Abstract
Bakgrunn
Oppdager en ny effektiv og hypotoxic kreft narkotika er en voksende ny strategi for kreft kjemoterapi. Doxycycline (DC) er en form for antibiotika, men også hemmer tumordannelse.
Metoder
MTT og celle invasjon analysen, flowcytometri, ble western-blot analyse og nakne mus brukt for å undersøke effektene og underliggende mekanismer for doksycyklin på epiteliale eggstokkreft celler
Resultater
Doxycycline hemmet spredning og invasjonen av SKOV3 og SKOV3 /DDP.; indusert moderat apoptose av SKOV3 /DDP. CXCR4 uttrykk på både mRNA og proteinnivåer ble nedregulert i begge cellelinjene ved behandling med doksycyklin. Akt og ERK1 /2 var involvert i doksycyklin effekt på celleproliferasjon av SKOV3 men ikke fra SKOV3 /DDP. Akt og EKR1 /2 fosforylering ble aktivert av SDF-1α, som deretter ble inhibert med doksycyklin i SKOV3. Pro-kaspase-3 ekspresjon var signifikant høyere i SKOV3 enn den i SKOV3 /DDP som ble oppregulert ved behandling med doksycyklin. In vivo, doksycyklin hemmet peritoneal svulst xenograft og redusert maligne ascites.
Konklusjon
Doxycycline ikke bare har en hemmende effekt på kreft i eggstokkene, men også kan øke følsomheten for cisplatin. SDF-1α /CXCR4-regulert Akt og ERK 1/2 aktive sannsynligvis er involvert i antitumoreffekt av doksycyklin på SKOV3-celler, mens oppregulering av pro-kaspase-3 kan være den viktigste mekanisme som er involvert i SKOV3 /DDP-celler.
Citation: Wu W, Yu Lh, Ma B, Xu Mj (2014) hemmende effekt Doxycycline på Cisplatin-Sensitive og motstandsdyktig ovarialcancer. PLoS ONE 9 (3): e89841. doi: 10,1371 /journal.pone.0089841
Redaktør: Han-Ming Shen, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore
mottatt: 20 juli 2013; Godkjent: 27 januar 2014; Publisert: 05.03.2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology Commission av Shanghai kommune (nr 10411960100) og Changhai Hospital (No. CH125510105). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) står for over 90% av alle eggstokkene maligniteter og er primært en sykdom hos postmenopausale kvinner, som forekommer oftest i sjette og syvende tiår av livet [1]. Den representerer den vanligste dødsårsaken blant kvinner med gynekologiske kreftformer og den samlede fem års overlevelse er bare 30% [2].
I dag standard behandling for eggstokkreft innebærer svulst debulking og platina-basert kjemoterapi [3]. Responsen på dette regimet er minst 70% av tilfellene, men 60-80% av første responders vil tilbakefall innen 18 måneder med en platinum-resistent sykdom [4].
Cisplatin (DDP), en noncycle -avhengig cytotoksiske platina derivat, har blitt hyppig brukt i ulike solide tumorer, inkludert mage, testiklene, urologisk, hode, nakke, og eggstokkreft [5]. Platinaforbindelser utøve sin cytotoksiske effekten ved å danne intra platina-DNA kryssbindinger. Dette hemmer DNA-replikasjon, og til slutt fører til apoptose [6]. Men i likhet med andre kreft narkotika, cisplatin-motstand er fortsatt en betydelig hindring for klinisk suksess. De fleste pasienter med tilbakevendende eggstokkreft vil etter hvert utvikle platinum-resistent sykdom [7], noe som gjør kreftceller ildfaste til terapi. Derfor er det nødvendig å søke nye økonomiske og effektive cellegift som har antitumor aktiviteter og /eller øke antitumor responser til platina-basert kjemoterapi.
Doxycycline (DC) er en form for andregenerasjons tetracykliner som er vanlig brukes til å behandle en rekke infeksjoner. Aktuelle studier har vist at doksycyklin er en pluripotent medikament som påvirker mange anticarcinogenic funksjoner, inkludert antitumorvekst effekt på human oral plateepitelkreft og inhibering av migrering av melanomceller [8] – [9]. Doxycycline har også et potensial for økt terapeutisk aktivitet av biologiske kreftbehandling [10]. Men effekten av doksycyklin på ovarialcancer celler og de underliggende mekanismene er fortsatt ukjent.
