Abstract
Midkine (MDK) er et heparin-bindende vekstfaktor som er sterkt uttrykt i mange ondartede svulster, inkludert lungekreft. MDK aktiverer PI3K reaksjonsveien og induserer anti-apoptotisk aktivitet, i sin tur øke overlevelsen av tumorer. Derfor er inhibering av MDK betraktet som en potensiell strategi for kreftterapi. I denne studien, viser vi en ny liten molekyl forbindelse (iMDK) som er rettet mot MDK. iMDK hemmet cellevekst av MDK-positive H441 lunge adenokarcinomceller som havn en onkogen
KRAS
mutasjon og H520 squamous celle lungekreftceller, som begge er typer botemiddel lungekreft. Imidlertid iMDK ikke redusere cellenes levedyktighet av MDK-negative A549 lunge adenokarsinom celler eller normale humane lungefibroblaster (NHLF) celler som indikerer dets spesifisitet. iMDK trykkes den endogene ekspresjon av MDK, men ikke for andre vekstfaktorer slik som PTN eller VEGF. iMDK undertrykkes veksten av H441-celler ved å hemme PI3K reaksjonsveien og å indusere apoptose. Systemisk administrasjon av iMDK betydelig hemmet tumorvekst i en xenograft mus modell
in vivo
. Inhibering av MDK med iMDK gir en potensiell terapeutisk tilnærming for behandling av lungekreft som er drevet av MDK
relasjon:. Hao H, Maeda Y, Fukazawa T, Yamatsuji T, Takaoka M, Bao XH, m.fl. . (2013) Hemming av Growth Factor MDK /Midkine av en nye små molekyl Forbindelse til behandling av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE åtte (8): e71093. doi: 10,1371 /journal.pone.0071093
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 23. mars 2013, Godkjent: 25 juni 2013; Publisert: 16 august 2013
Copyright: © 2013 Hao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd til JAW (https://report.nih.gov/index.aspx, stipend nummer: HL095580, HL108907, HL110964), departementet for utdanning, vitenskap og kultur, Japan, å YN (https://www.jsps.go.jp/english/index.html, gi nummer~~POS=HEADCOMP: 23591950) og University of Cincinnati Postdoktor Research Program til YM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dr. MN er en ansatt i et kommersielt selskap «SBI Pharmaceuticals Co, Ltd «. Men SBI Pharmaceuticals Co Ltd ikke finansiere denne studien og det er ingen patenter, produkter i utvikling eller markedsført produkter erklære. Sysselsetting av SBI Pharmaceuticals Co, ikke Ltd ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1,2]. Konvensjonelle kjemoterapeutiske regimer målrette lungekreftceller, men også normale prolifererende celler. For tiden overlevelse etter konvensjonell kjemoterapi av lunge adenokarsinom (den hyppigste typen lungekreft) gir mindre enn ett års median overlevelse fra diagnosetidspunktet [3]. Molekylære pathway-spesifikk behandling for lunge adenokarsinom, f.eks, målretting mutant
EGFR
eller
ALK
fusjoner, begrense ikke-tumor giftighet og forlenge overlevelsestiden i forhold til konvensjonell kjemoterapi [4] – [6 ]. Men det er ingen molekylært målrettet terapi for mutant
KRAS
-driven lunge adenokarsinom, den hyppigste typen lunge adenokarsinom i den kaukasiske befolkningen. Dessuten har effektive molekylært målrettet terapi er utviklet for adenokarsinomer, men ikke plateepitelkarsinom. Derfor er spesifikke behandlinger som er rettet mot ulike lunge krefttyper desperat behov [7] -. [9]
Midkine (MDK) er et heparin-bindende vekstfaktor som er sterkt uttrykt i mange ondartede svulster, inkludert lunge, esophageal, mage, tykktarm, hepatocellulær, bryst, nyre og bukspyttkjertel carcinoma [10] – [15]. MDK binder seg til flere membranreseptorer, ALK, syndecans, PTP og LRP, og deretter aktiverer PI3 kinase (PI3K) og MAP kinase veier. Disse to banene indusere celleproliferasjon og forbedre angiogene og anti-apoptotiske aktivitet [16], [17]. Inhibering av
MDK
av siRNA hemmer cellevekst av kreftceller som uttrykker MDK [18], noe som indikerer at MDK kan være et potensielt mål for lungecancerterapi. Siden mus som mangler
Mdk
genet er levedyktig [19], målretting MDK er et attraktivt terapeutisk tilnærming siden hemming er usannsynlig å ha systemiske skadelige effekter. Erkjennelsen av potensialet rolle MDK veien i behandling av kreft har økt innsats for å identifisere MDK hemmere. Matsui et al. identifiserte syntetiske peptider og forbindelser som hemmer MDK-mediert celle migrasjon
in vitro
; men disse viste seg ikke å være potente og mangler klinisk anvendelse [20].
