Abstract
Oxidative stress, en viktig faktor i modulering av glykolysen og induksjon av stressgener aktivert, blir ytterligere forsterket på grunn av redusert antioksidantforsvar, som fremmer progresjon av kreft via indusere angiogenese. Curcumin, en naturlig forekommende Kjemopreventivt fytokjemisk, er rapportert å hemme karsinogenese i forskjellige eksperimentelle dyremodeller. Imidlertid er den underliggende mekanisme som er involvert i antikarsinogene virkningen av curcumin på grunn av sin langtidseffekt fremdeles å bli rapportert på grunn av dets hurtige metabolisme, selv om metabolittene akkumuleres i vevene og forblir i lengre tid. Derfor den langsiktige effekten av curcumin trenger grundig undersøkelse. Denne studien forsøkte å analysere anticarcinogenic handlingen av curcumin i leveren, selv etter seponering av behandling i Dalton lymfom bærende mus. Oksidativt stress observert under lymfom progresjon redusert antioksidantenzymaktivitet, og indusert angiogenese samt aktivering av tidlige spennings aktivert gener og glykolysen. Curcumin behandling resulterte i aktivering av antioksidant enzymet super oksid dismutase og nedregulering av ROS nivå samt aktivitet av ROS produsere enzymet NADPH: oksidase, uttrykk av stress aktivert gener HIF-1α, cMyc og LDH aktivitet mot normalt nivå. Videre kan det føre til signifikant inhibering av angiogenese, observerte via MMP-aktivitet, PKCα og VEGF nivå, samt av Matrigel plugg assay. Dermed funnene i denne studien konkluderer med at den langsiktige effekten av curcumin viser anticarcinogenic potensial via induksjon av antioksidantforsvar og hemming av angiogenese via nedregulering av stress aktivert gener og glykolysen i leveren av lymfom bærende mus.
Citation : Das L, Vinayak M (2014) langsiktige effekten av Curcumin i Regulering av glykolysen og Angiogenese via Modulation av stress Aktivert Gener i forebygging av kreft. PLoS ONE 9 (6): e99583. doi: 10,1371 /journal.pone.0099583
Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore
mottatt: 25 mars 2014; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 16 juni 2014
Copyright: © 2014 Das, Vinayak. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i papir
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institutt for vitenskap og teknologi (Grant No.-SR /S0 /AS-97/2007), Government of India til MV . Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forhøyede reaktive oksygenforbindelser (ROS) som superoksidradikaler og H
2o
2 fungere som signalmolekyler i ulike aspekter av vekstfaktor-medierte reaksjoner inkludert angiogenese under kreft progresjon. Den viktigste kilden til ROS produksjonen er regulert av NADPH oksidase. Den vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en stor angiogenese inducer, som stimulerer proliferasjon, migrering og rør dannelse av endotelceller (ECS) via VEGF-reseptoren type2. VEGF-indusert angiogenese formidles av proteinkinase C (PKC), som PKC er involvert i signalveien av VEGF-mediert tumorutvikling og angiogenese [1]. PKCα fremmer angiogen aktivitet av endotelceller via induksjon av VEGF og VEGF forbedrer sin egen ekspresjon via PKCα avhengig positiv feedback mekanisme [2]. Videre er VEGF regulert på transkripsjonsnivået ved hypoksi-induserbar faktor-1 α (HIF-1α) som reaksjon på hypoksi [3], [4]. HIF-1 regulerer ikke bare oksygentilførsel (angiogenese), men oksygenforbruk (glycolytic metabolisme) også i hypoksisk svulstens mikromiljø [5]. Uttrykk for en rekke gener som starter med onkogen-mediert fulgt av HIF-1 mediert gener induseres som fremmer metabolske endringer under kreftutvikling. Det resulterer i sterkt glykolytiske «Warburg» fenotype og undertrykkelse av mitokondriell biogenese [6]. Oppregulering