Abstract
De fleste livmorkreft kan klassifiseres histologisk som endometrioid, serøs eller klart celle. Non-endometrioid livmorkreft (NEECs, serøs og klar celle) som er mest klinisk aggressive av de tre store histotypes og er preget av Aneuploidy, en funksjon av kromosom ustabilitet. De genetiske endringer som ligger til grunn kromosom ustabilitet i livmorkreft er dårlig forstått. I denne studien brukte vi Sanger-sekvensering for å søke etter nukleotid varianter i koding eksoner og spleise veikryssene 21 kandidat kromosom ustabilitet gener, inkludert 19 gener involvert i søsterkromatidutveksling samhold, fra 24 primær, mikro-stabil NEECs. Somatiske mutasjoner ble verifisert ved sekvense matchet normale DNA. Vi senere resequenced muterte gener fra 41 flere NEECs samt 42 endometrioid egenkapitalbevis (EECS). Vi avdekket nonsynonymous somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18, etter og
MRE11A
i henholdsvis 3,7% (4 av 107), 1,9% (2 av 107), og 1,9% (2 av 107) av endometrial svulster. Total, 7,7% (5 av 65) av NEECs og 2,4% (1 av 42) av EECS hadde somatisk mutert ett eller flere av de tre gener. En undergruppe av mutasjoner er spådd å påvirke protein funksjon. Samtidig forekomst av somatiske mutasjoner i
ESCO1 Hotell og
CHTF18
var statistisk signifikant (
P
= 0,0011, tosidig Fishers eksakte test). Dette er den første rapporten av somatiske mutasjoner innenfor
ESCO1 Hotell og
CHTF18
i endometrial svulster og av
MRE11A
mutasjoner i mikro-stabil endometrial svulster. Våre funn tilsier fremtidige studier for å finne ut om disse mutasjonene er driver hendelser som bidrar til patogenesen av livmorkreft
Citation. Pris JC, Pollock LM, Rudd ML, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL, et al . (2013) Sekvensering av Kandidat Kromosom ustabilitet Gener i livmorkreft avslører somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
. PLoS ONE 8 (6): e63313. doi: 10,1371 /journal.pone.0063313
Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA
mottatt: 20 desember 2012; Godkjent: 01.04.2013; Publisert: 03.06.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert delvis av egenutført Research Program for National Human Genome Research Institute ved NIH (DWB, JCM); NIH stipend CA016519 (PH); Canadian Institutes of Health Research (CIHR) stipend MOP-38096 (PH); Manitoba Health Research Council (MHRC) stipend (KJM); CIHR /MHRC RPP New Investigator award (KJM); U01 CA113916 og R01 CA140323 (AKG); NIH RO1-1CA112021-01 (DCS); NCI SPORE i brystkreft ved Massachusetts General Hospital (DCS); og Avon Foundation (DCS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den vanligste diagnosen gynekologisk kreft i USA og er den åttende største dødsårsaken av kreft blant amerikanske kvinner [1]. Livmorkreft (ECS) utgjør det store flertallet av livmor kreft. Endometrioid, serøs, og klare karsinomer representerer de tre store histologiske undergrupper av EF. Hver subtype oppstår fra ulike forstadier, har distinkte kliniske atferd og forskjellige molekylære årsaker [2], [3].
endometrioid egenkapitalbevis (EECS) er østrogenavhengige tumorer assosiert med en samlet gunstig prognose dokumentert av en 5 -års relativ overlevelsesrate på ~90% [4]. I kontrast, serøs og klarcellet egenkapitalbevis (non-endometrioid egenkapitalbevis (NEECs)) er klinisk aggressive, østrogen-uavhengig svulster med 5-års relativ overlevelse på bare 44% og 65% henholdsvis [4]. NEECs bidra uforholdsmessig dødelighet fra EC. I en populasjonsbasert studie av endometrioid, serøs og tydelige celleegenkapitalbevis i USA Surveillance epidemiologi og sluttresultatet (SEER) program (1988-2001), utgjorde NEECs for 47% av dødsfallene, selv om de utgjorde bare 13% av diagnoser [5].