I den foreliggende undersøkelse har vi identifisert en lavmolekylær forbindelse (iMDK) at undertrykket endogen MDK uttrykk. iMDK hemmet veksten av MDK-uttrykke H441 lunge adenokarcinomceller som havn en onkogen
KRAS
mutasjon og H520 plateepitel lungekreft celler
in vitro
. Videre iMDK undertrykket tumorvekst lunge og indusert celledød ved å inhibere PI3 kinase pathway og indusering av apoptose i en xenograft musemodell utledet fra H441 lunge adenokarsinomceller. Målrette uttrykk for MDK gir en ny terapeutisk tilnærming for behandling av MDK-uttrykke ikke-småcellet lungekreft.
Materialer og metoder
Reagenser
3- [2 – (4-fluorbenzyl) imidazo [2,1-p] [1], [3] tiazol-6-yl] -2H-kromen-2-on (heretter iMDK) innkjøpt fra ChemDiv (San Diego, CA) ble løst i DMSO. PD0325901 (en MEK hemmer) ble hentet fra signalinginhibitors.com (Wedel, Schleswig Holstein, Tyskland).
Cellelinjer og kultur betingelser
Den menneskelige lunge adenokarcinomceller H322, H358, H441 og A549 og human lunge plateepitelkarsinom celler H520 ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og dyrket i RPMI 1640 (H322, H358, H520) eller høyt blodsukker Dulbeccos modifiserte Eagle medium (H441, A549 celler) supplert med 10 % varme-inaktivert føtalt bovint serum. De menneskelige ondartet mesothelioma celler ACC-MESO-1 (MESO-1) oppnådd fra JCRB Cell Bank (Osaka, Japan) og human lunge plateepitelkarsinom celler SQ5 vennlig levert fra Dr. Kiura Katsuyuki (Institutt for hematologi, onkologi, og Respiratory Medicine, Okayama Universitetet Graduate School of Medicine, odontologi, og Pharmaceutical Sciences, Okayama, Japan) [21] ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum. Den normale humane lungefibroblaster NHLF celler oppnådd fra Clonetics (San Diego, CA) ble dyrket i høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium. Alle cellelinjer ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C.
immunoblotanalyse
Celler ble lysert i iskald M-PER lysisbuffer kjøpt fra Thermo Fisher Scientific ( Rockford, IL). Cellelysatene ble klaret ved sentrifugering (20 min ved 15000 x g ved 4 ° C) og proteinkonsentrasjonen bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse (Thermo Scientific, Rockford, IL). Like mengder protein ble separert på en SDS-PAGE-gel. Gelen ble overført elektroforetisk til en Hybond PVDF overføringsmembran (GE Healthcare Ltd, Piscataway, NJ) og inkubert med primære og sekundære antistoffer i henhold til den Supersignal
® West Pico kjemiluminescens-protokoll (Pierce, Rockford, IL). Antistoff som er spesifikt for β-aktin-antistoff ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) og antistoff som er spesifikt for humant MDK og PTN (pleiotrofinprotein) ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, UK). Antistoff spesifikt for caspase-3, PI3 kinase P85, fosforylert-PI3K P85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), AKT, fosforylert-AKT (Ser473), ERK1 /2, fosforylert-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38MAPK, fosforylert-p38 MAPK (Thr180 /yr182), Bad, XIAP, survivin ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoff spesifikt for VEGF ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Sekundær pepperrot peroksidase-konjugerte antistoffer ble hentet fra Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).