av laktatdehydrogenase A (LDH-A) er en viktig formidler av molekyl Warburg effekt, som forekommer selv i aerob tilstand som en følge av hypoksiske tumormikromiljøet og forandringer i visse onkogener eller tumorsuppressorgener [7]. I tillegg er overekspresjon av LDH-A regulert av HIF-1 samarbeid med deregulert c-Myc. Det har blitt observert at onkogen aktivering deregulert ekspresjon av c-myc bidrar til tumorgenese i forskjellige vev i transgene mus og mange typer humane cancere, inkludert lymfomer [8]. Dermed er deregulering i ekspresjon av onkogener, tumor-suppressor-gener og stabilitets gener som er involvert i karsinogenese, som resulterer i et redusert nivå av antioksidantforsvar i tumormikromiljø og kreftceller [9]. Videre, matriks-metalloproteinase (MMP) er sink-avhengige proteolytiske enzymer spalter ekstracellulære matriks, så vel som ikke-matriks-substrater (vekstfaktorer, celleoverflatereseptorer, etc) og regulere signalveier som kontrollerer cellevekst, betennelse, eller angiogenese. Det fungerer som modulator av svulsten mikromiljøet og kan også fungere i en nonproteolytic måte. Dereguleringen av MMP’er er involvert i mange sykdommer, slik som tumormetastase, reumatoid artritt, periodontal sykdom og [10], [11]. Dessuten MMP’er reaktivere angiogene aktiviteten til VEGF ved selektiv nedbrytning av bindevev vekstfaktor (CTGF), som en av de isoformer av VEGF binder CTGF og angiogene aktiviteten til VEGF hemmes i den VEGF-CTGF kompleks [12]. Dermed kan hemming av angiogene aktiviteter via modulering av glykolysen, aktivering av endogene antioksidantforsvar og hemming av ROS dannelse være et skritt for å hindre kreftutvikling. Under utviklingen av Dalton lymfom (en muse transplant non-Hodgkins T-cellelymfom), er ulike deler påvirkes blant annet lever og benmarg utover lymfesystemet. Leveren er den viktigste metabolisme og avgifte organ i kroppen er sterkt berørt under lymfom progresjon. I tillegg har metastase og malignitet blitt bekreftet tidligere i leveren for Dalton lymfom lageret (DL) mus, som er karakteristikker av non-Hodgkins lymfom [13], [14].
bredt utvalg av naturlig forekommende plantekjemikalier kan gi optimal helsemessige fordeler for mennesker. Bruken av hel pakke eller enkelt isolert bestanddel eller en metabolitt av en isolert bestanddel for å oppnå ønskede helsemessige fordeler har vært et problem de siste årene. Curcumin, et naturlig forekommende chemopreventive fytokjemisk utledet fra gurkemeie (
Curcuma longa
), er rapportert å hemme kjemisk indusert karsinogenese i flere organ steder i ulike eksperimentelle dyremodeller. Curcumin undertrykker aktivering av flere transkripsjonsfaktorer som er implisert i onkogene aktivitet, blokker transformasjon, spredning, og invasjon, så vel som induserer apoptose i tumorceller. Således curcumin viser enorme løftet for behandling av kreft [15]. Men det er likevel skal rapporteres om antikarsinogene virkningen av curcumin er på grunn av den kumulative effekten av dens metabolitter, eller på grunn av curcumin i seg selv, som metabolismen av curcumin er svært rask, men metabolitter forbli i lengre tid i forskjellige vev [16]. Videre, samler bevis antyder at forbruket av hele eller delvis rensede mat ekstrakter er mer fordelaktig enn én isolert bestanddel på grunn av eksistensen av synergistiske interaksjoner mellom plantekjemikalier i hele matvarer [17], [18]. Derfor denne studien var designet for å undersøke mekanismen involvert i anticarcinogenic handling av curcumin selv etter seponering av administrasjon. Studien fokuserer på glykolysen og angiogenese, samarbeide regulert av c-myc og HIF-1 i henhold til oksidativt svulstens mikromiljø i metastatisk lever av lymfom bærende mus.