EECS og NEECs vise forskjellige moduser av genomisk ustabilitet. EECS tendens til å bli diploide eller nær-diploid men ofte oppviser mikrosatelitt ustabile (MSI) [6], [7], [8], [9], [10], [11]. I motsetning til dette, NEECs er ofte aneuploid, eller kromosomalt ustabil, men viser MSI bare sjelden [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
MSI reflekterer en mutator fenotype som følge av defekt mismatch reparasjon (anmeldt i [18]). I sporadiske livmorkreft, er de fleste tilfeller av MSI forklares med hypermethylation av MLH1 arrangøren, tap av MSH2 uttrykk, eller somatiske mutasjoner i
MSH6 plakater (anmeldt i [19]). Aneuploidy har nylig blitt foreslått å resultere fra en trinnvis prosess som følge av en ervervet toleranse for en ikke-diploid genom, via inaktivering av p53-reaksjonsveien, så vel som avvikende kromosomsegregering [20]. Selv inaktivere mutasjoner i
TP53 Hotell og p53 protein stabilisering er hyppige i NEECs, som forekommer hos opptil 90% av serøse svulster (anmeldt i [19]), forblir det genetiske grunnlaget for kromosom missegregation i NEECs dårlig forstått.
i gjær, kan kromosom missegregation oppstå fra mutasjoner i gener som regulerer søster-kromatid samhold [21], [22]. Mitotisk søsterkromatidutveksling samhold refererer til den fysiske kobling av replikert søsterkromatider ved cohesin proteinkomplekset til anaphase, for å sikre den trofaste segregering av søsterkromatider i datterceller. I
S. cerevisiae
, den cohesin komplekset består av Smc1, SMC3, Scc1, og Scc3 subenheter og lastes til kromatin ved slutten av G1 ved en prosess som krever Scc2-Scc4 kompleks [23], [24], [25 ]. Følgende kohesjon etablering avhenger av acetylering av SMC3 ved Eco1 acetyltransferase [26], [27], [28], så vel som aktiviteter av Chl1 og den alternative replikasjonsfaktoren C (RFC) -komplekset Ctf18-Ctf8-DCC-Forst [ ,,,0],21], [29]. Samhold etablering motvirkes av aktivitetene til Wpl1-Pds5 kompleks og Elg1-Forst kompleks [30], [31].
De proteiner som regulerer søsterkromatidutveksling samhold er høyt konservert gjennom evolusjonen. I pattedyrceller, er det mitotiske cohesin kompleks dannet av SMC1A (hSmc1), SMC3 (hSmc3), RAD21 (hScc1), og SA1 /SA2 (hScc3). Cohesin lasting er avhengig NIPBL (hScc2) og MAU2 (hScc4) (anmeldt i [32]). Cohesion etablering krever acetylering på SMC3 av ESCO1 og ESCO2 acetyltransferases [33] og er også regulert av CHTF18-RFC kompleks [34] og ved DDX11 (hChl1) [35], [36].
Det er en økende mengde bevis implicating mutasjons avbrudd av Søsterkromatidutbytting samhold gener i menneskelig kreft. Somatiske slettinger og mutasjoner i flere gener som regulerer søsterkromatidutveksling samhold har nylig blitt avdekket i tykktarmskreft, Ewings sarkom, glioblastom, melanom, akutt myelogen leukemi, og myeloide sykdommer [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Vi har tidligere beskrevet somatiske tap-av-funksjon mutasjoner av
ATAD5
i livmorkreft [44]. ATAD5 er den menneskelige orthologue av
S. cerevisiae
Elg1, som danner en RFC-lignende kompleks som deltar i søsterkromatidutveksling samhold [45], [46].
