Abstract
Sporadisk tykktarmskreft (CRC) er en vanlig kreft og også en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis. Avvikende ekspresjon av transkripsjonsfaktoren SOX2 har nylig blitt observert i en rekke krefttyper, men dens rolle i CRC er ikke blitt fullstendig klarlagt. Her studerte vi uttrykk for SOX2 i 441 CRC pasienter ved immunhistokjemi og relatert uttrykket til clinicopathological og molekylære variabler og pasient prognose. SOX2 ble uttrykt i 11% av svulstene og var signifikant assosiert til
BRAF
V600E
mutasjon, men ikke til
KRAS
mutasjoner (kodon 12 og 13). SOX2 positivitet var korrelert til dårlig pasient overlevelse, særlig i
BRAF
V600E
muterte tilfeller.
In vitro
studier viste at celler uttrykker konstitutivt aktiv
BRAF
V600E
hadde økt SOX2 uttrykk, et funn som ikke finnes i cellene uttrykker
KRAS
G12V
. Videre blokkerer nedstrøms BRAF signalering ved hjelp av en MEK-inhibitor som resulterte i en redusert ekspresjon av SOX2. Siden SOX2 overekspresjon er blitt korrelert med øket migrering og invasjon, undersøkte vi SOX2-ekspresjon i humane CRC levermetastaser og funnet at en SOX2 positiv primær CRC hadde også SOX2 uttrykk i tilsvarende levermetastaser. Til slutt fant vi ut at cellene overekspresjon SOX2
in vitro
viste forbedret uttrykk for FGFR1, som har blitt rapportert å korrelere med levermetastaser i CRC. Våre nye funn tyder på at SOX2 uttrykk er delvis regulert av BRAF signalering, og en økt SOX2 uttrykk kan fremme CRC metastase og formidle en dårlig pasient prognose
Citation. Lundberg IV, Löfgren Burström A, Edin S, Eklöf V , Öberg Å, Stenling R, et al. (2014) SOX2 Expression er regulert av BRAF og bidrar til dårlig Pasient Prognose i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10,1371 /journal.pone.0101957
Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, West German Cancer Center, Tyskland
mottatt: 31 januar 2014; Godkjent: 12 juni 2014; Publisert: 10. juli 2014
Copyright: © 2014 Lundberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra The Cancer Research Foundation i Nord-Sverige, OE og Edla Johanssons fundament, Petrus og Augusta Hedlunds Foundation, Magn Bergvall Foundation, Den svenske Kreftforeningen, Den svenske Forskningsrådet og Umeå universitet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sporadisk tykktarmskreft (CRC) er en vanlig kreftform i den vestlige verden og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall. Den høye dødeligheten på grunn av okkult eller klinisk identifisert disseminert sykdom allerede ved diagnose, understreker viktigheten av en høyere forståelse av de biologiske hendelser som fører til en invasiv kreft. Denne kunnskapen er viktig for å forutsi pasientens prognose og skape nye, kraftige behandlinger. Den adenom til karsinom sekvens depicture de genetiske hendelser som trengs for en normal kolon epithelia å bli forvandlet til en ondartet fenotype i de fleste av de sporadiske CRC tilfellene [1]. Siden metastatisk prosess i CRC ikke er så fullt ut forstått, er det vanskelig å belyse hvorfor noen svulster blir mer aggressive og metastasere lettere enn andre. Identifisering av molekylære markører uttrykt i invasive svulster som kan forutsi dårlig pasient prognose er derfor et viktig forsknings emnet.
SRY (sex bestemme region Y) -boks 2 (SOX2) er et medlem av den store
SOX
genfamilie, som omfatter transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være viktige i reguleringen av utviklingsmessige prosesser og celletype spesifikasjon [2]. Nøkkelen medlem SOX2 spiller viktige roller i vedlikehold av cellen pluripotency og selvfornyelse i begge embryonale stamceller [3] og i induserte pluripotente stamceller [4]. Nylig har det også blitt rapportert at selvfornyelse av kreft stamceller blir opprettholdt ved SOX2 [5], som tyder på en rolle ongogenic av SOX2. Overekspresjon av SOX2 kan sees i CRC [6] – [8], så vel som i en rekke andre ondartede sykdommer slik som bryst, pankreas og gastrisk kreft [9] – [11], noe som viser dens involvering i karsinogenese. I tillegg har SOX2 blitt foreslått å være involvert i CRC-cellemigrering, invasjon og metastase, hvor matriks-metalloproteinase 2 (MMP2) er foreslått som en potensiell mediator for den SOX2 virkning [6], men de nøyaktige mekanismer som fortsatt må bli oppdaget .