Materialer og metoder
Reagenser
Alle kjemikalier var av analytisk og molekylærbiologi karakter, så vel som endotoksin fri og anvendt uten ytterligere rensing. Curcumin, reagenser for RNA isolering, og Taq-polymerase, ikke-fluorescerende 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (H2DCFDA) og HRP-konjugert anti-β aktin ble innkjøpt fra Sigma Aldrich. Revers transkriptase, ribonukleasehemmer, tilfeldige primere og 100 bp Plus DNA ladder fra Fermentase Life Science og gen spesifikke primere for RT-PCR ble syntetisert fra Metabion. Anti-mus PKCα og VEGF-A antistoff ble kjøpt fra Santacruz bioteknologi og Biolegend hhv. HRP-konjugert geit anti-kanin og kanin anti-rotte, sekundært antistoff fra Bangalore Genei. Matrigel basalmembran matrix fra BD Biosciences, gelatin fra Amresco og ECL (Super signal Kit) ble kjøpt fra Pierce Biotechnology.
Dyr og induksjon T-cellelymfom (Dalton lymfom)
Mus (AKR stamme) ble avlet og holdt under standard laboratorieforhold med riktig menneskelig omsorg, i henhold til retningslinjene i den institusjonelle dyr etisk komité, ved 25 ± 2 ° C under en 12 timers lys /12 timer mørke planen leveres med standard mus fôr og drikkevann
ad libitum
. Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning av Etisk Komité Institutional Animal, Banaras Hindu University. Friske voksne mannlige mus (16-20 uker gamle og 30 ± 2 g) ble benyttet i det eksperimentelle arbeidet. Dalton lymfom (transplant non-Hodgkins-T-celle lymfom) ascites celler ble transplantert til voksne mannlige mus ved intraperitoneal (ip) serietransplantasjon på ca. 1 x 10
6 levedyktige ascites tumorceller i 1 ml fosfatbuffer saltvann (PBS) per mus som tidligere beskrevet [19]. Dalton lymfom ascites celler ble begavet av professor Ajit Sodhi, School of Biotechnology, Banaras Hindu University, Varanasi, India. Dalton lymfom er en transplant murine T-cellelymfom oppsto i thymus kjertel av en DBA /2-mus ved National Cancer Institute, Bethesda, MD, i 1947. [20].
Utvikling av DL ble bekreftet av unormal abdominal hevelse og økt kroppsvekt, noe som var synlige tydelig på 10-11 dager etter transplantasjon og DL mus overlevde i 20 ± 2 dager. Første 7-9 dager med start fra neste dag DL transplantasjon, vekst av Dalton lymfom viste ikke noen stor endring i kroppsvekt og ascites væske opphopning. Således første 7-9 dagene kan bli sammenlignet med lag-fase /forberedende fase for sigmoid kurve for ascites cellepopulasjon vekst. Derfor tidsplan for curcumin behandling til DL mus ble valgt tilsvarende for 9 dager med start fra neste dag etter DL transplantasjon og mus ble avlivet på dag 18 av innlegget DL transplantasjon (før DL mus dør naturligvis) for å få den langsiktige effekten av curcumin, som curcumin må være fullstendig metabolisert til dets metabolitter før 9 dager fra siste dag av behandlingen. Derfor ville effekten være ikke på grunn av den direkte effekten av curcumin, men kan være på grunn av metabolitter av curcumin.