Derfor, i vårt eksperiment, ønsker vi å vise at doksycyklin har en anticancer aktivitet på epitelceller eggstokkreft celler, og å utforske videre de underliggende mekanismene som er involvert.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle prosedyrer i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Second Military Medical University. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell kultur og reagenser
Menneskelige eggstokkreft cellelinjer HO8910 ble innhentet fra avdelingen for patofysiologien ved Second Military Medical Universitet. SKOV3 og dens beslektede cisplatin-resistente celler SKOV3 /DDP ble oppnådd fra ATCC (American Tissue Culture Collection). SKOV3.ip celler ble gitt av Institutt for gynekologi og obstetrikk, Shanghai First Folkets sykehus (hentet fra ATCC). Celler ble opprettholdt i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Cisplatin, doksycyklin, SDF-1α, antistoff mot β-actin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Antistoffer mot CXCR4, fosfor-Akt, total Akt, fosfor-ERK, total ERK, MMP-2, MMP-9, ble caspase-3 kjøpt fra Cell Signaling Technology. Transwell kit ble kjøpt fra BD, USA. ELISA kit ble kjøpt fra R D, USA. Cell apoptotisk kit ble kjøpt fra Roche, USA. Små forstyrrende RNA ble syntetisert ved Genepharma Company (Shanghai, Kina). Xfect Transfeksjon Agent ble kjøpt fra Clontech, USA. RNeasy MINIKIT ble kjøpt fra Qiagen, Clifton Hill, Australia.
MTT analyse
Som vi rapporterte før
11, ble MTT (methylthiazoltetrazolium) analyser utført for å vurdere celle levedyktighet. Celler suspensjonen ble sådd ut i 96-brønners plater etter 12 timer for feste og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin eller doksycyklin. Medikament-behandlede celler ble inkubert i 48 timer og deretter 5 mg /ml MTT-oppløsning ble tilsatt til kulturene i ytterligere 3-4 timer. Til slutt ble mediet som inneholdt MTT suges fra, og 100 pl DMSO-oppløsning ble tilsatt. Som et resultat av levende celler dannet krystaller på grunn av tilstedeværelsen av MTT. Krystaller ble oppløst av DMSO og absorbansen ble målt ved 490 nm ved en immunosorbent leser.
Real-time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av en RNeasy MINIKIT (Qiagen, Clifton Hill, Australia) . To ug total RNA ble reverstranskribert til cDNA i en 25 pl reaksjon inneholdende 15 nmol /l MgCl2, 375 mmol /l KCl, 50 mmol /l ditiotreitol, 250 mmol /l Tris-HCl (pH 8,3), 10 mmol /l alle fire dNTP, 20 U RNase hemmer, 200 U M-MLV revers transkriptase, og 50 ng oligo18 primer. Blandingen ble inkubert ved 70 ° C i 5 minutter og deretter ved 42 ° C i 60 minutter fulgt av 10 minutter ved 70 ° C. De følgende primere ble anvendt: CXCR4, 5-CCAACGTCAGTGAGGCAGAT-3 (forover) og 5-GGCAGGATAAGGCCAACCAT-3 (revers); β-aktin, 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (fremover) og 5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (bakover). Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) i en 25 pl reaksjonsblanding. 2 x Taq PCR masterblanding og 0,2 umol /l hver primer ble anvendt. Real-time PCR betingelser ble optimalisert ifølge foreløpige eksperimenter for å oppnå en lineær sammenheng mellom RNA konsentrasjon og PCR-produkter. Spesifisiteten av primerne ble bekreftet ved å undersøke smeltekurven, så vel som påfølgende sekvensering av sanntids-RT-PCR-produktene. Destillert vann ble brukt i stedet for cDNA som en negativ kontroll. Alle prøver ble normalisert mot indre β-aktin kontroll. Genekspresjon ble beregnet ved hjelp av sammenlignende terskel syklus (Ct) -metoden.
