Abstract
SnoN er en negativ regulator av TGF-β signalisering og også en aktivator av tumor suppressor p53 som respons på cellulært stress. Dens rolle i menneskelig kreft er kompleks og kontroversiell med både pro-onkogene og anti-onkogene aktiviteter rapportert. For å klargjøre sin rolle i kreft hos mennesker og gi klinisk relevans til sine signal aktiviteter, undersøkte vi SnoN uttrykk i normale og kreft menneskelige esophageal, eggstokkene, bukspyttkjertelen og brystvev. I normalt vev, blir SnoN uttrykt i både epitelet og den omgivende stroma ved et moderat nivå og er overveiende cytoplasmisk. SnoN nivåer i alle tumor epitel ble undersøkt er lavere enn eller lik den som er i de samsvarende normale prøver, i samsvar med sin anti-tumorigen aktivitet på epitelceller. I kontrast er SnoN uttrykk i stroma sterkt oppregulert i infiltrere betennelsesceller i høyverdig esophageal og eggstokkreft tumorprøver, noe som tyder på at SnoN potensielt kan fremme ondartet progresjon gjennom moduler svulsten mikromiljøet i disse krefttypene. De overordnede nivåer av SnoN uttrykk i disse kreftvevet ikke korrelerer med p53 status. Men i menneskelige kreftcellelinjer med forsterkning av
snoN
genet, ble en sterk sammenheng mellom økt SnoN kopiantall og inaktivering av p53 oppdaget, noe som tyder på at tumor suppressor SnoN-p53 veien må inaktiveres, enten gjennom nedregulering av SnoN eller inaktivering av p53, for å tillate kreftcelle til å proliferere og overleve. Disse dataene antyder sterkt at SnoN kan fungere som en tumor suppressor på tidlige stadier av tumordannelse i humane kreftvevet
Citation. Jahchan NS, Ouyang G, Luo K (2013) Expression Profiler av SnoN i Normal og Cancerous Menneskelig vev støtte sin tumor suppressor rolle i human Cancer. PLoS ONE 8 (2): e55794. doi: 10,1371 /journal.pone.0055794
Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada
mottatt: 04.11.2012; Akseptert: 30 desember 2012; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Jahchan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien støttes av NIH RO1 CA101891 og RO1 DK090347 K. Luo og DOD BCRP predoctoral fellesskap til N. Jahchan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
SnoN (Ski-roman protein) ble knyttneve oppdaget som et oncoprotein som kan indusere transformasjon av kylling og vaktel embryonale fibroblaster når overexpressed [1] – [4]. I pattedyr, inneholder SnoN både pro-onkogene og anti-onkogene aktivitet. Den pro-onkogene aktiviteten til SnoN er avhengig av dets evne til å binde til de Smad proteiner og motvirke cytostatiske responsene til TGF-β [5], [6]. Suppporting sin pro-onkogen rolle, er SnoN uttrykk forhøyet i de fleste menneskelige kreftcellelinjer, og reduksjon av SnoN uttrykk ved shRNA i invasiv brystkreft og lungekreft cellelinjer hemmer tumorvekst både
in vitro Hotell og
in vivo product: [7]. Enda viktigere, overekspresjon av SnoN i musebrystkjertelen akselererer brystkreftutvikling og lungemetastase indusert av polyoma midtre T-antigen (PyVmT) [8], som gir den første
in vivo
støtte for den pro-onkogene aktivitet av SnoN. De siste årene har imidlertid flere og flere bevis dukket opp som indikerer at SnoN kan også fungere som en tumor suppressor. Heterozygote mus mangler en kopi av
snoN
genet viser en økt mottakelighet for kreftfremkallende-indusert tumordannelse, noe som tyder på at SnoN kan beskytte mus fra kreft [9]. Vi har nylig vist at høye nivåer av SnoN hemme onkogen-indusert transformasjon av muse embryonale fibroblaster
in vitro Hotell og blokk svulst utvikling
in vivo
i en to-trinns hud kreftmusemodell [10 ]. Denne anti-onkogen aktivitet av SnoN er uavhengig av dens evne til å undertrykke TGF-β signalering og kanskje kommer av dens evne til å indusere stabilisering av p53. Som svar på cellulært stress, er høye nivåer av SnoN rekruttert til PML nulcear organer der det induserer stabilisering av p53, som fører til økt celle alderdom og apoptose [10]. Således kan høye nivåer av SnoN i cellene aktiverer PML-p53 tumor suppressor veien for å hemme tumorvekst. Endelig kan SnoN også hemme tumormetastase siden redusere SnoN uttrykk forbedrer epitelial til mesenchymale overgang (EMT) av lunge- og brystkreftceller
in vitro Hotell og metastase
in vivo product: [7].