Schedule av curcumin behandling til DL mus og vev samling
En gruppe av normal mus ble anvendt som kontroll, uten noen behandling (N). DL-mus ble tilfeldig delt i fem grupper med 6 mus i hver gruppe (n = 6). Tre grupper ble behandlet med forskjellige doser av curcumin: 1.5 mg [Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50 mg curcumin /kg kroppsvekt (DLT50)], 3 mg [Dalton lymfom bærende mus behandlet med 100 mg curcumin /kg kroppsvekt (DLT100) ], og 4,5 mg [Dalton lymfom bærende mus behandlet med 150 mg curcumin /kg kroppsvekt (DLT150)], oppløst i 50 ul DMSO til hver mus per dag via ip for 9 dager etter hverandre, med start fra neste dag etter DL transplantasjon. En gruppe av DL mus mottok 50 pl DMSO som bærer (DL + DMSO) på lignende måte og annen gruppe av DL-mus ble anvendt uten noen behandling (DL). Alle musene fra hver gruppe ble avlivet på dag 18 av innlegget DL transplantasjon ved cervikal dislokasjon. Leveren ble skåret ut umiddelbart etter at det går ut over dyret og vasket i avkjølt normalt saltvann. Liver av alle dyr (n = 6) i en gruppe ble slått sammen og blandet ved hakking aseptisk ved 4 ° C i gjennomsnitt resultat. Samlet vev ble brukt umiddelbart eller konservert ved -80 ° C for videre studier.
In vivo
angiogenese analysen
Et annet sett med seks grupper med tre mus pr grupper ble tatt å studere
in vivo
angiogenese. Alle behandlinger var samme som ovenfor, bortsett fra at det på tidspunktet for DL transplantasjon, hver mus fra alle grupper ble subkutant injisert med 500 ul av BD Matrigel basalmembran matrise (Matrigel plugg). Like etter ofre, ble Matrigel pluggene fjernet. Plugger ble umiddelbart fotografert og veiet. For å kvantifisere vaskularisering av pluggen, ble mengden av hemoglobin (Hb) akkumulert i pluggen målt ved hjelp HEMOCOR-D kit (Crest Biosystems, Tulip Group, India) etter produsentens protokoll og absorbans av prøvene ble målt ved 540 nm.
RT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av TRI Reagens (Sigma-Aldrich) som per sin bruksanvisningen. DNase-behandling ble utført på total RNA ved hjelp TURBO DNA-Free ™ Kit jeg fjerne enhver genomisk DNA forurensning. RNA ble kvantifisert ved 260 nm og integriteten ble undersøkt ved 1% formaldehyd-agarosegel-elektroforese. CDNA ble syntetisert fra total-RNA isolert ved hjelp av en standardblanding inneholdende hver dNTP, tilfeldig heksamer, M-MuLV revers transkriptase, RNase inhibitor og reaksjonsbuffer i henhold til standardprotokollen for Fermentas Life Science, og cDNA ble anvendt umiddelbart eller lagret ved -80 ° C. Uttrykk av enzymene SOD og NOX, HIF-1α, cMyc, LDH-A, PKCα, VEGF-A og MMP 9 2 gener ble undersøkt ved semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av syntetisert cDNA. Taq polymerase og passende primerpar (tabell-1) ble brukt for PCR reaksjoner ved hjelp av termosykler (Applied Biosystems). PCR ble startet med 3 min ved 95 ° C for denaturering, etterfulgt av tre-trinns temperatursyklus (Tabell 1). En endelig forlengelsestrinn ved 72 ° C i 7 min ble tatt etter den siste syklusen for å fullføre polymeriseringen. Antall sykluser ble optimalisert i den eksponensielle fase av forsterkning. Størrelsen av amplifiserte produkter ble undersøkt ved agarosegel-elektroforese ved bruk av 100 bp stige. Bandet intensiteten av amplifiserte produkter i agarosegel ble visualisert, fotografert og analysert ved hjelp av Gel Doc System (Alpha Innotech
EC). Videre ble bånd intensitet normalisert med motsvarende spor av β-aktin som intern kontroll.