i den foreliggende studien evaluerte vi SOX2 ekspresjon i primære CRC, såvel som i tilsvarende prøver av levermetastaser, og korrelert til våre funn pasient prognose og molekylære tumoregenskaper. Våre resultater tyder på at SOX2 uttrykk er, i det minste delvis, regulert av BRAF, og at ekspresjon av BRAF
V600E i en fase avhengig måte korrelerer til en pasient dårlig prognose.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
i denne studien, håndtering av vevsprøver og pasientdata ble godkjent av forskningsetisk komité ved Umeå universitetssykehus (Regional etisk Review Board i Umeå, Sverige). Dette inkluderer den framgangsmåte der pasienter verbalt ga sitt samtykke, som ble dokumentert i hver pasientjournalen og vurderes av etikkomiteen å være tilstrekkelig. Hver vevsprøve ble registrert som et saksnummer og årstall i databasen som brukes for analysene, og navnene eller personlig identifikasjon ble ikke angitt.
Kliniske prøver
De vevsprøver CRC inkludert i studien var fra tykktarmskreft i Umeå Study (crums), som består av pasienter som har blitt kirurgisk resected for primær CRC mellom 1995 og 2003 ved Umeå universitetssykehus, Sverige. Histopatologiske klassifiseringer av alle tilfeller ble utført av en patolog ved å gjennomgå rutinemessig farget tumorsnitt. Kliniske data ble oppnådd ved å gjennomgå pasientjournaler, og overlevelsesdata ble samlet i løpet av høsten 2012.
13 pasienter med arkiv vev fra både primære kolorektal adenokarsinom og tilsvarende fjernt levermetastaser som ble diagnostisert i samme tidsintervall som crums ble inkludert i studien. Disse ble identifisert ved hjelp av datastyrt pasientjournalen database ved Institutt for klinisk patologi, Umeå universitetssykehus, Sverige. Svulstene var gradert og diagnostisert av patologer på tidspunktet for kirurgi eller biopsi.
Immunohistochemistry
CRC prøvene ble formalinfiksert og parafininnebygd i henhold til rutinemessige protokoller ved Institutt for klinisk patologi, Umeå universitetssykehus, Sverige. De ble kuttet ved 4-mikrometer og deretter tørket, deparaffinized og vannes ut. Anti-SOX2 polyklonalt antistoff [12] – [14] (Abcam, Cambridge, UK) ble anvendt i en konsentrasjon på 1:500 i en halvautomatisk maskin farging (benk Mark Ultra, Ventana Inc) og visualisert ved iView DAB Detection Kit (Ventana Inc)). Objektglassene ble motfarget med hematoksylin.
For crums, ble 449 tilfeller immunhistokjemisk farget, men på grunn av mangel av tumormateriale (n = 7) eller tap gjentatt vev i løpet av antigen gjenfinning trinn (n = 1), åtte dem kunne ikke analyseres for SOX2 farging. Alle 13 pasienter med tilsvarende metastaser ble med hell farget, og alle kunne analyseres for SOX2-positive celler. Prøvene ble vurdert under lysmikroskopi, og hver prøve ble evaluert to ganger av samme observatør og i tilfeller med avvik å score, ble en tredje sluttevaluering gjort. Nuclear farging ble vurdert som negativ eller positiv. Sporadisk cytoplasma eller stromal farging ble ikke analysert.
Statistiske analyser
Foreninger mellom SOX2 uttrykk og ulike clinicopathological variabler ble analysert ved hjelp av Pearsons χ
2 tester. For å estimere kreftspesifikk overlevelse, ble Kaplan-Meier overlevelsesanalyse brukt, og sammenligninger mellom grupper ble gjort ved hjelp av log-rank test. Pasienter i crums kohort som døde innen en måned fra kirurgi på grunn av postoperative komplikasjoner (n = 37) ble ekskludert fra overlevelsesanalyser. Cox proporsjonale hazard modeller ble brukt for multivariate analyser. Kreftspesifikke hendelser ble definert som død med kjente disseminert eller tilbakevendende sykdom, og sakene ble sensurert ved slutten av oppfølging eller ved død av andre årsaker. SPSS /PASW statistisk programvare versjon 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) ble anvendt for statistiske analyser. Genuttrykk nivåer ble sammenliknet med to tailed Student
t
test. Hver søyle representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter og feil barer illustrerer standardavvik.