Gitt de komplekse roller SnoN i tumorgenese, er det viktig å bestemme dets ekspresjon mønster i normale humane vev og overvåke hvordan den endres i løpet av ondartet progresjon. SnoN er allestedsnærværende uttrykt i alle embryonale og voksne vev. Dens uttrykk er oppregulert under bestemte stadier av embryogenesen og orgel morphogenesis [11]. I ikke-transformerte celler og normale vev, kan SnoN påvises både i cytoplasma og cellekjernen, mens det i cancercellelinjer, er i stor grad SnoN atom [8], [12], [13]. I tillegg kan SnoN ekspresjon reguleres på nivået av genamplifisering, transkripsjonelle aktivering og proteinstabilitet. Den menneskelige
snoN
genet ligger på kromosom 3q26.2, et locus ofte forsterket i mange krefttyper, inkludert som spiserør, eggstokk og mange andre [5]. Etter avtale med dette, er SnoN uttrykk oppregulert i mange kreftcellelinjer [6]. Men om SnoN uttrykk er også økt i humane kreftvevet fortsatt kontroversielt. En rekke studier har undersøkt denne saken [13] – [18], men ingen konsistent mønster har dukket opp. Mens noen studier har rapportert en økning i SnoN RNA og proteinnivåer i noen kreftvevet, og at dette høyere SnoN uttrykk korrelert med dårlig differensiering, dypere invasjon og dårlig pasient overlevelse [13], [14], [16], mens andre oppdaget en nedgang i SnoN ekspresjon i tilsvarende kreftformer, særlig i dysplastisk og sterkt invasive kreftformer [15], [17], [18]. Potensialet forholdet mellom lokalisering av SnoN og ondartet status for kreft varierte også fra studie til studie. Disse motstridende data tyder på en mer komplekse forholdet mellom SnoN uttrykk og malign transformasjon og begrunne behovet for en bredere undersøkelse av SnoN uttrykk i normale og kreft vev av forskjellige ondartede stadier.
I denne rapporten undersøkte vi SnoN uttrykk i fire typer normale menneskelige vev og matchende kreft vev av ulike kliniske stadier av kreft for å vurdere om endringer av SnoN uttrykk korrelerer med tumor malignitet og /eller status av p53 inaktivering. Disse fire typer, spiserør, ovarian, bryst og pankreatiske vev, ble valgt fordi SnoN har vært implisert i utviklingen av disse kreftformer og /eller i de normale funksjoner av disse vev. Esophageal og eggstokk-kreft ofte innebære forsterkning av 3q26 amplikon, og kopiantallet av den
SnoN
-genet, så vel som SnoN transkripsjonsnivåer har vist seg å øke i disse kreftformene [14], [16], [19 ], [20]. Men uttrykket mønster av SnoN protein i normal ovarie og i ovarie adenokarsinom ikke er definert. Kreft i bukspyttkjertelen er nært knyttet til TGF-β /Smad vei, og Smad4 inaktiveres i nesten 60% av kreft i bukspyttkjertelen [21]. Som en negativ regulator av Smad4, kan SnoN også spille en rolle i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Til slutt, har våre nylige studier ved hjelp av ulike musemodeller vist at SnoN ekspresjon blir regulert dynamisk under brystkjertelen utvikling [8] og er implisert i maligne progresjon av brystkreft [7], [8], [12]. Ved å undersøke stedet og nivåer av SnoN uttrykk i disse vev, håper vi å få en bedre forståelse av funksjonene som SnoN spiller under tumorigenesis både i epitel og stromal miljø og hvordan dette kan relatere til p53 inaktivering.