Ikke-denaturerende PAGE og spesifikk aktivitet farging
Aktivitets gel-analyser ble brukt for å måle enzymaktiviteten og isozymer mønster av antioksidant enzym SOD, så vel som NOX og LDH. Ettersom endringer av enzymatisk aktivitet er assosiert med hormonelle forandringer, ikke-denaturerende PAGE-analyse og aktivitets gel-analyse ble foretrukket fremfor immundeteksjon, fordi, benytter fremgangsmåten substratspesifisitet basert deteksjon av bare aktive delen av protein. Dermed er det ansett som svært relevant for å korrelere endring i nivået av en bestemt isozyme med at metabolske endringer på cellenivå.
Superoxide dismutase (SOD)
Aktiviteten gel analysen av SOD ble utført ved ikke-denaturerende PAGE, etterfulgt av aktivitetsfarging i henhold til fremgangsmåten til Beauchamp og Fridovich [21]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Etter elektroforese ble gelen dynket i 1,23 mM NBT løsning i 20 minutter under mørke. Gelen ble kort vasket i destillert vann og inkubert i 15-20 minutter i mørke i 100 mM fosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 28 mM TEMED og 0,28 mM riboflavin. Deretter ble gelen eksponert for en fluorescerende lys inntil utseende av klare soner av aromatiske aktivitet band med blå bakgrunn. Intensiteten av båndene ble analysert ved densitometrisk skanning ved hjelp av en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)
Aktivitets farging av NADPH. Oxidase
Nivået enzymatisk aktivitet av NOX isozymer ble identifisert i ikke-denaturerende PAGE, etterfulgt av aktivitetsfarging av NBT reduksjonsmetoden beskrevet av Sagi og Fluhr [22]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Etter elektroforese ble gelen farget i 50 mM Tris-Cl (pH 7,4) 0,2 mM NBT, 0,1 mM MgCl2 og 1 mM CaCl2, i mørke i 20 min. Deretter 0,2 mM NADPH ble tilsatt til fargeløsning og utseendet av blå formazanfremstilling bånd ble observert. Reaksjonen ble stanset ved nedsenkning av gelene i destillert vann. Intensiteten av båndene ble analysert ved densitometrisk skanning ved hjelp av en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
Aktivitets farging av laktatdehydrogenase (LDH)
I gel enzymatisk aktivitetsanalyse av laktat-dehydrogenase ble utført ved ikke-denaturerende PAGE etterfulgt av spesifikk aktivitet farging som beskrevet av Dietz og Lubrano [23]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 8% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Etter elektroforese ble gelen underkastet LDH-spesifikk aktivitet farging i den fargeløsning som inneholdt 125 mM Tris-Cl (pH 7,4), 0,5 mM magnesiumklorid, 0,1 mM litiumlaktat, 1 mg /ml NAD, 10 mM NaCl, 0,25 mg /ml NBT og 0,025 mg /ml PMS med forsiktig risting i 5-10 minutter ved romtemperatur, etter utvikling av LDH båndene gelen ble vasket. Intensiteten av båndene ble analysert ved densitometrisk skanning ved hjelp av en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
Hydrogenperoksid analysen
Hydrogenperoksid nivå i leveren vev var målt spektrofotometrisk ved å ta av absorbansen ved 570 nm, som beskrevet tidligere [24]. Konsentrasjonen av H
2o
2 i hver prøve ble bestemt ved bruk av standardkurven, som genereres ved å ta kjente mengder av H
2o
2, og uttrykt i pmol /mg protein.
ROS-analysen
Total ROS-nivået ble bestemt ved den oksidative omsetting av ikke-fluorescerende 2 «, 7′-dichlorofluorescein diacetat (H2DCFDA) til sterkt fluorescerende 2′, 7»-dichlorofluorescein (DCF) som tidligere beskrevet [25 ]. Lever ekstrakter av beløpet 100 ul ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter med 100 ul 2 mM H2DCFDA (Invitrogen) i PBS. Fluorescens ble registrert ved 485 nm (eksitasjon) og 527 nm (emisjon) med HITACHI F-3000 fluorescens spektrofotometer. Nivået av ROS i hver prøve ble bestemt ved å observere fluorescensen (absorbans) /mg protein.