Western-blot analyse
Som vi rapporterte tidligere [11], ble cellene høstet og homogenisert i kaldt lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoksykolsyre natriumsalt, 0,1% SDS, og protease-inhibitor blanding) ved hjelp av en homogenisator. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved Bradford-metoden ved bruk av bovin serum som standard. Like mengder av proteiner ble separert ved 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Etter blokkert i blokkeringsbuffer bestående av 20 mM Tris-HCl, pH 7.4,137 mM NaCl, 0,1% Tween 20 og 5% fettfri melk i 2 timer ved værelsestemperatur, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C i primære antistoff (anti -β-aktin 1:1000, anti-CXCR4 1:1000, anti-fosfor-Akt 1:1000, anti-total-Akt 1:1000, anti-fosfor-ERK 1:1000, anti-total-ERK 1:1000 , anti-MMP-2 1:1000, anti-MMP-9 1:1000). Blottene ble deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (1:1000, Santa Cruz) i 2 timer ved romtemperatur, og til slutt visualiseres i ELC oppløsning. For 1 min og eksponert på Kodak film for 1-30 min. For kontroll av riktig gel lasting, ble β-aktin kvantifisering anvendt. For å kvantifisere Western blot-signaler, ble bandet tetthet målt ved anvendelse av UMAX PowerLook III og normalisert med hensyn til kontrollen.
ELISA-analysen
Mengdene av SDF-1 i kondisjonert medium ble bestemt ved hjelp av sandwich- ELISA (sensitivitet 15 pg /ml) i henhold til produsentens protokoller.
Cell invasjon analysen
SKOV3 og SKOV3 /DDP celle invasjoner ble evaluert ved hjelp av 24-brønns transwell cellekultur kamre med 8,0 mikrometer pore polykarbonat filterinnsatser. Filtrene ble først belagt med BD matrigel. Den stamløsning av Matrigel ble fortynnet ved bruk av serumfritt RPMI-1640 medium (01:01). En mengde av fortynnet matrigel ble malt inn i hver filterinnsats og holdt ved romtemperatur i 10-15 minutter for å tørke. Deretter ble dyrkede celler trypsinert og suspendert i serumfritt RPMI-1640 medium ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 ml. I alt 500 pl 10% FBS /RPMI-1640 medium eller 500 pl av 50 ng /ml SDF-1-løsning ble tilsatt til det nedre kammer og 100 ul cellesuspensjon ble anbrakt på belagte innleggs filtre. Kammeret ble inkubert i 3 timer for å tillate cellefesting deretter celler ble behandlet med doksycyklin. Kammeret ble inkubert i 36 timer for å tillate celle invasjon; innskuddet ble deretter fiksert med dehydrert alkohol i 15 minutter, og deretter beiset med 0,1% krystallfiolett i 15 min og vasket med 1 x PBS. Unødvendige cellene på den øvre eller nedre siden av filteret ble skrapet. Membranen ble montert på et lysbilde og deretter undersøkt under et mikroskop bruker 20 × forstørrelse. Invasion ble kvantifisert ved å måle de fargede celler i tre tilfeldige områder per membran.
Flowcytometrisk analyse av celle apoptose
Celler ble samlet og dobbel farget med fysoerytrin-konjugert Annexin V og PE i henhold til produsentens instruksjoner. Annexin-V-positive celler ble betraktet som apoptotiske, og deres prosentandel av det totale antall celler ble beregnet. Ti tusen hendelser ble samlet for hver prøve ved hjelp av et Becton Dickinson FACScan (flowcytometrisystemer Facility, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York), og data ble analysert ved hjelp av Winlist program (VeritySoftware House, Topsham, ME).
siRNA transinfected teknologi
målsekvenser for ERK var 5’GUGCUCUGCUUAUGAUAAUTT-3 «(fornuft) og 5’AUUAUCAUAAGCAGAGCACTT -3» (antisense). AKT siRNA var: 5- GACGGGCACAUUAAGAUCATT-3 (sense) og 5- UGAUCUUAAUGUGCCCGUCTT -3 (antisens). Scramble siRNA tomannsboliger ble utformet (5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 og 5- ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3) som en negativ kontroll (NC). Cellene ble transfektert med 25 Nm målet sirnas eller kontrollere siRNA hjelp Xfect Transfeksjon Agent i henhold til produsentens anvisninger, og transfeksjon ble utført i 24 timer (for AKT og ERK). Deretter ble kulturmediet erstattet med 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS. Etter 48 timer ble MTT-analyser utført for å vurdere cellelevedyktighet.