materialer og metoder
Normal og kreftvev arrays
Alle matriser ble kjøpt fra Biomaks (Cybrdi Inc). Disse arrays kommer med informasjon om kliniske stadier, patologi karakterer og TNM. Esophageal matrisen inneholder par av svulst biopsiprøver og matchet normale prøver fra 39 pasienter med histologisk og klinisk gradert adenokarsinom. 8 pasienter med klasse I, 19 pasienter med grad II, og 11 pasienter med grad III svulster
ovarial tumor matrise inneholder kreftbiopsiprøver og 10 normale matchet prøver fra 69 kvinner i alderen 50 +/- 10. Svulstene ble klassifisert til å være eggstokkene adenokarsinomer. 3 pasienter med eggstokkreft klart karsinom, 12 pasienter med klasse I, 29 pasienter med grad II, og 25 pasienter med grad III adenokarsinomer (alle med lymfeknutemetastaser, men ikke fjernmetastaser)
bukspyttkjertelen svulst rekke inneholder prøver fra 90 pasienter og fem normale prøver bukspyttkjertelen vev. Tumortyper på denne tabellen inkluderer duktalt adenokarsinom, mucinous adenokarsinom, nevroendokrin kreft, adenosquamous karsinom, karsinoid, og solid pseudo-papillær karsinom. De har blitt klassifisert i ulike kliniske klasser basert på histologisk evaluering: 21 pasienter med grad I, 59 pasienter med grad II, 8 pasienter med grad III (mange med lymfeknutemetastase), og 2 pasienter med grad IV tumor med fjernmetastaser
brystkreft rekke inneholder dupliserte svulst biopsiprøver fra 31 pasienter, med seks normale prøver fra seks matchende pasienter, og 9 metastatiske prøver fra 9 matchende pasienter. Disse svulstene ble klinisk klassifisert av histologiske analyser som skal infiltrere ductal carcinoma: 9 pasienter med grad IIA, 4 pasienter med grad IIB, 10 pasienter med grad IIIA, 5 pasienter med grad IIIC, 9 matchende pasienter med lymfeknutemetastatisk, og en pasient med metastatisk adenokarsinom i eggstokken. Fordi ble påvist noen forskjell i SnoN uttrykk mellom klasse IIA og IIB eller mellom klasse IIIA og IIIC svulster, gruppert vi disse prøvene sammen som klasse II eller klasse III svulster. I tillegg 24 par bryst ductal carcinoma in situ (DCIS) prøver med matchende normalt vev ble oppnådd fra UCSF kreftsenter.
Tykkelsen av alle matriser er fem mikrometer. Den brystkreft rekke inneholder duplikate prøver fra hver pasient og esophageal, eggstokkene og bukspyttkjertel arrays har en del fra hver pasient.
Immunohistochemistry
For SnoN immuostaining.
parafininnstøpte arrays ble deparaffinized i xylener deretter rehydrert i en serie av etanol gradient. Snittene ble nedsenket i 0,85% NaCl i 5 minutter, deretter i PBS i 5 minutter, og fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA). Permeabiliseringen av lysbildene ble utført med 20 pg /ml proteinase K i 10 minutter ved romtemperatur (RT), etterfulgt av vasking i PBS i 5 minutter. Prøvene ble fiksert en gang til med 4% PFA, og blokkert over natten i 1% BSA /10% serum fra nyfødt kalv /0,02% Triton X-100 i PBS i et fuktet kammer ved 4 ° C. Fargingen ble utført med et anti-SnoN antistoff som gjenkjenner et C-terminalt peptid av SnoN [12] ved en konsentrasjon på 1 ug /ml i 2 timer sammen med et peptid konkurranse kontroll og en negativ kontroll uten primært antistoff. Etter 3 vaskinger med IF-buffer (10% nyfødt kalveserum /0,02% Triton X-100 i PBS) i 15 minutter hver, fluorescerende konjugert sekundært antistoff (Alex488 anti-kanin-antistoff 1:400 fortynning) ble tilsatt til lysbildene i 1 time ved romtemperatur i mørket. Glassene ble vasket en gang med IF-buffer i 15 minutter og to ganger med PBS i 10 minutter hver, fulgt av tilsetning av en dråpe av Vectashield DAPI monteringsmedium (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
seksjoner fra samme vevstyper (normale og kreft) var farget i samme eksperiment under identiske forhold, og bildene ble tatt under konfokalmikroskop i én økt. I tillegg ble det samme antistoff masse og fortynninger anvendes for alle stainings som beskrives i dette dokumentet. Under ingen omstendigheter var antistoffene gjenbrukt i noen av forsøkene.