Gelatin Zymografi
Aktiviteten av MMP’er i vev prøve ble analysert for å studere gelatin nedbrytende aktivitet ved anvendelse av zymografi som beskrevet tidligere [26]. Lik mengde protein fra hver prøve blandet med likt volum 2 x ikke-reduserende buffer (0,125 M Tris-Cl pH 6,8, 20% glyserol, 4% SDS, 0,003% bromfenolblått) ble separert ved 4 ° C med 8% oppløsnings og 5% stabling SDS-PAGE som inneholdt 0,1% gelatin. Etter elektroforese ble gelen vasket to ganger i 2,5% Triton X-100 i 20 minutter hver for å fjerne SDS og renaturere enzymer. Gelen ble deretter inkubert i 20 timer ved 37 ° C i buffer inneholdende 21 mM Tris-Cl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, og 0,04% NaN3. Deretter Gelen ble vasket i destillert vann, farget med CBB og avfarget i metanol og eddiksyre. Protease-aktivitet ble observert som en klar band av oppsluttet gelatin. Intensiteten av båndene ble analysert ved densitometrisk skanning ved hjelp av en Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført av SPSS programvare ved hjelp av en veis ANOVA etterfulgt av Tucky test. Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. oppnådd fra tre forskjellige sett av eksperimenter, p 0,05 ble tatt som statistisk signifikant (95% konfidensintervall). # P 0,05 og ## 0,01 sammenlignet med N, * p 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet DL + DMSO gruppe henholdsvis
Resultater
Expression og enzymatisk aktivitet av SOD
ekspresjon av SOD i leveren av DL og DL + DMSO mus ble funnet å være nedregulert betydelig i forhold til det normale. Uttrykk for både Mn-SOD og Cu /Zn-SOD i DL mus var 75% og 78% av normale mus henholdsvis, og 82% og 69% av normal henholdsvis i DL + DMSO. Betydelig oppregulering av ekspresjonen av begge isozymer av SOD ble funnet til normalt nivå av curcumin behandling; Mn-SOD ble oppregulert opp til 1,21 ganger og 1,22 ganger av DL + DMSO-mus med 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis, og Cu /Zn-SOD opp til 1,15 ganger, 1,42 ganger og 1,1 ganger av DL + DMSO med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [fig. 1 (A)]. Tilsvarende aktivitet av SOD følger også lignende trend variasjon i uttrykket. Aktiviteten av Mn-SOD i DL og DL + DMSO mus ble funnet å være henholdsvis 65% og 63% av normale mus. Curcumin behandling forhøyet aktivitet på doseavhengig måte som var tilnærmet opp til 1,3 ganger, 1,39 ganger og 1,58 ganger av DL + DMSO i 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis. På lignende måte ble aktiviteten av Cu /Zn-SOD ble redusert i DL og DL + DMSO-mus opp til 61% og 61,5% av normal mus respektivt. Curcumin behandling var i stand til å øke aktiviteten av Cu /Zn-SOD på tilsvarende doseavhengig måte, tilnærmet opp til 1,24 ganger, 1,35 ganger, 1,5 ganger høyere DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [fig. En (C)].