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for alle analyser
Cellelinjer og cellekultur
I denne studien, tykktarmskreft cellelinje Caco2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med Glutamax supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2. Generering av de stabile transfektanter uttrykker SOX2 (Caco2-SOX2), mutant BRAF (Caco2-BRAF
V600E) eller muterte KRAS (Caco2-KRAS
G12V) ble utført ved trans Caco2-celler med pcDNA3.3-SOX2 ( Derrick Rossi, Childrens Hospital Boston, USA, via Addgene), pMCEF-BRAFV
600E (vennlig levert av Prof R. Marais) eller pcDNA3-KRAS
G12V (gaver fra Dr N. Ignatenko) ved hjelp Caco-2 transfeksjon Reagens (Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Mellom 48 og 72 timer etter eksponering for DNA ble transfektert celler valgt med 800 mikrogram /ml G418 (Gibco, Life Technologies, Stockholm, Sverige). Medium som inneholder G418 ble endret to ganger i uken.
Hvis du vil blokkere BRAF signalisering i Caco2 og Caco2-BRAF
V600E celler, 20 mikrometer MEK hemmer PD98059 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), eller DMSO som kontroll, ble tilsatt til cellene etter inkubering i 24 eller 48 timer.
RT-PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp av NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren , Tyskland), og cDNA ble syntetisert med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Life Technologies, Stockholm, Sverige) i henhold til produsentens protokoller. Primerene anvendt i studien var fra DNA Technology A /S (Aarhus, Danmark) og deres sekvenser var som følger: GAPDH frem: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 «, omvendt: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3». SOX2 frem: 5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 «, omvendt: 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3». FGFR1 frem: 5′-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 «, omvendt: 5’TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3». FGFR2 frem: 5′-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 «, omvendt: 5’GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3». FGFR3 fremover: 5′-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 «, omvendt: 5′-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3». FGFR4 frem: 5′-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 «, omvendt: 5′-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3». Hver PCR-reaksjon inneholdt 25 ng cDNA, og hver prøve ble kjørt i duplikat. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Standard avvik ble beregnet fra gjennomsnittet av triplikate reaksjoner. RT-PCR-reaksjoner ble utført på Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og følgende Syklusparametrene ble benyttet: 50 ° C i 2 minutter og deretter en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Genekspresjon ble normalisert til GAPDH.
Western blot
For å analysere SOX2 uttrykk i stallen Caco2-SOX2 transfektant ble cellene lysert i lyseringsbuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA pH 8,0, 15 mM MgCl
2, protein-inhibitorer) før proteinene ble separert ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Blottet ble inkubert med primær SOX2 antistoff (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) i henhold til produsentens instruksjoner. Blottet ble utviklet med ECL Velg Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Uppsala, Sverige).
Digital dråpe PCR
Genomisk DNA ble isolert fra cellene ved hjelp av NucleoSpin Tissue kit (Macherey- Nagel, Düren, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
Digital dråpe PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ble brukt til å verifisere Caco2 transfektanter uttrykker mutant
BRAF
V600E product: (Caco2-BRAF
V600E) og
KRAS
G12V plakater (Caco2-KRAS
G12V). Den ddPCR-metoden har blitt presentert grundig andre steder [15], [16]. Kort fortalt lar ddPCR påvisning og kvantifisering av både mutasjon og villtype i samme reaksjon med fluorophores FAM og HEX konjugert å sekvensere spesifikke prober. I ddPCR-metoden, er en PCR prøven på 20 ul delt inn i 20 000 nanoliter dråper som gir ca 20 000 leser.