For p53 immunhistokjemi.
parafininnstøpte snitt ble deparaffinized i xylener, rehydrert i etanol, og inkubert med 3% H
2o
2 for 10 minutter å slukke endogen peroksidase aktivitet. Deretter ble seksjonene varmes i mikrobølgeovn ved 95 ° C i 30 minutter i natriumcitratbuffer (pH 6) [22] og sperret ved hjelp av tyramide signal forsterkning Biotin System Kit (Perkin Eimer, Boston, Massachusetts) i 30 minutter ved RT. Objektglass ble behandlet i 30 minutter med anti-p53 ved 1:200 fortynning (DO-7-klon, Abcam, Cambridge, UK). Etter vasking 3 x 5 minutter i 0,05% TritonX i PBS, ble objektglass inkubert i biotinylert sekundært antistoff i 30 minutter ved RT. Alle etterfølgende trinn ble utført per produsentens protokoll. For visualisering, ble DAB brukt som peroxydasesubstrat (SK-4105, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Image Capture og Semi-Kvantitativ dataanalyse
For hver SnoN-farget tumorprøve minst tre bildene ble tatt ved hjelp av LSM 510 konfokalmikroskop under 20x mål å sørge for at de viktigste områdene for hver prøve er inkludert i kvantifisering. SnoN intensitet (antall piksler /område) til hver av de tre områdene ble beregnet ved hjelp av bildet J programvare, og størrelsen på området ble holdt konstant under hele prosessen kvantifisering. Tallene ble så gjennomsnittsberegnet for hver tumorprøve. De negative kontroll og peptid konkurransebakgrunnssignaler ble trukket fra fra alle prøvene under kvantifisering. P53 Bildene er tatt med Zeiss AxioImager fluorescens mikroskop. Nuclear p53 signalintensitet ble kvantifisert i en 0 (negativ) til 5 (svært intens farging) skala.
For analyse av potensialet sammenslutning av TP53-mutasjon og SKIL forsterkning, vi utførte data mining av Novartis cellelinje leksikon ( CLE) som inneholder 947 humane kreftcellelinjer [23], der kopiere tall og mutasjoner av SnoN (SKIL) og p53-gener er blitt karakterisert ved bruk av Affymetrix SNP6 microarray eller RNAseq. Vi analyserte 914 cellelinjer ved å skille cellelinjene basert på frekvensen av SnoN forsterkning og undersøker hyppigheten av TP53 mutasjon i hver gruppe.
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av student t-test funksjon i bioconductor R pakke som 2-tailed t-test forutsatt ulike variasjoner. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble beregnet ved hjelp av R-pakken, og betydningen av den observerte korrelasjonskoeffisient ble bestemt ved hjelp av one-sample t-test mot befolkningen i korrelasjonskoeffisienter i-mellom p53 og alle Entrez gener i det menneskelige genom. Potensielle sammenheng mellom SnoN uttrykk og p53 inaktivering i kreftvevet ble evaluert ved hjelp av Kruskal-Wallis test.