Effekt av curcumin på mRNA-ekspresjon og enzymatisk aktivitet av SOD isoenzymer i leveren av lymfom bærende mus (A) RT-PCR av Mn-SOD, Cu /Zn-SOD og β-aktin gen, (B) Densitometrisk skanning av Mn-SOD og Cu /Zn-SOD-gener etter normalisering med β-aktin, (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av SOD isoenzymer, (D) Densitometrisk skanning av aktiviteten band av SOD isoenzymer. Leveren hos alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og proteiner ved ikke-denaturerende betingelse. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # P 0,05 sammenlignet med N-gruppen og * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
ekspresjon og enzymatisk aktivitet av NOX
ble observert ekspresjon av NOX1 og NOX2 å være signifikant oppregulert i DL og DL + DMSO-mus sammenlignet med normale mus, som ble modulert langs normalt nivå av curcumin behandling [fig. 2 (A)]. Ekspresjon av NOX1 ble funnet å være tilnærmet 1,75 ganger og 1,44 ganger fra normale mus i leveren av DL og DL + DMSO-mus respektivt. Curcumin behandling reduserte ekspresjon som var ca. 83%, 86% og 72% av DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis. På tilsvarende måte sammenlignet med normal ekspresjon av NOX2 ble funnet å være tilnærmet 2,7 ganger og 2,38 ganger i leveren av DL og DL + DMSO mus henholdsvis, som ble nedregulert etter curcumin behandling som observert å være omtrent 60%, 86% og 87% av DL + DMSO mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis. Tilsvarende aktivitet av NOX ble observert å være forhøyet som dens mRNA-ekspresjon. NOX regulerer dannelsen av ROS; derfor aktiviteten av NOX kan måles som en indikator på ROS nivå. Sammenlignet med normale mus, aktivitet av NOX1 var ca. 1,6 ganger og 1,45 ganger der som aktiviteten til NOX2 var henholdsvis 1,37 ganger og 1,3 ganger i leveren av DL og DL + DMSO mus. Forskjellige doser av curcumin behandling modulert signifikant aktivitet overfor normalt nivå. Aktivitet av NOX1 ble funnet å være omtrent 86%, 70% og 80% av DL + DMSO-mus, mens aktiviteten av NOX2 ble funnet å være omtrent 78%, 84% og 84% av DL + DMSO mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis [fig. 2 (C)].
Effekt av curcumin på mRNA-ekspresjon og enzymatisk aktivitet av NOX isozymene i leveren av lymfom bærende mus (A) RT-PCR av NOX2, NOX1 og p-aktin-gener, (B) Densitometrisk skanning av NOX2 og NOX1 gener etter normalisering med β-aktin, (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av NOX isozymer, (D) Densitometrisk skanning av aktiviteten band av NOX isozymer. Leveren hos alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og proteiner ved ikke-denaturerende betingelse. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # P 0,05 og ## 0,01 sammenlignet med N-gruppen, * p 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
nivå~~POS=HEADCOMP H
2o
2 og total ROS i levervev
nivået~~POS=HEADCOMP H2O2, som er en indikator på oksidativt stress gjenspeiler den oksidative status av vev. Nivået av hydrogenperoksyd i leveren av DL og DL + DMSO mus ble hevet betydelig, opp til ca. 1,47 ganger og 1,39 ganger av normal mus respektivt. Curcumin behandling signifikant redusert nivå opp til 82% av DL + DMSO mus med 100 mg curcumin /kg kroppsvekt mus, og 96% og 90% av DL + DMSO-mus med 50 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt mus henholdsvis [fig. 3 (A)]. ROS syntetisert av NOX samt fra andre kilder fungerer som en viktig signalmolekyl i oksidativ svulstens mikromiljø for å indusere onkogene transformasjon. Total ROS nivå i form av fluorescens (absorbans) /mg protein ble signifikant forhøyet i DL og DL + DMSO mus opp til ca 2,59 ganger og 2,64 ganger av normale mus. Behandling av curcumin trykkes ROS nivå betydelig, noe som ble observert til å være omtrent 62%, 51% og 67% av DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis [fig. 3 (B)].