For å bekrefte en vellykket transfeksjon av Caco2-BRAF
V600E, primere og prober var som følger: frem: 5′-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 «, omvendt: 5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′, villtype-probe: 5»-FAM-56 /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 «, mutasjon probe: 5»-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 «(DNA Technology A /S, DNA Technology A /S) [17], [18]. PCR ble utført i en T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ved anvendelse av program: 95 ° C i 10 min; 40x sykluser av 95 ° C i 15 s og 56 ° C i 1 minutt (rampehastighet 2 ° C /sek); og 98 ° C i 10 min. 900 nM av primere, og 250 nM av respektive sonden ble brukt
For deteksjon av vellykket transfeksjon av Caco2-KRAS
G12V, analyser for ddPCR ble brukt (PrimePCR ddPCR mutasjonstest. KRAS p.G12V analysen, human; PrimePCR ddPCR mutasjonstest: KRAS villtype for p.G12V analyse, human, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med PCR-forhold i henhold til manuell levert av selskapet: 95 ° C i 10 min; 40x sykluser ved 94 ° C i 30 s og 55 ° C i 1 minutt (rampehastighet 2 ° C /sek); og 98 ° C i 10 min.
Hver PCR-reaksjon inneholdt 50 ng DNA, og de små dråper ble fremstilt i en QX100 dråpegeneratoren (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Det endelige PCR-produkt ble oppdaget i en QX200 dråpeleser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) og resultatet analysert med QuantaSoft programvare, versjon 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
CpG øy methylator fenotypen (CIMP) status
Tumor CIMP status ble bestemt ved den metode MethyLight med primer og probe-sekvenser som er tidligere beskrevet [19], [20]. For de åtte gener i CIMP panelet (
CDKN2A
,
MLH1
,
CACNA1G
,
NEUROG1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
IGF2
og
CRABP1
) [20] prosenten av metylert referanse (PMR) ble beregnet, hvor PMR 10 ble betraktet som positiv [19]. Svulster ble klassifisert som CIMP negativ (ingen promoter hypermethylation), CIMP lav (en til fem gener denaturert) eller CIMP høy (seks til åtte gener denaturert) [20].
mikro ustabilitet (MSI) screening status
Mismatch reparasjons proteiner ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi, som tidligere beskrevet [20]. Kort, formalinfiksert og parafininnebygd CRC vev ble undersøkt for uttrykk av fire mismatch reparasjon proteiner (MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2). En prøve vurdert å ha en positiv MSI filtrering status manglet nukleær farging i tumorceller for minst ett av proteinene, og er referert til som MSI. En negativ MSI screening status hadde uttrykk av alle fire gener og ble omtalt som mikro stabil (MSS).
BRAF
V600E mutasjonsstatus
Taqman alleliske diskriminering assay, beskrevet i detalj andre steder [17], ble brukt for påvisning av
BRAF
V600E
mutasjon (reagenser fra Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige).
KRAS sekvense
mutasjonsanalyse av
KRAS
har blitt forklart andre steder [21]. . Sekvenseringen ble utført med Big Dye v 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og primere som ble brukt var: fremover: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 «og omvendt: 5′-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3».
Resultater
SOX2 uttrykk i CRC korrelerer med svulst klasse, TNM stadium og
BRAF
mutasjon
Nuclear SOX2 uttrykk i tumorceller ble evaluert i 441 CRC pasientprøver av immunhistokjemi, hvor ekspresjon ble vurdert som positiv eller negativ (figur 1). I de positive tilfeller ble SOX2 uttrykk aldri sett i hele tumoren, men positive kjerner ble funnet på begrensede deler. Sporadisk stromal eller cytoplasma farging ble ikke evaluert. 47 (10,7%) av CRC prøvene viste tumorceller som uttrykker SOX2 og uttrykket i forhold til ulike clinicopathological egenskaper er vist i tabell 1. I vår pasient kohort, SOX2 ekspresjon ble funnet å være signifikant assosiert med en høy grad av tumor (
p
= 0,004) og TNM stadium (
p
= 0,034). SOX2 uttrykk ble også sterkt korrelert til
BRAF
mutasjon (
p
0,001), men overraskende ingen sammenheng til
KRAS
mutasjoner kan bli sett (
p
= 0,928).
(A) Negativ kjerne SOX2 flekker i en moderat differensiert CRC. (B) Positiv atom SOX2 flekker i et dårlig differensiert CRC.