siRNA hemming av MDK
A. H441-celler ble sådd i en 12-brønns plate ved en tetthet på 1 x 10
5 per brønn og dyrket over natten ved 37 ° C. Dagen etter 100 pmol av to ulike siRNAs rettet mot MDK (D-003677-02-0050 og D-003677-03-0050) eller nontargeting siRNA (Thermo Scientific) ble transfektert ved bruk av 2 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA ) i henhold til produsentens instruksjoner. Inkubasjonstiden for transfeksjon reagenser var 24 timer, ved hvilket tidspunkt mediet ble erstattet med friskt vanlig medium. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon for immunoblottingforsøk og cellevekstmålinger.
Celleviabilitet assay
H441-celler, ble A549-celler, H520-celler, HEK293-celler og NHLF-celler sådd ut i 24-brønners plater ved en tetthet på 1 x 10
5-celler og dyrket ved 37 ° C i 24 timer. Medium ble fjernet ved aspirasjon og erstattet med friskt kulturmedium innehold iMDK oppløst i DMSO (10, 50, 100, 500 nmol /L). DMSO alene ble anvendt som kontroll. Cellene ble behandlet i 48 timer og oppsamlet ved trypsinering. Levedyktige celler ble vurdert av trypanblått eksklusjon og WST-1-analyser (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Quebec, Canada) i henhold til produsentens protokoll. Rekombinant MDK ble kjøpt fra R 0,05 (#) eller p 0,01 (*)
Resultater
Hemming av MDK reduserer levedyktigheten til H441 lunge adenokarcinomceller
For. for å finne en NSCLC cellelinje som er avhengig av MDK for cellevekst, vurderte vi den endogene ekspresjon av MDK protein i fire forskjellige NSCLC-celle l ines og NHLF (Normale humane lungefibroblaster) celler. HEK293 embryonale nyreceller ble benyttet som en positiv kontroll for MDK ekspresjon. Som vist i figur 1A, ble MDK detektert i HEK293 celler, H441 lunge adenokarsinom-celler og H520 human lunge squamous cell carcinoma-celler, men ikke i A549, H322 og H358-lunge adenokarsinomceller, SQ5 lunge squamous cell carcinoma celler eller meso-1 ondartet mesothelioma celler . MDK ble ikke uttrykt i normale NHLF celler. Den H441 cellelinjen er avledet fra et NSCLC lungetumor som har en
KRAS
mutasjon. Aktivert
RAS
er den vanligste mutasjonen assosiert med lunge adenokarsinomer i den kaukasiske befolkningen og effektive behandlinger for denne sykdommen har ennå ikke blitt identifisert [24]. For å bestemme hvorvidt H441-celler er avhengig av MDK for celle-levedyktighet, hemmet vi MDK ved hjelp av siRNA og undersøkt cellevekst i nærvær og fravær av MDK. Som vist i figur 1B, 48 timer etter transfeksjon, to forskjellige MDK sirnas trykkes MDK i H441-celler sammenlignet med ikke-målsøkende siRNA. Veksthemming ble betydelig indusert ved undertrykkelse av MDK (p 0,01; figur 1C). Disse resultatene viser at targeting MDK er en effektiv strategi for å undertrykke cellevekst av MDK-uttrykke ikke-småcellet lungekreft.