Resultater
SnoN er uttrykt i Normal pattedyrvev
For å finne en normal mønster av SnoN i ulike menneskelige vev og etablere en basis for videre analyse av kreftvevet, må vi først undersøkt SnoN uttrykk i 39 normale esophageal vevsprøver, 10 normale bryst prøver, 6 normal eggstokk og 5 normale bukspyttkjertel prøver ved immunhistokjemi med anti-SnoN. Dette affinitets-renset antistoff ble dannet mot et C-terminalt peptid av human SnoN og har tidligere blitt karakterisert for imunofluorescence og immunhistokjemi studier [8], [12]
slimhinnene i spiserøret inneholder tre lag:. I ikke-kerati stratifisert plateepitel, lamina propria som består av løst bindevev, og muscularis mucosa som består av glatt muskulatur. I spiserør stratifisert plateepitel, ble SnoN uttrykt ved moderate til høye nivåer i cytoplasma, med en sterkere farging i den øvre overflatedel av den flate epitel enn i det nedre lag av cuboidal celler (figur 1A). I lamina propria, SnoN var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma av celler i bindevev, men kan også påvises i kjernen av enkelte fibroblaster. Blodkar uttrykt SnoN på et høyt nivå, og den skjelettmuskulatur av muscularis mucosa hadde den høyeste SnoN farging (figur 1A). Således blir SnoN uttrykt i både epitelceller og stromal rommet, og gitt sin høye nivåer av ekspresjon i muskler, blodårer og fibroblaster, kan det spille en viktig rolle i regulering av stromal mikromiljøet.
SnoN ekspresjon i den normale spiserøret, inklusive suprabasal differensierte squamous epitelceller, lamina propria (stroma og bindevev), og muscularis mucosa (glatt muskel). E: epitelceller; F: fibroblaster; B.V; blodåre. Negativ kontroll: vev farget med konjugert sekundært antistoff alene og uten primære antistoff. Peptide kontroll: vev farget med SnoN peptid konkurransen kontroll. Grønn: SnoN; blå, DAPI. B, Representant SnoN uttrykk i normal eggstokkvev. E: hårsekken epitelceller; S: stroma. Det venstre panelet er DAPI flekken alene (blå), er det midtre panelet SnoN flekken alene (grønn), og retten panel er SnoN (grønn) pluss DAPI (blå) flekker. Samme gjelder for figur paneler i C-D. C, representant SnoN uttrykk i normal bukspyttkjertelen. E: acinar epitelceller; S: stromale celler i lobulære bindevev septa. D, Representant SnoN uttrykk i normal bryst. E: epitelceller kanaler og lobuli; S:. Stroma
I normal eggstokkvev, SnoN var overveiende cytoplasma og uttrykt ved moderate nivåer i den opprinnelige og primære epitelceller hårsekkceller og stromale celler (Figur 1b). I normal pankreas, SnoN var til stede i cytoplasmaet av epitelceller i acini og intralobular kanalene ved moderate nivåer, og i den lobulære bindevev septa på et lavere nivå (figur 1C). Til slutt, i normalt brystvev, ble SnoN uttrykt i cytoplasma av epitelceller i de lobuli og endekanaler (figur 1D), i likhet med det som er blitt rapportert før [8], [12]. Det ble også påvist i stroma på et lavere nivå. Således er SnoN tilstede i alle de epiteliale og stromale lag av disse fire normale vevstyper ved varierende nivåer. I epitelcellene i alle vevstyper, er SnoN hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma. Dette er i tråd med våre tidligere funn [8], [12].