Peritoneal tumor xenograft i nakne mus
Nude (BALB /c-nu) mus (4 uker, 18-20 g, forutsatt ved Chinese Academy of Science, Beijing) ble delt inn i tre grupper: en kontrollgruppe, en svulst gruppe og en doksycyklin-behandlede tumor gruppe. For tumoren gruppe, injiserte vi SKOV3.ip celler til musene bukhulen ved en densitet på ca. 8 x 10
6 /ml. Cellene ble resuspendert i 400 ul serumfritt RPMI-1640-medium og deretter injisert. For doxycycline-behandlede tumor gruppe, etter injisert kreftceller i 14 dager, doksycyklin (3 mg /mus) var i.p. injiseres hver dag for å undertrykke tumorvekst. For kontrollgruppen ble musene behandlet med samme volum av PBS. Alle mus ble avlivet på dag 21 etter den første injeksjonen. Mus vekt, ble tumor størrelser og ascites vurdert i alle tre gruppene.
Statistisk analyse
Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM Forsøkene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre. Uparede Studentenes test ble brukt for to grupper av data. En måte ANOVA ble brukt for multiple sammenligninger (SPSS programvare versjon 16.0), p-verdier og 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Doxycycline hemmer spredning av ovarialcancer celler
.
Etter 48 timers behandling med cisplatin og doksycyklin i forskjellige konsentrasjoner, ble cellelevedyktigheten ble redusert på en doseavhengig måte i HO8910 (fig. S1A, B), SKOV3 (fig. 1 A, C) og SKOV3 /DDP (fig. 1B, D). IC
50 av doksycyklin i SKOV3 ble sammenlignet med det i SKOV3 /DDP. Resultatene viste at IC
50 var 16,33 ug /ml i SKOV3 (fig. 1C) og 8,53 ug /ml i SKOV3 /DDP (Fig. 1D) henholdsvis, noe som indikerte at SKOV3 /DDP-celler var mer følsomme for doksycyklin behandling enn SKOV3-celler.
SKOV3 (A, C) og SKOV3 /DDP (B, D) cellenes levedyktighet ble inhibert på en doseavhengig måte ved behandling med cisplatin og doksycyklin. E, F viste at samtidig behandling med cisplatin (1,5 ug /ml og 2,5 ug /ml) og doksycyklin (10 ug /ml) hadde en betydelig veksthemming i SKOV3-celler sammenlignet med den for cisplatin eller doksycyklin behandles alene. G, H viser at når den kombineres doksycyklin (2,5 og 5 ug /ml) med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin, IC
50 av cisplatin i SKOV3 /DDP-celler var 3,36 og 2,66 ug /ml henholdsvis. n = 9. *,
p
0,05; **,
p
0,01
Doxycycline sensitizes eggstokkreft celler til cisplatin
Vi har utført eksperimenter med co-anvendelse av cisplatin og doksycyklin.. For det første valgte vi to lave doser (1,0 og 1,5 ug /ml) av cisplatin og kombinert dem med lav-dose doksycyklin (0-10 ug /ml) respektivt. I HO8910-cellelinjen, ble en signifikant inhibering av cellevekst observert 48 timer etter samtidig anvendelse av 1,0 ug /ml (fig. S1C) eller 1,5 ug /ml (fig. S1D) cisplatin med 7,5 eller 10 pg /ml doksycyklin, mens cisplatin behandlet alene manglet effekten. De tilsvarende resultater er vist i SKOV3 cellelinje, med en signifikant inhibering av cellevekst ved kombinasjon av 1,5 ug /ml (fig. 1E) eller 2,5 ug /ml (fig. 1F) cisplatin med 10 ug /ml doksycyklin. Neste, valgte vi to doser (2,5 og 5 ug /ml) av doksycyklin og kombinert dem med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (0-100 ug /ml), henholdsvis. IC
50 av cisplatin i nærvær av doksycyklin (2,5 og 5 ug /ml) var 3,36 ug /ml og 2,66 pg /ml, henholdsvis (fig. 1G, H), som var mye lavere enn for cisplatin alene (fig. 1C, IC
50 = 10,14 mg /ml).
cisplatin og Doxycycline hemme invasjonen evne ovarialcancer celler
effekten av cisplatin og doksycyklin på invasjonen evnen til tumorceller ble undersøkt ved en invasjon assay. For det første, valgte vi 1,5 ug /ml og 5 ug /ml cisplatin for å behandle SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler hhv. Fig. S2A, B representert tumorcelle-invasjon evne i nærvær (c) eller fravær (d) av cisplatin i begge SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler. Vi fant at cisplatin hadde en hemmende effekt på eggstokkceller invasjon evne. Deretter valgte vi 10 ug /ml doksycyklin for å behandle SKOV3-celler og 5 ug /ml doksycyklin for å behandle SKOV3 /DDP-celler. Figur 2A, B representert tumorcelle-invasjon evne i nærvær (c) eller fravær (d) av doksycyklin i begge SKOV3 (Fig. 2A) og SKOV3 /DDP (Fig. 2B) celler. For første gang har vi funnet at doksycyklin kunne hemme invasjon evne til både SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler.