SOX2 uttrykk er korrelert til en dårlig pasient overlevelse
Kreft spesifikk overlevelse analyser viste at pasienter med SOX2 positive tumorer hadde en dårligere prognose enn pasienter med SOX2 negative tumorer (figur 2a). Denne foreningen ble enda sterkere da bare
BRAF
muterte tumorer ble analysert (figur 2b), mens ingen forskjell på SOX2 uttrykk på overlevelse ble sett i
BRAF
villtype tumorer (figur 3c). SOX2 uttrykk ikke har noen effekt på pasientens prognose i
KRAS
muterte tumorer (
p
= 0,676). I en multivariat Cox proporsjonal risikomodell inkludert alder, kjønn,
BRAF
mutasjon, og SOX2 uttrykk, dårlig prognose for pasienter med SOX2 uttrykk versus ingen SOX2 uttrykk beholdes statistisk signifikant (hazard ratio (HR) = 1,64, 95 % KI 1,04 til 2,58,
p
= 0,032). Når ytterligere justering for stadium i multivariat analyse ble den prognostiske betydningen av SOX2 uttrykk tapt (HR = 1,04, 95% KI 0,65 til 1,67,
p
= 0,878), med vekt på scenen avhengighet.
Synlig er Kaplan-Meier plott av kreftspesifikk overlevelse i (A) alle CRC-pasienter, (B)
BRAF
V600E
muterte CRC pasienter eller (C)
BRAF
villtype CRC pasienter.
(A) Caco2 celler, Caco2-celler som stabilt uttrykker
BRAF
mutasjon (Caco2-BRAF
V600E) og Caco2-celler som stabilt uttrykker
KRAS
mutasjon (Caco2-KRAS
G12V). SOX2 ekspresjon i Caco2 ble satt til 1. (B) Caco2 etter dyrking med MEK-inhibitor, 24 eller 48 timer eller DMSO i 48 timer som kontroll. SOX2 ekspresjon i Caco2 behandlet med DMSO ble satt til 1. (C) Caco2-BRAF
V600E etter dyrking med MEK-inhibitor, 24 eller 48 timer eller DMSO i 48 timer som kontroll. SOX2 uttrykk i Caco2-BRAF
V600E behandlet med DMSO ble satt som 1. PD: PD98059 (MEK-inhibitor), *
p
0,05, **
p
0.01, ***
p
0,001, ns: ikke-signifikant
p
-verdi
SOX2 uttrykk er regulert av BRAF
i. vitro
Som SOX2 uttrykk korrelert med mutert
BRAF
i vår pasient kohort, fortsatte vi å analysere sin molekylære forhold
in vitro
. Barnekonvensjonen cellelinje Caco2, med endogen BRAF og KRAS villtype, ble transfektert med enten BRAF
V600E eller KRAS
G12V for å etablere cellelinjer stabilt uttrykker mutant
BRAF plakater (Caco2-BRAF
V600E, figur S1 A) eller mutant
KRAS plakater (Caco2-KRAS
G12V, figur S1b). Ved RT-PCR-analyser fant vi at Caco2-BRAF
V600E uttrykt omtrent dobbelt så høye SOX2-nivåer sammenlignet med Caco2 (
p
= 0,013), en økning som ikke ble sett i Caco2-KRAS
G12V (figur 3a). Disse resultater, i overensstemmelse med våre data fra pasientmateriale (tabell 1), tyder på at ekspresjon av SOX2 reguleres av mutert BRAF.
BRAF
V600E
mutasjon gjengir BRAF i en konstitutivt aktiv tilstand, stimulere MEK /ERK signalkaskade i fravær av ekstracellulære stimuli [22]. Faktisk, blokkerer BRAF nedstrøms signal i Caco2-BRAF
V600E celler ved hjelp av MEK-inhibitor PD98059, resulterte i en redusert uttrykk for SOX2 (figur 3c), noe som tyder på at det er i hovedsak godt karakterisert MEK aktivering aktivitet av BRAF som regulerer SOX2 . Videre de lave endogene nivåer av SOX2 i Caco2 celler ble også redusert med MEK-inhibitor (figur 3b), noe som tyder på at BRAF å svare på endogene aktiveringssignaler også regulerer SOX2 uttrykk. Sammen disse resultatene støtte rolle BRAF som et oppstrøms regulator av SOX2 uttrykk.
Primær SOX2 positiv CRC har SOX2 positiv tilsvarende levermetastaser
Gitt det faktum at SOX2 uttrykk er korrelert til en dårligere pasient prognose, ønsket vi å studere SOX2 uttrykk i primære svulster samt tilhørende fjernmetastaser. For dette ble 13 pasienter med arkiv vev fra både primære kolorektal adenokarsinom og fjernt levermetastaser inkludert i studien og kjernekraft SOX2 uttrykk ble evaluert i epitelceller. To av de 13 primære tumorene var SOX2 positive, mens de andre elleve tumorene var SOX2 negativ. Interessant, SOX2 positive primære svulster var også SOX2 positive i tilsvarende levermetastaser, mens SOX2 negative tumorer hadde SOX2 negativ levermetastaser (tabell 2). Verdt å merke seg, disse SOX2 positiv metastaser var morfologisk mer like tumor avdelinger har SOX2 positive kjerner enn resten av primærtumor (data ikke vist).
