eller mer ved 10 mikrometer PEO (PEITC Essential Oil) sammenlignet med LPS-aktivering alene RAW 264,7 musemakroceller. (PEO er PEITC hentet fra
Barbarea Verna
frø [15] Både PEO og kommersielt kjøpt PEITC er sammensatt av .. 95% ren PEITC I denne studien med THP-1, HT-29, og SW480 celler, inkludert vi to ekstra gener, MMP7 og MMP9, for totalt 23 siste gener av interesse (GOI). PEITC undertrykte 9, 3, og 13 av de 23 genene i THP-1, HT-29, og SW480 celler , henholdsvis (tabell 3). resultatene viste også at SW480 celler ble den mest mottakelig for IFNy-primet LPS induksjon mellom de tre cellelinjene som ble testet. de 13 genene nedregulert ved PEITC behandling i SW480 celler representerer sentrale cellulære aktører i inflammasjon og kreft. Derfor er alle etterfølgende genekspresjon eksperimenter ble utført ved anvendelse av disse 13 gener i SW480-celler. de 10 genene som ble screenet, men ble ikke indusert /uttrykt i humane cellelinjer er ikke nærmere omtalt i dette manuskriptet. etter genekspresjon analyser , endringer i histonmodifikasjonene (H3K27me3, H3K9me2, og H3-Ac) i promotorområdene til hver av disse 13 gener ble undersøkt. Vi observerte differensial H3-modifikasjoner i forhold til kontroller for bare seks av disse 13 gener, som er omtalt i detalj i manuskriptet. Alle 13 gener, om ikke H3 endringer ble observert i sine promotorområdene i forbindelse med PEITC eksponering, oppført i Tabell 3.
Effekt av PEITC på Colon Cancer (SW480) Cell Proliferation
Flere av de utvalgte gener observert å være modulert av PEITC i SW480 celler regulere celleproliferering i løpet av carcinogenese (tabell 3). Derfor har vi undersøkt hvorvidt PEITC hatt en antagonistisk effekt på tumorcelleformering, finne at PEITC dempes levedyktighet i SW480-celler i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte (figur 1A). Interessant, PEITC konsentrasjoner og eksponeringstider er nødvendig for å stanse cancercelle multiplikasjon er høyere og lengre, henholdsvis, enn de som er nødvendige for å indusere endringer i kromatin kjemi (figurene 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) og gen uttrykket (figurene 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). For konsentrasjoner på under 80 um, i det minste en 24 timers eksponering var nødvendig for å indusere signifikant cancercelledød (figur 1). For de fleste av de gjenværende forsøk (figurene 2, 3, 4, og 6), vi brukte en PEITC eksponering av 5 timer på eller under 15 pM. På figurene 5 og S1, S2, S3, S4, S5, 10 uM PEITC ble anvendt ved forskjellige tidspunkter i SW480 celler i opptil 18 timer for PEITC eksponeringstid. En 10 pM konsentrasjon av PEITC i vesentlig grad påvirket cellelevedyktighet ved eller utover 24 timer (figur 1A), og en DNA-fragmentering assay (figur 1B) viste at de antiproliferative virkningene av PEITC kan skyldes apoptotiske opp-regulering som også vist ved høyere ekspresjon av kaspase 3 og 8 (figur 1C). Fraværet av betydelige endringer i cellesyklusen protein CyclinD1 (CCND1) indikerer at PEITC ikke direkte hemmer cellesyklusen (figur 1C).
Modulation kjemokiner ved PEITC i Human kolon celler
kjemokiner spille en viktig rolle i opprettholdelsen av inflammatoriske prosesser i tykktarmen. Fremstillingen av kjemokiner i tarmen etablerer et kjemotaktisk gradient stand til å øke migreringen av monocytter /makrofager, granulocytter og lymfocytter fra blodstrømmen gjennom endotelet til både mucosa og submucosa i løpet av kroniske inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) [29]. Tidligere, observerte vi at PEITC redusert betennelse, uttømming av slimceller, og infiltrasjon av inflammatoriske celler i mus mucosa og submucosa [12]. I denne studien ble konsentrasjonsavhengig PEITC-mediert demping av mRNA nivåer av fire proinflammatoriske kjemokiner /cytokiner (2CCl, CSF2, CXCL10, og IL8) observert i SW480 celler (tabell 3, figur 2). Individuelle chip eksperimenter på disse chemokin arrangører avslørte hyper-trimethylation av H3 på lysin 27 (økt H3K27me3 stater) rundt promotorområdene av IL8 og CCL2 og ytterligere redusert acetylering rundt promotorområdene av IL8 assosiert med 10 mm PEITC eksponering (tabell 3- 4, figur 3A og 4). Imidlertid er en tidsavhengig invers korrelasjon ble observert for H3K27me3 (undertrykkende merke), men ikke H3-Ac med IL8 mRNA-ekspresjonsnivåer (tabell 4, fig S5). I tilfelle av CCL2, ble mRNA-nivåer og H3K27me3 tilstander observert å variere sammen, utelukker en potensiell årsakssammenheng (tabell 4, fig S4). Selv om polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) -catalyzing H3K27 trimethylation er involvert i cytokingen omprogrammering i respons til inflammatoriske stimuli, [30], [31], den tilsynelatende selektivitet av PEITC i sammenheng med histonmodifikasjonene omgir promotorområdene til de målrettede kjemokiner /cytokiner leder oss til å tro at PEITC er usannsynlig å direkte påvirke PRC2.
PEITC eksponering perturbs transkripsjonsfaktor Aktiviteter i Human kolon celler
de NFκBs og statistikk er to viktige familier av transkripsjonsfaktorer aktivert som reaksjon på en rekke stimuli for å regulere flere cellulære prosesser, inkludert immunresponsen og karsinogenese. De NFκBs og statistikk har forskjellige samt synergieffekter på nedstrøms effektor genet induksjon [32]. Rollen av NFkB i IBD [33], så vel som effekten av PEITC på NFkB-aktivitet [34], [35], [36], [37] er godt undersøkt. Her observerte vi PEITC-mediert ned-reguleringen av ulike NFkB familiemedlemmer, nemlig NFκB1, NFκBiα og REL proteiner, som ikke tidligere var rapportert for SW480 celler (tabell 3, figur 2). Intriguingly, ble en tidsavhengig økning i H3K27me3 tilstand assosiert med en tidsavhengig reduksjon i NFκB1 ekspresjon i PEITC-eksponerte celler, noe som antyder potensiell epigenetisk regulering av NFκB1 som fortjener fremtidig validering (tabell 4, figurene 3A, S1).