SnoN Expression er redusert i Nedre Grade Esophageal Adenocarcinoma men sammenlignes med at i WT vev i High Grade Tumor Stroma
neste undersøkte SnoN uttrykk nivåer og mønstre i 39 esophageal adencarcinoma vevsprøver av immunfluorescens farging, etterfulgt av confocal bildebehandling både 20X og 40X forstørrelse og sammenlignet dem med at i de samsvarende normale prøver. Disse esophageal adenokarsinom prøver har blitt klassifisert klinisk fra klasse I til III. Spesielt, har flerlags vev struktur sett i normal esophageal vev gått tapt fullstendig i disse adenokarsinom prøvene, og stromale tumorceller er ispedd svulst epitel. Våre semikvantitativ analyse viste at sammenlignet med den normale skjellepitel, ble SnoN ekspresjon signifikant redusert i klasse I (p = 0,00016) og til en mindre grad, grad II tumorer (p = 0,142) (figur 2A og 2B). Interessant, som tumorer utviklet seg til en mer ondartet stadium (grad III), SnoN uttrykk utvinnes gradvis til et nivå som kan sammenlignes med eller høyere enn det i normale kontroller (to representative prøver, en lik normal og en høyere er vist i figur 2A). SnoN ekspresjon i stromaceller og bindevevs i klasse I og II tumorer ble også redusert betraktelig fra den i normale vev. Grade III tumor stroma, viste imidlertid en betydelig oppregulering av SnoN uttrykk enn klasse I-tumorer (p = 0,0068), og nådde et nivå tilsvarende og i 55% av prøvene, høyere enn i normalt vev (siste panel, figur 2A) , spesielt i infiltrere fibroblaster og inflammatoriske celler (lymfocytter, leukocytter og fagocytter) (figur 2A og 2C). Men på grunn av de store variasjoner mellom individuelle klasse III-prøver, den gjennomsnittlige endringen i stroma SnoN nivåer over det i WT vev var ikke statistisk signifikant. Spesielt, forble SnoN stor grad cytoplasma i disse tumorprøver. Våre data tyder på at SnoN uttrykk er nedregulert i pasienter med lavgradig esophageal adenokarsinom men dens uttrykk er reetablert i tumorer høy klasse, i spesielt i stroma (for detaljerte tall, se tabell 1). Dette tyder på at SnoN uttrykk kan variere på ulike stadier av kreft og at SnoN kan spille ulike roller på ulike stadier av tumordannelse.
A, representant SnoN farging av spiserørskreft av ulike karakterer på 20X (øverst) eller 40X ( bunn) forstørrelser. To klasse III prøver som representerer forskjellige nivåer av SnoN uttrykk ble vist. E: epitel; S: stroma. Grønn: SnoN; blå, DAPI. B, SnoN flekker i normale og tumor epitelceller ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare og tallene ble plottet i boksplottet, som inkluderer normale prøver (n = 36, mener intensitet = 1,13) og esophageal kreftprøver av klasse I (n = 8, gjennomsnitt = 0,07), II (n = 19, gjennomsnitt = 0,71), og III (n = 11, gjennomsnitt = 1,26). Statistisk analyse sammenligne normale kontroller til hver svulst klasse viste at epitel SnoN nivåer i esophageal adenokarsinom er betydelig svakere (klasse I: p = 0,0002) eller lignende (grad II: p = 0,1425 og klasse III: p = 0,3349) som i kontroll normale prøver. Økningen i epithelial SnoN ekspresjon i klasse III sammenlignet med klasse I var statistisk signifikant (p = 0,0013). C, Kvantifisering av SnoN stromal flekker i normale prøver (n = 27, mener = 1,69) og esophageal kreftprøver av klasse I (n = 5, mener = 0,23), II (n = 19, mener = 1,09), og III ( n = 11, mener = 1,78). Den statistiske analysen sammenligne normale kontroller til hver esophageal svulst klasse er som følger: p = 0,0023 for klasse I, p = 0,8565 for II, og p = 0,1132 for klasse III. Økningen i stromal SnoN uttrykk i klasse II (p = 0,0287) og klasse III (p = 0,0068) svulster i forhold til grad jeg tumor stroma var statistisk signifikant.
SnoN Expression er redusert i lavere grad ovarian adenokarsinom Vev men Forhøyet i High grade tumor Stroma
i likhet med hva som er observert i kreftfaren, ble SnoN uttrykk nedregulert i klasse i og i mindre grad, klasse II eggstokkene adenokarsinom prøver i både tumor epitel og stroma (figur 3 og tabell 1), men gjenopprettet igjen i klasse III svulster. Grade III ovarian adenokarsinom prøvene viste heterogenitet i SnoN uttrykk, med 60% av prøvene viser en høyere SnoN farging (siste panel, figur 3A) enn de normale vev og andre oppviser en svakere SnoN farging (panel # 4, figur 3A). Som et resultat av denne heterogenitet, statistisk analyse viste at det ikke var noen forskjell i total SnoN uttrykk mellom normal ovarievev og klasse III-tumorprøver. Imidlertid, når sammenlignet med lavere grad av tumorprøver, stromal kupé av klasse III-tumorprøver viste en mye sterkere SnoN farging (figur 3A og 3C). Disse stromale celler ble identifisert av patologer som infiltrere fibroblaster og inflammatoriske celler. Igjen, forble SnoN stor grad cytoplasma i disse tumorprøver. Dermed lik som har blitt observert med spiserørskreft, SnoN uttrykk i eggstokkreft også ut til å være lavere i tidlige stadier av ondartet progresjon.