SOX2 forbedre uttrykk for FGFR1
deregulering av fibroblast vekstfaktorreseptorer (FGFRs) er sett i CRC så vel som i andre kreft [23], [24]. Siden det har blitt foreslått at SOX2 regulere ekspresjonen av FGFR3 [7], vi ønsket å undersøke om SOX2 endret ekspresjon av FGFRs i
in vitro
system.
En cellelinje som overuttrykker SOX2 ble etablert ved trans CRC cellelinje Caco2 med SOX2 (Caco2-SOX2, Figur S2). Ekspresjon av FGFR1-4 ble analysert ved RT-PCR i Caco2-celler og Caco2-celler SOX2. FGFR1 uttrykk ble funnet å være dobbelt så høy i Caco2-SOX2 som i Caco2 (
p
= 0,036), mens ingen signifikante forskjeller ble sett om FGFR2, FGFR3 eller FGFR4 (figur 4).
Expression of FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4 ved RT-PCR-analyse i Caco2 celler og Caco2 celler som stabilt overuttrykker SOX2 (Caco2-SOX2). Uttrykket i Caco2 ble satt som 1. *
p
0,05, ns. Ikke-signifikant
p
-verdi
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi SOX2 ekspresjon i CRC i korrelasjon til flere clinicopathological og molekyl variabler og dens virkning på pasientens prognose. 11% av svulstene var SOX2 positive, og uttrykket korrelert til svulst klasse, TNM stadium og
BRAF
mutasjon. I tillegg fant vi at SOX2 uttrykk spådd en dårligere pasient prognose i en scene avhengig måte, særlig i
BRAF
muterte tilfeller. Til slutt, introduserer vi SOX2 som mulig regulator av FGFR1 uttrykk.
På grunn av den angivelige involvering av SOX2 i CRC tumorigenesis [25] vi ønsket å studere uttrykket av SOX2 i våre pasient kohort crums. Vi fant at 11% av svulstene uttrykt SOX2 og ved å sammenligne uttrykket til forskjellige clinicopathological egenskaper vi kunne se at SOX2 uttrykk ble korrelert til dårlig differensierte tumorer (høy klasse). Dette passer med den visshet om at SOX2 er en kjent stamcelle markør, og har blitt foreslått å bli uttrykt i kreftstamceller [5], [26]. Som SOX2 ofte ble uttrykt i en begrenset del av tumoren, spekulere vi at disse cellene kan representere kreftstamcelle nisje i disse spesielle tumorer. Vi fant videre at SOX2 ekspresjon ble korrelert til dårlig prognose pasient i en scene avhengig måte, noe som er konsistent med noen tidligere studier [6], [27], [28].
SOX2 har blitt beskrevet av andre til å forbedre trekkfugl og invasiv effekten av CRC celler [6], [7] som brønner som andre kreftcelletyper [29] – [31], noe som innebærer at SOX2 uttrykke celler kan huse en høyere metastatisk kapasitet. I CRC har det også blitt foreslått at ekspresjon av SOX2 kan forutsi tumormetastase [6]. Men ingen studier eksisterer i dag av SOX2 uttrykk i tumormetastaser. Her har vi vist at tilsvarende levermetastaser til SOX2 positive primære svulster også havn SOX2 positive tumorceller. Selv om disse pasient vevsprøver var svært få, likevel indikerer det at SOX2 positive celler er mer sannsynlig å migrere. Det ville selvsagt være både interessant og nødvendig å studere dette i et større pasientmateriale for verifisering. Det faktum at SOX2 positive celler kun gjort opp en liten del av hele tumoren, antyder at disse cellene kan vise en mer invasive fenotype enn de omkringliggende tumorceller. Et annet underlag som viser en mer invasive oppførsel av SOX2 positive tumorceller er at de metastaser var morfologisk mer lik de deler av tumoren med SOX2 positive kjerner. Selv om den morfologiske sammenligning mellom primærsvulster og metastaser kan bare bli studert i to tilfeller foretrekkes det sannsynlig at det kan reflektere spesifikke celler som faktisk gir opphav til fjerntliggende metastaser.