I denne studien, forsøkte vi å finne ut om ytterligere Søsterkromatidutbytting samhold gener er somatisk mutert i endometrial svulster. Vi resequenced menneske orthologues av 19 gener involvert i reguleringen av søsterkromatidutveksling samhold, samt to ekstra kandidat kromosom ustabilitet (CIN) gener, fra 24 primær NEECs. Muterte gener ble deretter sekvensert fra 83 flere endometrial svulster. Vår studie avdekket nonsynonymous somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
i en undergruppe av menneskelige endometrial svulster.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
NIH Office of mennesker forskning fastslått at denne forskningen ikke var «mennesker forskning» per Common Rule (45 CFR 46), og derfor at ingen IRB anmeldelsen ble nødvendig for sekvense av anonymiserte prøver i denne studien.
kliniske prøver
anonymisert, primær endometrial tumorvev (45 serøs, 20 klar celle, og 42 endometrioid) og matchet histologisk normalt vev ble oppnådd fra Cooperative menneskelig vev Network, eller fra Biosample Repository på Fox Chase Cancer Center, Philadelphia PA. Seks tilfeller av matchet tumor og normal DNA ble anskaffet fra Oncomatrix. Alle tumor-vev ble oppsamlet før behandling. En hematoxylin og eosin (H E). Farget delen av hver kreftprøve ble anmeldt av en patolog for å verifisere histologi og å avgrense områder av vev med høy (≥70%) tumor celleinnhold
Nukleinsyre isolasjon og identitet testing
Genomisk DNA ble isolert fra macrodissected vev ved hjelp av Puregene kit (Qiagen). Sammenkoblede, tumor-normal DNA ble genotypet med Coriell Identity Mapping kit (Coriell) i henhold til produsentens instruksjoner. Genotyping fragmenter ble størrelse separert på en ABI-3730
xl
DNA analysator (Applied Biosystems) og alleler ble scoret ved hjelp GeneMapper (Applied Biosystems).
Identifikasjon av ortologe gener
En konsolidert liste over kjente og kandidat menneskelige orthologues av gjær kromosom stabilitet gener (med demonstrert roller i søsterkromatidutveksling samhold) ble identifisert gjennom standard cross-arter tilnærminger. Kort, InParanoid 7 og HomoloGene databaser ble spørres å identifisere kjente orthologues, mens BLASTp ble ansatt for å identifisere de øverste treffet kandidater (basert på E-verdi) fra de ikke-redundante proteinsekvenser i
Homo sapiens
database .
Revers transkriptase PCR (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra 5 endometrioid og 2 serøs livmorkreft cellelinjer ved hjelp Trizol Reagens (Ambion). Et kommersielt tilgjengelig humant total RNA kontroll blanding (Applied Biosystems) ble anvendt som en positiv kontroll. cDNA syntese ble utført på 1 ug total RNA med høy kapasitet cDNA arkivet sett ved hjelp av tilfeldige heksamer (Applied Biosystems). cDNA (0.2μl) ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primerpar som er gitt i tabell S1. Amplifisering bestod av 40 sykluser ved bruk av følgende parametere: 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, med en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 10 min. PCR-produktene ble separert på en 1% agarosegel farget med etidiumbromid i 0,5 x TAE buffer og visualisert under ultrafiolett belysning.
Cellelinjer og Western blot-analyse
Serous endometrial cancer-cellelinjer (ark1 og ARK2) ble vennlig levert av Dr. Alessandro Santin (Yale School of Medicine). Endometrioid endometrial cancer-cellelinjer (RL-95-2, HEC1A, HEC1B, ANC3A) og en cellelinje avledet fra en dårlig differensiert endometrial adenokarsinom (KLE) ble oppnådd fra American Type Culture Collection, eller NCI Developmental Therapeutics Program cellelinje depotet . Celler ble vasket i fosfat-bufret saltvann, etterfulgt av lysis i is-kald RIPA-buffer (Thermo Scientific) inneholdende 1 mM Na-ortovanadat, 10 mM NaF, og 1X protease inhibitor cocktail (Roche). Lysatene ble sentrifugert og like mengder av det klarede lysat ble denaturert ved 95 ° C i 2 x SDS-prøvebuffer (Sigma) før SDS-PAGE og overføring til PVDF-membraner (Bio-Rad). Primære og HRP-konjugerte sekundære antistoffer var: αMRE-11 (Cell Signaling), αCHTF18 (Novus biologisk), αESCO1 (Novus biologisk), α-α /β-Tubulin (Cell Signaling), geit anti-mus HRP (Cell Signaling) og geit anti-kanin HRP (Cell Signaling). Immunreaktive proteiner ble visualisert med forbedret chemiluminescence (Pierce).