A, representant SnoN uttrykk i normal eggstokkvev og i eggstokkene adenokarsinom ulike kreft karakterer på 20X (øverst) eller 40X (nederst) forstørrelser. To klasse III prøver som representerer forskjellige nivåer av SnoN uttrykk ble vist. E: epitel; S: stroma. Grønn: SnoN; blå, DAPI. B, SnoN flekker i normale og eggstokkreft kreft epitelceller ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare og tallene ble plottet i boksplottet, som inkluderer normale prøver (n = 10, mener = 1,28) og eggstokkene tumorprøver av klasse I (n = 11, gjennomsnitt = 0,55), trinn II (n = 29, gjennomsnitt = 1,05), og fase III (n = 25, gjennomsnitt = 2,04). Statistisk analyse sammenligne normale kontroller til hver svulst klasse viste at epitel SnoN nivåer i eggstokkene adenokarsinom er lik eller svakere enn vevsprøver kontroll: p = 0,6139 for klasse I, p = 0,7984 for II, og p = 0,1461 for III. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom eggstokkene tumorprøver. C, SnoN flekker i stromale celler i normale prøver (n = 10, mener = 1,38) og eggstokkreft tumorprøver av klasse I (n = 7, mener = 0,61), II (n = 23, mener = 0,81), og III ( n = 20, gjennomsnitt = 2,00). Den statistiske analysen sammenligne normale kontroller til hver ovarian tumor grad er som følger: p = 0,5997 for klasse I, p = 0,3633 for klasse II, og p = 0,1833 for klasse III. Økningen i stromal SnoN uttrykk i klasse III i forhold til grad II (p = 0,0258) var statistisk signifikant.
SnoN Expression er redusert i bukspyttkjertelen adenokarsinom Prøver
kreft i bukspyttkjertelen vev matrise inneholder flere typer adenokarsinom i alle tre kliniske karakterer (i-III), inkludert ductal adenocalarcinoma, mucinous adenokarsinom, nevroendokrin kreft, adenosquamous karsinom, karsinoid, og solid pseudo-papillær karsinom. I alle kreft i bukspyttkjertelen prøver på alle tre tumor karakterer, SnoN var cytoplasma og ble uttrykt på et lavere nivå enn i den normale alderstilpassede prøver (Figur 4A-4B og Tabell 1). Across tumor karakterer, SnoN uttrykk var den høyeste i stadium III bukspyttkjertelen adenokarsinom (figur 4B). Men denne økningen var ikke over det normale vev kontroller. Svulsten stromal kammeret ikke har en høyere SnoN flekker enn den normale stroma (figur 4A og 4C). Således i ingen av tumorvev var SnoN uttrykt på et høyere nivå enn i normalt vev, i samsvar med en tumor suppressor rolle SnoN i bukspyttkjertelkreft.
A, Representative SnoN ekspresjon i normale bukspyttkjertel og i pankreas adenokarsinom i varierende karakterer på 20X (øverst) eller 40X (nederst) forstørrelser. E: epitel; S: stroma. Grønn: SnoN; blå, DAPI. B, SnoN flekker i normale og bukspyttkjertelen kreft epitelceller ble kvantifisert ved hjelp av Image J, og tallene ble plottet i boksplottet, som inkluderer normale prøver (n = 5, mener = 3.08) og bukspyttkjerteltumorprøver av klasse I (n = 21, middelverdi = 1,89), klasse II (n = 59, gjennomsnitt = 1,59), og klasse III (n = 8, gjennomsnitt = 2,09). SnoN uttrykk i tumorprøver var svakere enn i normale bukspyttkjertel prøver (p = 0,0855 for klasse I, p = 0,0125 for II, og p = 0,0518 for III). Ingen signifikant forskjell ble observert i SnoN epitelial farging mellom de pankreatiske tumorprøver. C, SnoN farging i normal (n = 2, betyr = 1,87) og stromale tumor prøver av klasse I (n = 20, gjennomsnitt = 2,10), II (n = 55, gjennomsnitt = 1,70), og III (n = 8, mener = 1,57). Det er ingen statistisk signifikant forskjell mellom tumor og normal stroma prøver.