MDK ble oppdaget i HEK293 celler, H441 lunge adenokarcinomceller og H520 human lunge plateepitelkarsinom celler men ikke i andre typer celler, inkludert NHLF (Normale humane lungefibroblaster) celler. Proteinekspresjon av MDK og μ-aktin ble bekreftet ved immunoblott som beskrevet i Metoder. A. MDK ble undertrykt av to forskjellige MDK sirnas (MDK siRNA1 og MDK siRNA2) i H441 celler. Proteinekspresjon ble bekreftet ved immunoblott som beskrevet i A. B. Veksthemming i H441-celler etter MDK genet Slå ble betydelig økt. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon analyse som beskrevet i Metoder. Statistisk signifikans ble definert som p. 0,01 (*)
iMDK hemmer endogen MDK uttrykk i H441 lunge adenokarcinomceller
For å finne en terapeutisk forbindelse som hemmer MDK uttrykk, vi først utviklet en MDK reporter cellelinje ved stabilt trans HEK293 celler med en MDK promoter-smeltet luciferase konstruere. Vi brukte denne modifiserte cellelinje for å screene 44.000 forbindelser på Drug Discovery Center ved University of Cincinnati. Påvisning av luciferaseaktivitet ble anvendt for å identifisere inhibitorer MDK. I denne screening, identifiserte vi en forbindelse (3- [2- (4-fluorbenzyl) imidazo [2,1-p] [1], [3] tiazol-6-yl] -2H-kromen-2-on; heretter iMDK, figur 2A) som reproduserbart hemmet endogent MDK protein EXPRE ssion. Vi vurderte effektiviteten av iMDK for sin evne til spesifikt å inhibere ekspresjonen av MDK i H441-celler. Som vist i figur 2B, iMDK hemmet endogent MDK på en doseavhengig måte, men inhiberte ikke PTN (pleiotrofinprotein), som har betydelig homologi med MDK [17]. Heller ikke iMDK hemme en annen vekstfaktor, VEGF, i H441 lunge adenokarcinomceller 48 timer etter behandling.
A. Strukturen av iMDK (3- [2- (4-fluorbenzyl) imidazo [2,1-p] [1], [3] tiazol-6-yl] -2H-kromen-2-on). B. MDK men ikke PTN eller VEGF ble undertrykt av iMDK doseavhengig i H441 celler 48 timer etter behandling. Immunoblot analyse ble utført som beskrevet i Methods.
iMDK hemmer cellelevedyktigheten til MDK-uttrykke ikke-småcellet lungekreft celler
For å kunne fastslå effektiviteten og spesifisiteten iMDK undertrykke MDK-uttrykke tumorceller, behandlet vi begge MDK-positive og MDK-negative celler med iMDK og vurderes celle levedyktighet. MDK er uttrykt i HEK293 embryoniske nyreceller, H441 lunge adenokarsinom-celler og H520 lunge squamous cell carcinoma-celler, men ikke i A549 lunge carcinoma-celler eller ikke-transformert NHLF celler (figur 1A). Disse fem cellelinjer ble behandlet med en rekke iMDK konsentrasjoner (0 til 500 nM) og cellelevedyktigheten ble bestemt 48 timer etter behandling. Veksthemming av iMDK var doseavhengig måte induseres i MDK-positive HEK293, H441 og H520-celler, men ikke den MDK-negative A549-celler eller ikke-transformert NHLF-celler (figur 3A, S1). Morfologisk, veksthemming av H441-celler var doseavhengig observert 48 timer etter behandling med iMDK (figur 3B). Den undertrykkelse av cellevekst ved iMDK ble delvis blokkert ved forbehandling med rekombinant MDK (25 nM) i de MDK-positive H441-celler; imidlertid forbehandling med rekombinant MDK ikke vesentlig endre cellevekst i MDK-negative A549-celler (Figur S2). Dette funn tyder på at den undertrykkende virkning på cellevekst av iMDK er mediert i det minste delvis ved hemning av MDK uttrykk.
B. Veksthemming av iMDK ble øket i den MDK-positive HEK293, H441 og H520-celler, men ikke den MDK-negative A549 celler eller normale NHLF celler etter 48 timers behandling. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon analyse som beskrevet i Metoder. Statistisk signifikans ble definert som p 0,01 (*). Doseavhengig veksthemming av iMDK ble observert morfologisk i H441 lunge adenokarcinomceller. Vist er fase-kontrast photomicrographs av H441 celler 48 timer etter iMDK behandling (skala bar viser 100 mikrometer).