SOX2 ekspresjon ble korrelert til
BRAF
mutasjon i vår vev årsklasse, men ingen sammenheng kan sees mellom SOX2 uttrykk og
KRAS
mutasjoner. Vår
in vitro
finne at et økt SOX2 uttrykk ble sett i celler som uttrykker BRAF
V600E mutasjon, men ikke KRAS
G12V mutasjon, bekrefter denne sammenhengen. RAS /RAF /MAP kinase kaskade er en vei som er innblandet i mange viktige cellulære funksjoner som cellevekst, deling og differensiering [32], og dens inkludert proteiner er ofte mutert i CRC. Av alle CRC, er 30-40% mutert i
KRAS
genet og 5-15% i
BRAF
genet [21], [33]. Disse to mutasjoner antas å være gjensidig utelukkende i CRC [21], [34], og de er begge forbundet med dårlig prognose pasient [21], [35] – [37]. Selv om de er involvert i samme vei, kan vi se at
KRAS Hotell og
BRAF
muterte CRC har ulike morfologiske opptredener. Det er interessant å spekulere i at foreningen av
BRAF
mutasjon med SOX2 uttrykk kan forklare en del av den morfologiske forskjellen. Vi fortsatte å analysere korrelasjonen av BRAF og SOX2 uttrykk i vår
in vitro
cellekultur system. Faktisk ble SOX2 uttrykk funnet å være oppregulert i celler som uttrykker konstitutivt aktiv BRAF
V600E. Videre, ved å blokkere BRAF nedstrøms signalering, endogen SOX2 samt SOX2 ekspresjon indusert ved BRAF
V600E ble redusert, noe som viser at SOX2 uttrykk er i det minste delvis reguleres av godt karakterisert BRAF /MEK pathway. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser at SOX2 uttrykk er regulert av BRAF signalering. Et annet interessant funn var at den negative prognostiske effekten av SOX2 uttrykk var begrenset til
BRAF
muterte pasienter, noe som indikerer at det er SOX2 uttrykk i kombinasjon med
BRAF
mutasjon som for det meste bidrar til dårlig prognose .
Det er vel kjent at avvikende ekspresjon av fibroblast-vekstfaktorreseptorer (FGFRs) kan kjøre tumorprogresjon [23], [24]. Den FGFR familien består av fire gener, og det har vist seg at i det minste
FGFR3
-genet reguleres ved SOX2 i CRC [7]. Vår cellelinje overekspresjon SOX2, Caco2-SOX2, hadde dobbelt så høy FGFR1 uttrykk som Caco2 celler, noe som tyder på at FGFR1 uttrykk kan være regulert av SOX2. Andre har vist at overekspresjon av FGFR1 finnes i CRC [38], og at det er korrelert til levermetastaser [39]. En fersk studie har også foreslått at forhøyet uttrykk for både SOX2 og FGFR1 er korrelert til dårlig prognose i småcellet lungekreft [40]. Sammen utgjør disse funnene tyder på at SOX2 dels ved oppregulering av FGFR1 kan forbedre fjernt spredning av tumorceller til leveren, og dermed forårsaker en dårligere pasientens overlevelse. Imidlertid er ytterligere studier for å avdekke den rolle og mekanismen for SOX2 og FGFR1 i CRC.
Som konklusjon, viser denne studie at SOX2 ekspresjon er korrelert med en dårlig prognose i CRC-pasienter, og det identifiserer for første gang at SOX2 uttrykk delvis er regulert av BRAF. Disse funnene i kombinasjon med den observerte korrelasjonen mellom SOX2 positivitet i både primærtumor og tilsvarende metastaser, tyder på at SOX2 positive tumorceller har en forbedret evne til å metastasere.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. .
Vellykket transfeksjon av pMCEF-BRAF
V600E eller pcDNA3-KRAS
G12V inn Caco2 tykktarmskreft cellelinje
doi: 10,1371 /journal.pone.0101957.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Caco2-SOX2 celler har en økt SOX2 uttrykk både mRNA og protein nivå
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101957.s002 product: (PDF)
Takk
forfatterne takker Mrs Kerstin Näslund, Institutt for medisinsk biovitenskap, patologi, Umeå universitet, for hennes dyktige teknisk assistanse og Anna Dahlin for å gjennomføre CIMP status analyser.