Primer design og PCR forsterkning
Primer parene ble utformet, ved hjelp av publiserte metoder [47], for å målrette 97,4% (458 av 470) av alle eksoner av de 21 gener i mutasjonen oppdagelse skjermen (Tabell S2), og alle eksoner på de tre gener i mutasjonen utbredelsen skjermen (tabell S3). PCR betingelser er tilgjengelig på forespørsel.
Nukleotidsekvensering
PCR produktene ble utsatt for toveis Sanger-sekvensering ved hjelp av M13 primere og BigDye Terminator versjon 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Sekvenseringsreaksjoner ble kjørt på ABI 3730
xl
DNA-analyse (Applied Biosystems). Sequence sporkvaliteten ble vurdert med base-ringer program, Phred [48], [49]. Alle spor ble inkludert i den etterfølgende analyse, fordi delesjon-innsetting polymorfismer kan etterligne dårlig kvalitet av data fra et Phred-kvalitetsmål, men kan inneholde gyldige sekvensdata. Alle sekvenser for et gitt primerpar ble satt sammen ved hjelp Consed [50]; overlapp amplimers ble montert separat for å tillate uavhengig kryssvalidering av samtaler i overlappende områder. Sekvensvarianter, inkludert single-nucleotide forskjeller og kort ( 100 basepar) innsettinger og slettinger, ble identifisert ved hjelp av PolyPhred v6.11 [51] og en in-house algoritme (DIPDetector) optimalisert for økt følsomhet i å finne innsettinger og slettinger fra stilte spor data. DIPDetector analyserer Sanger-sekvense spor og spår innsettinger og slettinger ved først å undersøke leser justeringer for homozygote varianter. Den søker da for signaturer av heterozygote innsettinger og slettinger innen utgangen av basecaller Phred kjøre med – poly alternativet [49]. Etter forming to vektorer som inneholder basene med høyeste topparealene ved hver stilling av lese- (eller tildele det høyeste området topp til begge vektorer når den nest største topp har et areal mindre enn 10% av størrelsen av den største topp), DIPDetector forsøk på å fase disse vektorer ved å sette potensielle skift av alle mulige størrelser inn i alle mulige posisjoner av lese- og skårer disse skift etter hvor godt den resulterende skiftet vektorer matche de observerte baser i sporet. Humane genom sammenstilling hg18 (NCBI Bygg 36,1) ble anvendt som referansesekvensen. Variant stillinger ble kryss-referert til dbSNP (Build 129) oppføringer til å identifisere kjente polymorfismer. For å bestemme hvorvidt nye varianter var somatiske mutasjoner eller polymorfismer germline, den aktuelle tumor-DNA og avstemt normal DNA ble på nytt amplifisert i en uavhengig PCR etterfulgt av sekvensanalyse av varianten stilling. Den anslåtte effekten av somatiske mutasjoner på protein funksjon ble evaluert
i silico
hjelp Mutation Assessor slipper to (https://mutationassessor.org/), sile (https://sift.jcvi.org/), og Polyphen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml).