SnoN Expression er betydelig redusert i bryst Ductal Adenocarcinoma
brystkreft vev matrise inneholder dupliserte biopsiprøver fra pasienter med infiltrerende bryst ductal carcinoma trinn II og III og metastaserende til lymfeknuter. Til vår overraskelse ble SnoN nivåer ikke forhøyet i noen av tumorprøver (figur 5A-5B og tabell 1). Tvert imot, SnoN nivåene var signifikant lavere enn for kontrollprøvene, og ingen korrelasjon ble observert mellom dens ekspresjonsnivåer og tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser (figur 5B). SnoN ble uttrykt ved høye nivåer i svært få prøver og var overveiende cytoplasma. For de fleste av tumorprøver, SnoN uttrykk i stroma var markert lavere enn i de normale kontrollprøvene (Figur 5A og 5C).
A, representant SnoN uttrykk i de normale og bryst ductal adenokarsinom prøver på 20X (øverst) eller 40X (nederst) forstørrelser. E: epitel; S: stroma. Grønn: SnoN; blå, DAPI. B, SnoN farging i normal (n = 6, gjennomsnitt = 1,59) og brysttumor epitelceller klasse II (n = 9 for IIA og n = 3 for IIB, betyr = 0), grad III (n = 10 for HIA og n = 5 for IIIC, betyr = 0), og metastatiske prøver (n = 10, betyr = 0). Det minker på SnoN uttrykk i tumorprøver i forhold til normalt vev har en p verdi på 0,0966 for klasse II, 0,0430 for klasse III, og 0,0321 for metastaserende prøvene. C, SnoN farging i stromale celler fra normale (n = 6, gjennomsnitt = 1,35) og brysttumorprøver av klasse II (n = 9 for IIA og n = 3 for IIB, betyr = 0), grad III (n = 10 for HIA og n = 5 til IIIC, gjennomsnitt = 0,38), og metastatiske prøver (n = 10, betyr = 0). De p-verdiene for hver tumor /normal sammenligning var 0,3340 for klasse II, 0,1647 for klasse III, og 0,0695 for metastaserende prøvene. D, Representative SnoN ekspresjon fra en normal bryst seksjon og DCIS snitt tatt fra den samme pasient. Grønn: SnoN; blå, DAPI.
For å teste muligheten for at SnoN kan være forhøyet i tidlige stadier av tumorigenesis men redusert på sent stadium av ondartet progresjon, vi samlet og farget 24 menneskelige DCIS prøver og deres matchende normalt vev for SnoN uttrykk. Interessant, men i en hvilken som helst individuell celle i DCIS-vev, nivået av SnoN ekspresjon var lik, eller i noen tilfeller lavere enn hos celler i normale vev, på grunn av en markert økning epitelial innhold i DCIS prøver, generell SnoN nivå i det hele vev var mye høyere enn i normalt vev (figur 5D). Dermed den samlede økningen i SnoN nivå i DCIS prøver gjenspeiler betydelig forhøyede epiteliale innholdet i disse vev, men ikke oppregulering av SnoN uttrykk i enkeltceller.
Tatt sammen, i motsetning til tidligere foreslått, er SnoN uttrykk redusert i nedre grade ondartede svulster i spiserøret, bryst, bukspyttkjertel og eggstokk (tabell 1). I esophageal og eggstokkreft, og i mindre grad i kreft i bukspyttkjertelen, SnoN uttrykk gradvis gjenvunnet i klasse III svulster.