Cellene ble dyrket i transwell med angitte doksycyklin i 36 /DDP-celler ved 4 og 2 henholdsvis folder. a: 100 ul serumfritt cellesuspensjonen (etter at cellene festet) med doksycyklin-behandlede (10 pg /ml) i belagte innsatsfiltre; 500 ul serumfritt RPMI-1640 medium med doksycyklin (10 ug /ml) i de nedre kamre, ble bilder fotografert fra oversiden av membranene. b: 100 ul serumfritt cellesuspensjon i belagte innsatsfiltre; 500 ul serumfritt RPMI-1640 medium i de nedre kamre, ble bilder fotografert fra oversiden av membranene. c: 100 ul serumfritt cellesuspensjonen (etter at cellene festet) med doksycyklin-behandlede (10 pg /ml) i belagte innsatsfiltre; 500 ul 10% FBS /RPMI-1640 medium i de nedre kamre, ble bilder fotografert fra den nedre side av membranene. d: 100 ul serumfritt cellesuspensjon i belagte innsatsfiltre; 500 ul 10% FBS /RPMI-1640 medium i de nedre kamre, ble bilder fotografert fra den nedre side av membranene. c /a representerer forholdet av celler som kommer skjønt membranen av filterinnsats med doksycyklin behandling. d /b representerer forholdet av celler som kommer skjønt membranen av filterinnsatsen uten doksycyklin. C, D viste at Doxycycline hemmer SDF-1α-indusert invasjonen i begge cellelinjer og en moderat apoptose indusert av doksycyklin i SKOV3 /DDP celler og hemming av doksycyklin på SDF-1α sekresjon i SKOV3 celler. C: SDF-1α økt invasjon av SKOV3-celler ved 9 folder som ble inhibert av doksycyklin (10 ug /ml). D: SDF-1α bare økt invasjon av SKOV3 /DDP-celler med 1,5 folder som ble inhibert av doksycyklin (5 ug /ml). n = 3, *,
p
0,05, **,
p
. 0,01
Doxycycline hemmer SDF-1α-indusert tumorcelle invasjon i eggstokkreft celler
SDF-1α er medlem av kjemokiner og spiller en viktig rolle i metastasering av eggstokkreft [12]. For å undersøke hvorvidt SDF-1α kunne fremme den invasive evne eggstokkreft celler, deretter endret vi den induserte-faktor (10% FBS) til SDF-1α (50 ng /ml). Som vist på fig. 2C, SDF-1α økt invasjon av SKOV3-celler ved 9 folder, som kan være betydelig inhibert av doksycyklin. Mens i SKOV3 /DDP-celler, SDF-1α i samme dose bare økt invasjon evne ved 1,5 ganger, hvilket kan også bli inhibert av doksycyklin (fig. 2D).
Doksycyklin induserer apoptose av SKOV3 /DDP men ikke av SKOV3-celler
apoptotiske forhold ble testet i to cellelinjer etter behandling med 5, 10 og 20 ug /ml doksycyklin i 12 timer. Som vist i figur 3A, doksycyklin (20 ug /ml) økt apoptose av SKOV3 /DDP-celler med 13 folder, mens hadde ingen effekt på SKOV
3-celler
A:. Strømningscytometrisk analyse som viser celle apoptose etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av doksycyklin i 6 timer. 20 ug /ml doksycyklin økt apoptose av SKOV3 /DDP-celler med 13 folder. B: ELISA-analyse som viser doksycyklin (10 ug /ml) inhiberte sekresjonen av SDF-1α i SKOV3-celler i en tidsavhengig måte. Real-time PCR og Western blot-analyse som viser effekten av doksycyklin på CXCR4 ekspresjon i både mRNA og proteinnivåene i SKOV3-celler (C, E) og SKOV3 /DDP-celler (D, F). Etter behandling med doksycyklin av angitte konsentrasjoner i 48 timer, CXCR4-ekspresjon i både mRNA og proteinnivåer ble inhibert signifikant på to cellelinjer. n = 3. *,
p
0,05, **,
p
. 0,01
Doxycycline hemmer SDF-1α sekresjon i SKOV3 celler, men ikke i SKOV3 /DDP-celler
SDF-1α og dets reseptor CXCR4 spiller en viktig rolle i prosessen med tumorinvasjon og metastase [13], vi deretter utført ELISA-analyse for å bestemme hvorvidt doksycyklin kunne hemme sekresjon av SDF-1α i to cellelinjer. Resultatene viste at i SKOV3, ble SDF-1α sekresjon i betydelig grad redusert ved behandling av doksycyklin i en tidsavhengig måte, med det minimale nivået observert ved 180 min (Fig. 3B). Men sekresjon av SDF-1α ble ikke påvist i SKOV3 /DDP.