Beregning av oppdagelsen skjermen makt
Den estimerte makt for å oppdage en genmutasjon i en sett av 24 svulster er 1- (1-X)? 24, der X er den faktiske brøkdel av svulster med en mutasjon i dette genet.
diskusjon
i en mutasjon oppdagelse skjerm
Resultater og analyserte vi 24 primær NEECs for tilstedeværelsen av nucleotide varianter innenfor koding eksoner og spleise veikryssene 21 kandidat kromosom ustabilitet gener, som uttrykkes ved variable nivåer, i livmorkreft cellelinjer (figur S1). Nitten av disse genene er involvert i reguleringen av søster-kromatid samhold, basert på deres sekvens homologi til samhold gener i
S. cerevisiae product: (tabell 1). De 24 NEECs besto av 17 serøse egenkapitalbevis og 7 klarcellet egenkapitalbevis; fem av de serøse svulster (T33, T45, T65, T69, T70) ble nylig utsatt for hele exome sekvensering [52]. Vi inkluderte bare MSI-stabile svulster i oppdagelsen skjermen; MSI data er rapportert andre steder [52].
Vi har fått høy kvalitet sekvensdata for 87,6% (5,64 Mb) av baser (6.44 Mb) målrettet. Etter eksklusive varianter som ble kommentert som enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) innen dbSNP (Build 129), var det 109 unike nukleotid varianter som representerte potensielle somatiske mutasjoner. For å finne ut om disse variantene var somatiske mutasjoner eller germline varianter, vi reamplifisert og sekvensert variant posisjoner fra den aktuelle svulst DNA og matchet normal DNA. Tre varianter var
bein fide
somatiske mutasjoner, til stede i svulsten DNA, men fraværende fra matchet normal DNA. De somatisk muterte gener var
ESCO1 plakater (etablering av samhold en homolog 1 (
S. Cerevisiae
)),
CHTF18 (
kromosom overføring troskap faktor 18 homolog (
S. cerevisiae
)), og
MRE11A plakater (meiotisk rekombinasjon 11 homolog A (
S cerevisiae
).); hver genet ble mutert i 4% (1 av 24) av NEECs i oppdagelsen skjermen. Selv om vi fant ingen bevis for somatiske mutasjoner i de resterende 18 kandidat CIN gener, er det viktig å erkjenne at våre funn skjermen har tilstrekkelig kraft til å oppdage alle somatiske mutasjoner stede i NEECs. Vi anslår at i en skjerm på 24 NEECs, makt til å oppdage gener som er somatisk mutert i 5%, 10% eller 15% av alle NEECs er 71%, 92% og 98% henholdsvis.
neste søkt å bestemme mer presist hyppighet og spekteret av somatiske mutasjoner i
ESCO1, CHTF18, etter og
MRE11A
i livmorkreft. For å gjøre dette, utførte vi en prevalens skjerm der vi resequenced de koding eksoner og spleiseseter i de tre gener fra ytterligere 28 serøs svulster, 13 klare celle svulster, og 42 endometrioid svulster, uselekterte for MSI status.
i de samlede funn og prevalens skjermer, avdekket vi nonsynonymous somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
i henholdsvis 3,7% (4 av 107) , 1,9% (2 av 107), og 1,9% (2 av 107) av endometriale tumorer (tabell 2 og fig S2). Total, 7,7% (5 av 65) av NEECs og 2,4% (1 av 42) av EECS hadde somatiske mutasjoner i ett eller flere av de tre gener. Sammenlignet med kjente konsensuskreftgener med etablerte roller i livmorkreft, og betydelig muterte kreftgener,
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
ble sjelden mutert (Figur S3 Figur S4, figur S5) [44], [52], [53], [54], noe som tyder på at disse tre genene er enten sjeldne sykdomsfremkallende driver gener for livmorkreft, eller at de er ikke-patogene gener som har kjøpt passasjer mutasjoner . Immunoblotting bekreftet uttrykk for MRE11A og CHTF18 i panelet for livmorkreft cellelinjer (figur S6); ESCO1 ble variabelt uttrykt blant de samme cellelinjer.