Effekt av curcumin på oksidativt stress i form av total H2O2 nivå og total ROS nivå i leveren av Lymfekreft bærende mus (A) Histogram viser total H2O2 nivå i forskjellige grupper, (B) Histogram viser total ROS nivå i forskjellige grupper. Leveren hos alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen hver for seg og homogenatet ble fremstilt for bestemmelse av H2O2 og ROS nivå. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # P 0,05 sammenlignet med N-gruppen, * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
uttrykk av HIF-1α og cMyc
mRNA uttrykk for HIF-1α og cMyc ble studert som en tidlig respons stressgenet og onkogen henholdsvis i hypoksisk svulstens mikromiljø. Ekspresjonen av både HIF-1α og cMyc ble regulert opp i DL og DL + DMSO-mus sammenlignet med normale mus, noe som er vesentlig senket ved curcumin behandling [fig. 4 (A)]. Ekspresjonen av HIF-1α i lever av DL og DL + DMSO mus ble funnet å være tilnærmet 1,85 ganger og 1,51 ganger av normal mus respektivt. Ekspresjonsnivået etter curcumin behandling var ca. 93%, 91% og 78% av DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis. Tilsvarende ekspresjon av cMyc ble funnet å være tilnærmet 2,03 ganger og 1,45 ganger fra normale mus i leveren av DL og DL + DMSO mus henholdsvis og etter curcumin behandling ekspresjon ble redusert til ca. 95%, 83% og 78% av DL + DMSO mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis.
Effekt av curcumin på mRNA ekspresjon av spenning aktivert gen HIF-1α og cMyc i lever fra lymfompasienter bærende mus (A) RT -PCR av HIF-1α, cMyc og p-aktin-gener, (B) Densitometrisk skanning av HIF-1α og cMyc gener etter normalisering med β-aktin. Leveren hos alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # P 0,05 og ## 0,01 sammenlignet med N-gruppen, * p 0,05 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Expression og enzymatisk aktivitet av LDH-A
mRNA uttrykk for LDH-A i leveren av DL og DL + DMSO mus ble oppregulert opp til ca 1,4 ganger og 1,4 fold av normal mus hhv. Alle dosene av curcumin betydelig ned regulert ekspresjon. Uttrykket etter curcumin behandling ble funnet å være ca 90%, 79% og 80% av DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis [fig. 5 (A)]. Pyruvat kan ikke bli metabolisert aerobt, men omdannes til laktat ved LDH-A på hypoksiske tumormikromiljøet. Derfor kan glykolytisk metabolisme overvåkes med hensyn til aktiviteten av LDH-A. Aktiviteten av LDH-A ble funnet å være forhøyet opp til tilnærmet 1,76 ganger og 1,64 ganger fra normale mus i leveren av DL og DL + DMSO-mus respektivt. Behandling av curcumin reduserte aktiviteten av LDH-A, som var ca. 75%, 67% og 85% av DL + DMSO-mus med doser på 50, 100 og 150 mg /kg kroppsvekt henholdsvis [Fig betydelig. 5 (C)].
Effekt av curcumin på mRNA-ekspresjon og enzymatiske aktiviteten til LDH-A i leveren av lymfom bærende mus (A) RT-PCR av LDH-A og p-aktin-gener, (B) densitometrisk scanning av LDH-A etter normalisering med β-aktin, (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av LDH-A, (D) densitometrisk skanning av aktiviteten band av LDH-A. Leveren hos alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og totale proteiner ved ikke-denaturerende betingelse. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # P 0,05 og ## 0,01 sammenlignet med N-gruppen, * p 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin, M er 100 bp markør og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Expression og proteinnivå PKCα
mRNA uttrykk for PKCα ble funnet å være opp regulert i DL og DL + DMSO mus opp til ca 1,75 ganger og 1,65 ganger av normal mus. Alle de tre doser av curcumin redusert ekspresjon av PKCα betydelig. Nedregulering av ekspresjonen av PKCα var opp til ca. 83%, 69% og 67% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis (fig. 6 (A)]. Protein nivå av PKCα følger Data representerer gjennomsnitt ± SEM Data representerer gjennomsnitt ± SEM Data representerer gjennomsnitt ± SEM Data representerer gjennomsnitt ± SEM