iMDK induserer apoptose i H441 lunge adenokarcinomceller
For å forstå mekanismen hvorved iMDK hemmer veksten av H441-celler, bedømmes vi cellene for apoptose 48 timer etter behandling med iMDK. Som vist i figur 4A, sterkt kondensert og delvis fragmenterte kjerner ble observert i H441-celler, men ikke i normale NHLF celler etter behandling med iMDK, noe som indikerer at iMDK indusert apoptose i MDK-uttrykkende H441-celler. TUNEL-positive celler ble også signifikant økt i H441-celler timer etter iMDK behandling på en doseavhengig måte (figur 4B), noe som ytterligere bekrefter induksjon av apoptose ved iMDK. Som vist på figur 4C, spaltede former av caspase-3, en markør for apoptose indusert ved iMDK selv ved de laveste konsentrasjoner (5 nM) i H441-celler 48 timer etter behandling. sub-G
0 /G
1 DNA innhold av H441-celler var sterkt øket fra 1,24% (DMSO kontroll) til 37,00% (10 nM) og 60,91% (25 nM) 72 timer etter behandling med iMDK. Men sub-G
0G
en DNA innhold av NHLF celler ble minimalt økt fra 0,32% (DMSO kontroll) til 0,52% (10 nM) og 1,51% (25 nM) etter behandling med iMDK (figur 4D) . Samlet indikerer disse resultater at iMDK selektivt induserer apoptose i MDK-uttrykkende H441 lunge adenokarsinom celler, men ikke i normale NHLF celler som ikke uttrykker MDK.
iMDK doseavhengig øket apoptose i H441-celler, men ikke normale celler NHLF . Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av iMDK i 72 timer og deretter farget med Hoechst 33342 fargestoff og analysert under et fluorescens mikroskop som beskrevet i Methods (målestokken viser 50 um). Apoptose ble indusert i H441-celler 48 timer etter iMDK behandling ved en konsentrasjon på 25 nM (øvre panel viser målestokken 200 um). TUNEL-positive celler ble økt med iMDK behandling på en doseavhengig måte (nedre panel). TUNEL-farging ble utført som beskrevet i Metoder. Statistisk signifikans ble definert som p 0,05 (#). A. Spaltet caspase-3, en apoptose markør, ble økt i H441 celler etter iMDK behandling. H441-celler ble behandlet i 48 timer med iMDK i de angitte konsentrasjoner og høsting av immunoblot-analyse, som beskrevet i Metoder. D. iMDK indusert sub-G
0 /G
en DNA-innhold i H441 celler. Celler ble behandlet med iMDK i 72 timer, og DNA-innhold ble målt ved propidiumjodid flekken og flowcytometrisk analyse, som beskrevet i Metoder.
iMDK undertrykker PI3K og induserer de apoptotiske baner i H441 lunge adenokarsinomceller
PI3K er involvert i tumordannelse ved aktivering av AKT, noe som i sin tur øker anti-apoptotiske faktorer, slik som XIAP og survivin, og reduserer en pro-apoptotisk faktor BAD [25] – [27]. Siden MDK aktiverer PI3K-aktivitet [16], [28], søkte vi å bestemme hvorvidt den PI3K reaksjonsveien ble undertrykket ved iMDK-mediert MDK hemming i H441-celler. Fosforylering av PI3K og AKT ble undertrykt ved iMDK i en dose (figur 5A) og tidsavhengig måte (figur 5B), noe som indikerer at PI3K /AKT-reaksjonsveien blir inhibert av iMDK. Anti-apoptotiske faktorer, XIAP og Survivin, ble redusert mens den pro-apoptotiske faktor, BAD, ble indusert ved iMDK i en dose- og tidsavhengig måte (figur 5), noe som indikerer at den apoptotiske reaksjonsvei induseres ved iMDK. MDK er også kjent å aktivere ERK (en MAPK) i normale ikke-tumorigene celler [16], [28]; imidlertid, ERK og p38MAPK ble ikke inhibert av iMDK i H441 lunge adenokarsinom-celler (Figur S3). Disse resultatene indikerer at iMDK undertrykker PI3K /AKT-reaksjonsveien, men ikke den MAPK reaksjonsveien og i sin tur fører til apoptose i H441-celler.