ESCO1, etter som koder for et lysin acetyltransferase som er avgjørende for etablering av søsterkromatidutveksling samhold i pattedyrceller, ble somatisk mutert i 2,2% (1 av 45) av serøs ECS, 10% (2 av 20) av klar celle ECS, og 2,4% (1 av 42) av endometrioid ECS. To av
ESCO1
mutasjoner er spådd å påvirke protein funksjon. Den ESCO1
R786C missense-mutant, i acetyltransferase domene, er anslått å påvirke protein funksjon av både SIFT og Polyphen algoritmer (tabell 2). Vi spekulerer i at ESCO1
E338X tull mutant, som vi avdekket i en serøs-EC, kan være et tap-funksjon mutant siden et protein som produseres av dette allelet ville være for tidlig avkortet og ikke klarer å inkludere acetyltransferase domene. Alternativt tull-mediert nedbrytning av
ESCO1
E338X
transkripsjon kan føre til haploinsufficiency.
CHTF18
ble somatisk mutert hos 2,2% (1 av 45) av serøs egenkapitalbevis og 2,4% (1 av 42) av endometrioid egenkapitalbevis. I menneskelige celler, regulerer CHTF18-RFC kompleks acetylering av SMC3 samhold-subenheten av ESCO1 og ESCO2 acetyltransferases [34], og dermed bidra til etablering av søsterkromatidutveksling samhold. Den CHTF18-RFC komplekset har også vært innblandet i stimulering av DNA polymerase η aktivitet, og i rekruttering av DNA polymerase ε til områder av gap-fylling reparasjonssyntese [55], [56]. Begge CHTF18 mutanter vi avdekket i endometrial cancer lokalisere til den karboksy-terminale enden av proteinet (figur 1), innenfor en region (restene 576-876) som formidler binding til RFC2-5 [57]. Den CHTF18
R854W mutant er spådd å muligens påvirke protein funksjon av Mutation Assessor og sile algoritmer (tabell 2). Interessant er at flertallet av
CHTF18
mutasjoner ble observert i andre kreftformer også lokaliseres til den C-terminale ende av det kodede protein [58]. Disse observasjonene øke muligheten for at somatiske missense mutasjoner i C-terminalen av CHTF18, funnet her og i andre kreftformer, kan forstyrre CHTF18-RFC interaksjon.
Individuelle somatiske mutasjoner er indikert av firkanter (nonsense mutasjoner) eller diamanter (missense mutasjoner). Domene stillinger er avledet fra [65], [66], [61], [59], [67]. GAR: Glysin-Arginine-Rich motiv; RBD: RAD50 bindende domene; RFC boks. Replication Factor C boksen
MRE11A
ble somatisk mutert i 4,4% (2 av 45) av serøs egenkapitalbevis. Nei
MRE11A
mutasjoner ble observert blant klarcellet eller endometrioid svulster. MRE11A besitter både endonuklease-aktivitet og 3′-5 «eksonukleaseaktivitet og, som en komponent i MRE11A-RAD50-NBS1 (MRN) kompleks, spiller det en vesentlig rolle i den cellulære responsen til dobbeltstrengbrudd (oversikt i [59]). I pattedyrceller, er MRN-komplekset også nødvendig for ATR-mediert fosforylering av SMC1 subenheten av cohesin [60], og siRNA uttømming av
MRE11A
i humane celler resulterer i utjevnings defekter [37]. Den MRE11A
D131N somatisk mutant, som vi avdekket i en serøs EC, finner sted ved en sterkt evolusjonært konservert rest i den tredje phosphoesterase motiv innen nukleasen domenet [61] og er antatt å påvirke proteinfunksjonen (figur 1, og tabell 2 ). Den MRE11A
D692Y mutant, i det DNA-bindende domene, er også forutsies å være funksjonelt signifikant (tabell 2). Selv intronic somatiske mutasjoner i
MRE11A
har blitt rapportert i mikro ustabil livmorkreft [62], [63], [64], til vår kunnskap, er denne studien den første rapporten av somatiske mutasjoner av
MRE11A
i mikro stabile endometrial svulster (tabell 2). Av notatet, har MRE11A
D131N variant, som var somatisk i vår studie, også blitt observert som en sjelden befolkning variant (TMP_ESP_11_94212851) i NHLBI Exome Sequencing Project (URL: https://evs.gs.washington.edu /EVS /), med en mindre allel frekvens på 0,0233% i EuropeanAmerican befolkningen.