Doxycycline reduserer CXCR4 mRNA og proteinnivåer i SKOV3 og SKOV3 /DDP celler
CXCR4 kunne aktiveres ved SDF-1α og er den eneste av 14 kjemokin reseptorer uttrykt i en undergruppe av tumorceller i eggstokkene neoplasmer og primær ovarietumorer [14]. I våre eksperimenter ble celler behandlet med ulike konsentrasjoner av doksycyklin i 48 timer, deretter CXCR4 mRNA og proteinnivåer ble undersøkt av real-time PCR og western blot analyse. Vi fant ut at doksycyklin hemmet CXCR4 uttrykk på både mRNA (fig. 3C. D) og proteinnivåer (Fig. 3E, F) i begge SKOV3 og SKOV3 /DDP cellelinjer.
Cisplatin og Doxycycline hemme cellenes levedyktighet gjennom Akt og ERK baner i SKOV3 men ikke i SKOV3 /DDP-celler
Det er blitt rapportert at cisplatin motstand av human ovarian cancer er relatert til aktivering av PI3K /Akt og ERK1 /2 signalveier [15] – [16 ], deretter bestemt vi den potensielle engasjement av disse to baner i cisplatin og doxycycline virkninger på ovariecancer celleproliferasjon. Etter tappe Akt og ERK av siRNA (Fig. 4A, B), viste MTT resultater som reduksjon av Akt og ERK uttrykk kunne svekke den hemmende effekt på spredning ved behandling med cisplatin og doksycyklin i 48 timer i SKOV3 (fig. 4C, D , G, H), men hadde ingen virkning på proliferasjonen av SKOV3 /DDP-celler (fig. 4E, F, i, J).
Reduksjon av Akt og ERK ekspresjon av Akt og ERK siRNA kunne dempe den inhiberende effekten på proliferasjon når de ble behandlet med cisplatin og doksycyklin i 48 (C, D, G, H), men hadde ingen virkning på proliferasjonen i SKOV3 /DDP-celler (E, F, i, J) *,
p
**,
p
. 0,01
Doxycycline hemmer SDF-1α-indusert aktivering av Akt eller ERK i SKOV3 men ikke i SKOV3 /DDP
I for å forstå hvorvidt SDF-1α-indusert Akt og /eller ERK-fosforylering i to cellelinjer kan bli inhibert av doksycyklin, utførte vi en serie eksperimenter med forbehandling. For det første, undersøkte vi fosforylering av Akt og ERK i SKOV3 etter SDF-1α behandling (50 ng /ml) i forskjellig tid (0, 2, 5, 10, 20, 40 min). Som vist på fig. 5A, B, SDF-1α stimulert Akt og ERK-fosforylering i en tidsavhengig måte. Den Akt og ERK var betydelig fosforylert og nådde et maksimum ved 10 eller 20 min etter SDF-1α behandling. De tilsvarende forsøk ble så utført i SKOV3 /DDP. Spesielt var det ingen aktivering av ERK Akt og etter behandling av SDF-1α (data ikke vist). Videre, vi forkortet behandlingstiden til mindre enn 10 min. Vi fortsatt ikke finne noen aktivering av Akt (Fig. 5C) mens ERK-aktivering ble økt fra 0,5 min og nådde et maksimum på 1 min (fig. 5D). Deretter SKOV3-celler ble forbehandlet med doksycyklin (0, 5, 10 ug /ml) i 3 timer, og deretter ble påført med SDF-1α (50 ng /ml) i 10 minutter. Inhibering av fosfor-Akt og fosfor-ERK-nivåer ble observert etter påføring av 10 ug /ml doksycyklin (fig. 5E, F). Bruk av doksycyklin alene hadde ingen effekt. Tilsvarende SKOV3 /DDP-celler ble for-behandlet med den samme dose av doksycyklin i 3 timer, og deretter behandlet med SDF-1α (50 ng /ml) i 1 min. Doksycyklin hadde ingen effekt på Akt aktivering (fig. 5G). SDF-1α-indusert ERK-fosforylering ikke kunne bli blokkert av doksycyklin i en dose på 5 eller 10 pg /ml. (Fig. 5 H).