A. Doseavhengig, fosforylering av PI3K og AKT og uttrykk for survivin og XIAP, anti-apoptotiske faktorer, ble redusert mens uttrykk for dårlig, en pro-apoptotiske faktor, ble økt 48 timer etter behandling med iMDK. Vist er immunoblot utført som beskrevet i Metoder. B. tidsavhengig, fosforylering av PI3K og AKT og ekspresjon av Survivin og XIAP ble redusert mens ekspresjon av BAD ble øket ved behandling med iMDK i en konsentrasjon på 50 nM. Immunoblot ble utført som beskrevet i Methods.
iMDK undertrykker tumorvekst lunge og induserer apoptose i en xenograft mus modell
For å avgjøre om systemisk administrasjon av iMDK undertrykker tumorvekst
in vivo
, iMDK (9 mg /kg) ble injisert intraperitonealt enten 3 eller 5 ganger i uken i nakne mus med xenografter avledet fra H441 lunge adenokarcinomceller 14 dager etter tumorinokulasjon. Lung tumorxenotransplantater fortsatte å vokse i kontrollgruppen (DMSO behandlet) gruppe mens lungetumorvekst ble arrestert i iMDK-behandlede grupper. Volumet av tumorene i den iMDK-behandlede gruppen var signifikant lavere enn i kontrollgruppen (figur 6A og 6B). MDK og fosforylert PI3K ble observert i lungesvulster av kontroll mus men ikke i iMDK-behandlede mus (figur 6C), i samsvar med
in vitro
studier (figur 5). DNA-fragmentering påvist ved TUNEL-farging ble indusert i svulster i iMDK-behandlede mus, men ikke i de fra kontrollmus (figur 6D), noe som indikerer at iMDK induserer apoptose
in vivo
også. Spesielt, behandling av iMDK ikke påvirke kroppsvekt og serumnivåer av ASAT og ALAT i mus (figur S4), noe som tyder på at iMDK ikke forårsaker systemisk toksisitet.
A. Volumet av tumorer avledet fra H441 lunge adenokarsinomceller ble redusert etter behandling med iMDK (9 mg /kg) i en xenograft musemodell. DMSO ble benyttet i kontrollgruppen. iMDK ble gitt 3 ganger /uke eller 5 ganger /uke som vist. Åtte mus ble benyttet i hver gruppe. Tumor volum ble overvåket hver dag etter inokulering av H441 celler. Tumorvekst er uttrykt som gjennomsnittlig tumorvolum; stolper representerer SD. Statistisk signifikans ble definert som p 0,01 (*). B. Det er vist et bilde av xenograft tumorer avledet fra H441-celler, som blir dissekert fra de xenograft mus 10 dager etter behandling med iMDK. Uttrykk for MDK og fosforylering av PI3K (pPI3K) ble redusert med iMDK behandling i xenografttumorer. Ekspresjon av en angiogenese markør CD31 /PECAM-1 ble inhibert av iMDK skjønt ekspresjon av en angiogenese-vekstfaktor VEGF ikke ble endret. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av de xenograft tumorsnitt som beskrevet i metodene. Kontroll er fra DMSO administrerte gruppe. (Skala bar viser 100 mikrometer). iMDK indusert apoptose
in vivo
. TUNEL farging med xenografttumorer behandlet DMSO (kontroll) eller iMDK ble utført som beskrevet i Methods (skala bar viser 200 mikrometer).
Siden MDK er kjent for å indusere angiogenese [29], vi søkte om hemming av angiogenese ved iMDK kan delvis bidra til reduksjon av lungesvulster
in vivo
. Som vist i figur 6C, ekspresjonen av VEGF, en angiogenese-vekstfaktor [30], ble ikke endret, i samsvar med
in vitro
studie (figur 2); imidlertid ekspresjon av CD31 /PECAM-1, en angiogenese markør [30], ble redusert i lungesvulster behandlet ved iMDK, noe som indikerer at iMDK hemmer angiogenese uavhengig av VEGF og i sin tur undertrykker lunge tumorigenesis
in vivo
. Disse
in vivo
Resultatene indikerer at iMDK er sannsynlig å være et lovende terapeutisk anti-tumorigen /angiogen legemiddelmålretting MDK-uttrykke lungekreft uten bivirkninger.