den gjensidige eksklusivitet eller co-forekomst av somatisk mutasjoner i to eller flere gener kan indikere funksjonell redundans eller funksjonell synergi, henholdsvis. For å bestemme mønsteret av somatiske mutasjoner i utjevnings gener i livmorkreft, kombinert vi resultatene av denne undersøkelsen med vår tidligere analyse av
ATAD5 (hELG1)
-genet i den samme kohort av ECS [44]. Selv om antall muterte tilfeller er liten, vi observert at somatiske mutasjoner i
ESCO1 Hotell og
ATAD5
tendens til å co-skje i livmorkreft (
P
= 0,0102, to -endepåfestet Fishers eksakte test), som gjorde somatiske mutasjoner i
ESCO1 Hotell og
CHTF18 product: (
P
= 0,0011) (figur 2 og tabell 3). Disse observasjonene øke muligheten for at det kan være funksjonell synergi mellom
ESCO1 Hotell og
ATAD5
mutanter, og mellom
ESCO1 Hotell og
CHTF18
mutanter, i livmor kreft. I denne forbindelse er det verdt å merke seg at somatiske mutasjoner i
ESCO1 Hotell og
ATAD5
tendens til også co-skje i kolorektal tumorer (
P
= 0,000001) (figur S7) , basert på en analyse av de offentlig tilgjengelige mutasjon data generert av The Cancer Genome Atlas [https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/]. Et alternativ, men ikke gjensidig utelukkende, er muligheten for at co-forekommende mutasjoner av samhold gener i livmorkreft kan reflektere en underliggende hypermutable fenotype. Vi har tidligere evaluert kohort av 107 svulster i denne studien for mikro ustabilitet og
MSH6
mutasjoner [44], [52], som begge kan gi opphav til hypermutability grunnet defekt mismatch reparasjon (MMR). Selv om tre av svulstene med samhold genmutasjoner i denne studien var enten MSI-ustabil eller
MSH6
-mutated (figur 2), observerte vi ingen statistisk signifikant sammenheng mellom mutasjoner i Søsterkromatidutbytting samhold gener og mangler i mismatch reparasjon (tabell S4 og tabell S5).
Individuelle svulster (T) er angitt med vertikale grå barer. Svulster består av NEECs (T3, T51, T62, T68, T77, T79, T113) og en EEC (T88). Gener (til venstre) og nonsynonymous somatiske mutasjoner (oransje bokser) er indikert.
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
ble analysert i denne studien; *
ATAD5
mutasjoner,
MSH6
mutasjoner, og mikro ustabilitet (MSI) har tidligere blitt beskrevet andre steder [44], [52].
Oppsummert har vi identifisert sjeldne, nonsynonymous, somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
i en undergruppe av primære endometrial svulster. Fremtidige studier vil være nødvendig for å fastslå om disse mutasjonene er driver hendelser som bidrar til patogenesen av livmorkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
RT-PCR-analyse av 21 kandidat menneskelig kromosom ustabilitet gener i 7 menneskelige endometrial kreft cellelinjer. Gel elektroforese av RT-PCR produktene bekrefter uttrykk for 21 kandidat kromosom ustabilitet gener i serøse og endometrioid livmorkreft cellelinjer. Positive og negative (vann) PCR Kontrollene vises. .