Etter behandling av SDF-1α (50 ng /ml) i 0, 2, 5, 10, 20, 40 minutter, AKT (A) og ERK (B) fosforylering i SKOV3 celler ble utvidet. Når den behandles SKOV3 /DDP med den samme dose av SDF-1α til 0, 0,5, 1, 2, 5 og 10 minutter, AKT-fosforylering (C) ble ikke endret, mens ERK-fosforylering (D) ble utvidet i betydelig grad. Deretter ble cellene forbehandlet med 0, 5, 10 ug /ml doksycyklin i 3 timer, deretter behandlet med SDF-1α (50 ng /ml) i 10 minutter (SKOV3) eller 1 min (SKOV3 /DDP), SDF-1α- indusert AKT (E) og ERK (F) fosforylering i SKOV3-celler ble kun inhibert ved samtidig anvendelse med doksycyklin ved dose på 10 ug /ml. I SKOV3 /DDP celler, gjorde SDF-1α ikke indusere AKT fosforylering (G) og forbedret ERK-fosforylering (H) kunne ikke bli blokkert av doksycyklin ved dose 5 eller 10 mikrogram /ml. n = 3. *,
p
0,05, **,
p
0,01, SDF-1a-behandlede grupper
vs
kontrollgruppe. #
p
0,01, SDF-1a pluss doxycycline co-behandlede grupper
vs
SDF-1 behandlede grupper
Doxycycline oppregulerer pro-caspase-. 3 ekspresjon i SKOV3 /DDP, men ikke i SKOV3
Caspase-3 er en viktig mediator av apoptose, og kan også være forbundet med chemoresistance av human eggstokk-kreft [17]. Vi observerte endringer i dens ekspresjon i to cellelinjer etter at doksycyklin behandling. For det første, sammenlignet vi Akt, ERK-fosforylering, CXCR4 og pro-kaspase-3 ekspresjon mellom to cellelinjer. Resultatene viste at det var ingen signifikant forskjell av Akt-fosforylering (Fig. 6A). ERK-fosforylering, CXCR4 og pro-kaspase-3 ekspresjon i SKOV3 /DDP var alle lavere enn de i SKOV3-celler, henholdsvis (fig. 6B, C, D). Deretter, behandlet vi to cellelinjer med 10 ug /ml doksycyklin i forskjellig tid (0, 0,5, 1, 2, 6, 12 timer). Som vist på fig. 6E, pro-caspase-3 uttrykk ble økt betydelig i SKOV3 /DDP, mens ikke endring i SKOV3.
Sammenligning av Akt, ERK, CXCR4 og pro-caspase-3 uttrykk i to cellelinjer. Det var ingen signifikant forskjell av Akt (A) fosforylering i de to cellelinjene. ERK-fosforylering (B), CXCR4 (C) og pro-kaspase-3 (D) ekspresjon i SKOV3 /DDP-celler var alle lavere enn de i SKOV3-celler, respektivt. Pro-kaspase-3-ekspresjon ble øket betydelig ved doksycyklin behandling i SKOV3 /DDP-celler, mens endret seg ikke i SKOV3-celler (E). n = 3. *,
p
0,05, **,
p
. 0,01
Doxycycline hemmer tumor xenograft
som et forsøk på å bestemme hvorvidt doksycyklin bidrar til tumorinhibering in vivo, vi brukte SKOV3.ip xenograft modell i nakne mus (BALB /c-nu). Fjorten dager etter injeksjon av tumorceller, doksycyklin (intraperitoneal injeksjon) ble deretter administrert (3 mg /d /per mus) for de neste 7 dagene. Tumordiametere, mus kroppsvekt og ascites nivåer i tumor gruppe og doksycyklin-behandlede gruppen ble analysert. Sammenlignet med de i tumor gruppe, ble tumordiameter og volumet av ascites redusert betraktelig i doksycyklin-behandlede gruppen (fig. 7B, C, F, G). Graden av aggregasjon av tumorceller i doksycyklin-behandlede gruppen (fig. 7E) var mindre enn den i tumor gruppen (fig. 7D). Videre, kroppsvekt hos doksycyklin-behandlede gruppen var tilnærming til den i (fig. 7 H) kontrollgruppe.