Diskusjoner
suksessen til små molekyler spesifikt inhiberer EGFR funksjon i mutant
EGFR
-driven lungeadenokarsinom har fremmet molekyl målrettet terapi for lungekreft [4], [5], [31], [32]. På den annen side er rettet behandlinger for mutant
KRAS
-driven lunge adenokarsinom og lunge-skvamøs celle carcinoma er ikke blitt utviklet annet enn kjemoterapi som er rettet mot både kreftceller og normale prolifererende celler [7] – [9]. I denne studien har vi identifisert et lite molekyl sammensatt iMDK som hemmer uttrykk for MDK, en svulst fremmende vekstfaktor. iMDK hemmet PI3K /AKT sti og undertrykte
KRAS
-mutated lunge adenokarsinom ved å indusere apoptose
in vitro Hotell og
in vivo
. iMDK svekket ikke levedyktighet av normale prolifererende NHLF celler. Videre ble ingen åpenbar systemisk toksisitet observert i iMDK-behandlede mus, støtter den potensielle nytten av iMDK for behandling av MDK-avhengige lunge adenokarsinom.
MDK er kjent for å aktivere ikke bare PI3K /AKT sti, men også MAPK veien i primær neuronal kultur [16] og myokard [28]; imidlertid, i vårt studium iMDK inhibert bare den PI3K pathway men ikke MAPK-reaksjonsveien, og faktisk aktiverte MAPK-reaksjonsveien i H441 lunge adenokarsinom-celler (Figur S3). Den mekanisme ved hvilken iMDK inhiberer bare den PI3K vei, men ikke den MAPK-reaksjonsveien er ukjent. Den oppregulering av MAPK-reaksjonsveien kan være kompenserende aktivering ved nedregulering av den PI3K reaksjonsveien i H441-celler. Behandlingen av H441-celler med MAPK-inhibitor (PD0325901) eller PI3K /AKT-inhibitor (LY294002) ikke påvirker ekspresjonen av MDK (fig S5 og data ikke vist), noe som tyder på at suppresjon av MDK ved iMDK ikke er mediert gjennom MAPK og PI3K /AKT trasé.
Siden MDK er sterkt uttrykt i hepatocellulært, mage, colorectal og prostata kreft [17], kan MDK inhibitor iMDK være nyttig for behandling av ikke-lungesvulster også. Dessuten er MDK uttrykk forbundet med forskjellige inflammatoriske sykdommer, innbefattet reumatoid artritt og aterosklerose [19], [33].
Mdk
Knockout-mus er resistente mot utviklingen av reumatoid artritt ved å forhindre inflammatorisk leukocytt migrering og differensiering av osteoklastene [33]. Knockout-mus er også motstandsdyktig mot neointimal dannelse et felles trekk ved aterosklerose og restenose [34]. Disse resultatene antyder at iMDK kan være nyttig for behandling av disse ikke-tumorigene sykdommer i tillegg.
I tillegg til iMDK, vi identifisert en annen lite molekyl forbindelse som også undertrykket ekspresjon av MDK. Den andre forbindelse har en Cl i stedet for F i strukturen av iMDK molekylet og utøver lignende doseeffekt til iMDK (data ikke vist), noe som indikerer at iMDK kan bli strukturelt modifisert til å bli mer effektiv og trygg. Siden graden av inhibering av
MDK
RNA var mindre enn den for MDK protein (data ikke vist), kan iMDK målrette MDK protein direkte. Biotin-merket iMDK eller radioisotop-merket iMDK vil bli pålagt å identifisere molekyler eller faktorer som direkte forbinder med iMDK, noe som vil føre til forståelsen av mekanismen (e) der iMDK hemmer uttrykk for MDK.
Oppsummert har vi fastslått at MDK inhibitor iMDK undertrykker ikke-småcellet lungekreft uttrykker MDK
in vitro Hotell og
in vivo
uten å skade normale celler. Selv om flere studier er nødvendig, inkludert identifisering av iMDK direkte mål, ekstra strukturell endring og sikkerhet validering, ser iMDK å være en lovende behandling for
KRAS
mutant lunge adenokarsinom og plateepitelkarsinom og muligens for behandling av andre kreftformer og kroniske betennelsessykdommer.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Vekst hemming iMDK ble økt i MDK-uttrykke celler. iMDK indusert veksthemming i MDK-positive H441 lunge carcinoma celler og HEK293 embryoniske nyreceller, men ikke i MDK-negative A549 lunge carcinoma celler.