ACTB Hotell og
GAPDH
fungert som positive kontrollgener
doi: 10,1371 /journal.pone.0063313.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Sequence kromatogrammene viser somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
, og
MRE11A
i livmorkreft DNA, sammenlignet med matchede normale DNA
doi.: 10,1371 /journal.pone.0063313.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Oncoprints viser fordelingen av somatiske mutasjoner i serøse endometriale tumorer som rapportert i denne studien (*) og andre steder [44], [52], [53], [54]. Hver blå linjen representerer en individuell tumor (T). Nonsynonymous somatiske mutasjoner og MSI + er angitt med røde streker. For
MSH6
, germline varianter av ukjent funksjonell betydning vises av appelsin barer. Den observerte frekvens (%) av muterte tilfeller for hvert gen, vises til høyre
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Oncoprints viser fordelingen av somatiske mutasjoner i store celle endometriale tumorer som rapportert i denne studien (*) og andre steder [44], [52], [53], [54]. Hver blå linjen representerer en individuell tumor (T). Nonsynonymous somatiske mutasjoner og MSI + er angitt med røde streker. For
MSH6
, er en germline variant av ukjent funksjonell betydning vises av den oransje linjen. Den observerte frekvens (%) av muterte tilfeller for hvert gen, vises til høyre
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Oncoprints viser fordelingen av somatiske mutasjoner i endometrioid endometriale tumorer som rapportert i denne studien (*) og andre steder [44], [52], [53], [54]. Hver blå linjen representerer en individuell tumor (T). Nonsynonymous somatiske mutasjoner og MSI + er angitt med røde streker. For
MSH6
, germline varianter av ukjent funksjonell betydning vises av appelsin barer. Den observerte frekvens (%) av muterte tilfeller for hvert gen, vises til høyre
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
immunoblotter viser uttrykket nivåer av MRE11A, CHTF18 og ESCO1 proteiner blant et panel av 7 menneskelige livmorkreft cellelinjer. Tubulin ble brukt som en kontroll for protein lasting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s006 plakater (TIF)
Figur S7.
Oncoprint viser mønstre av somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, og
ATAD5
i tykk- og endetarmskreft, som rapportert av The Cancer Genome Atlas (TCGA). (Øvre panel) Individuelle kolorektal tumorer er indikert med vertikale grå barer. Gener (til venstre) og nonsynonymous somatiske mutasjoner (oransje søyler) er indikert. (Nedre panel) I kolorektal kreft, mutasjoner i
ATAD5 Hotell og
ESCO1
viste en sterk tendens til co-forekomst; mutasjoner i
MRE11A Hotell og
ESCO1
, og i
ATAD5 Hotell og
MRE11A
viste en tendens mot co-forekomst. Dataene ble hentet fra 224 sekvensert prøver; de TCGA data ble åpnet, og den gjensidige eksklusivitet beregnet via cBio Cancer Genomics Portal (https://www.cbioportal.org/public-portal/).
doi:10.1371/journal.pone.0063313.s007
(TIF)
Table S1.
RT-PCR primere brukes til å vurdere uttrykket av 21 kandidat menneskelige kromosom ustabilitet gener
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s008 plakater (XLSX)
Tabell S2.
PCR primere brukes til å forsterke 21 kandidat menneskelige kromosom ustabilitet gener innen oppdagelsen skjermen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s009 plakater (DOC)
tabell S3.
PCR primere som brukes til å forsterke og sekvensen
CHTF18, ESCO1, etter og
MRE11A
innenfor valideringen skjermen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s010
(DOC)
Tabell S4.
Status for mikro ustabilitet,
MSH6
,
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, og
ATAD5
for 107 endometrial svulster i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s011 plakater (XLSX)
Tabell S5.
Frekvens av somatiske mutasjoner i
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, og
ATAD5
samhold gener i 105 endometrial svulster, ifølge mikro ustabilitet og
MSH6
status
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063313.s012 plakater (XLSX)
takk
Vi takker våre kolleger for grundig lesning av manuskriptet og gjennomtenkt diskusjon.