(A) Fra det ytre utseendet, ble buken av tumor gruppe utbuling åpenbart (b) enn den en i kontrollgruppen (a) og den i doksycyklin-behandlede gruppen (c). Doxycycline hemmet veksten av tumor xenograft (B, F) og volumet av ondartede ascites (C, G) i betydelig grad i doxycycline-behandlede tumor mus sammenlignet med de av tumor mus. (D) HE-farging viste at graden av aggregering av tumorceller i doksycyklin-behandlede gruppen (E) var mye mindre enn det i tumor gruppe. (H) Kroppsvekten i tumor gruppe var betydelig lavere enn de av enten kontroll-gruppe eller doksycyklin-behandlede gruppen. n = 6. **,
p
. 0,01
Diskusjoner
Cisplatin er en kjemoterapeutisk stoff for eggstokkreft. I tillegg til alvorlige bivirkninger, er det cisplatin-motstand også en stor hindring. Kombinasjon av noen ufarlige komponenter med kjemoterapi narkotika er en voksende ny strategi for kreft kjemoterapi for ytterligere å forbedre effektiviteten og redusere bivirkningene. Doxycycline er allment akseptert som et antibiotikum. I våre eksperimenter demonstrerte vi at doksycyklin ikke bare har en hemmende effekt på eggstokk-kreft, men også kan dramatisk øke kjemosensitivitet til cisplatin.
Imidlertid er den underliggende mekanisme fremdeles uklar. Noen forskere har rapportert at den antitumoreffekt av doksycyklin er forbundet med ulike nivåer av p53 i leverkreft [18]. En annen studie viser at doksycyklin kan indusere apoptose i menneskelige bukspyttkjertel og tykktarm kreft celler gjennom caspase-avhengig måte [19] – [20]. Våre funn, for første gang, viste at doksycyklin hemmet utskillelsen av SDF-1α i SKOV3, mens lignende fenomen ikke ble observert i SKOV3 /DDP-celler. Videre forskning viste at doksycyklin hemmet uttrykk for CXCR4 både mRNA og proteinnivåer, noe som tyder dens effekt kan være på transkripsjon nivå. Western-blot-analyse viste også at CXCR4 ekspresjon i SKOV3 /DDP var 20% lavere enn det i SKOV3. Disse resultatene antydet at SDF-1α /CXCR4 akse kan ha ulike roller i doxycycline effekter i de to cellelinjer. Flere forklaringer kan bidra til dette fenomen: 1) Ved aktivering, kan CXCR4 mediere tumormetastase. Tumorceller inn blodet eller lymfesystemet vil migrere og holder seg til områder med høy uttrykk for SDF-1α. Brystkreft celler følger dette mønsteret av metastasering [21]. Her beskriver vi at SKOV3 celler kan hemmelighet SDF-1α og den har høyere uttrykk av CXCR4. Videre fremmer SDF-1α invasjonen av SKOV3 av ni ganger. Basert på disse dataene, postulerte vi SDF-1 /CXCR4 akse spilte en avgjørende rolle i metastasering av SKOV3 celler ved å øke vedheft evnen til kreftceller, men SKOV3 /DDP kanskje ikke. 2) Noen andre studier indikerer at epigenetiske mekanismene som er involvert i den negative regulering av SDF-1α eller CXCR4 ekspresjon kan være nødvendig for tumormetastasering. Typisk modifikasjon av SDF-1α eller CXCR4 så som DNA metylering er forbundet med inaktivering av tumor-suppressorer. Det er bevis for at metylering av SDF-1α promoteren i det kolonepitelet fremmer metastase av tumorer i tykktarmen [22]. I tillegg, i bukspyttkjertelkreft, CXCR4-promoteren er blitt funnet å være regulert av DNA-metylering, noe som resulterer i lavere CXCR4 mRNA og proteinnivåene [23].
p
0.01.
doi:10.1371/journal.pone.0089841.s002
(TIF)
Acknowledgments
All
