Abstract
Som en medlem av G-protein-koblede P2Y reseptorer, P2Y2 reseptoren kan være like aktiveres av ekstracellulært ATP og UTP. Våre tidligere studier har vist at aktivering av P2Y2 reseptoren av ekstracellulært ATP kan fremme prostata kreft celle invasjon og metastase
in vitro Hotell og
in vivo
via regulerer uttrykk for noen epitel-mesenchymale overgang /invasjon -relaterte gener (inkludert IL-8, E-cadherin, sneglen og claudin-1), og den største endringen i ekspresjon av IL-8 ble observert etter P2Y2 reseptoraktivering. Imidlertid signalveien nedstrøms for P2Y2 reseptoren og rollen til IL-8 i P2Y2-mediert prostatakreft celle invasjon uklare. Her fant vi at ekstracellulært ATP /UTP indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2. Etter knockdown av P2Y2 reseptoren, ATP-stimulert fosforylering av EGFR og ERK1 /2 ble signifikant undertrykt. Ytterligere eksperimenter har vist at inaktivering av EGFR og ERK1 /2 attenuert ATP-indusert invasjon og migrering, og undertrykket ATP-mediert IL-8 produksjon. I tillegg knockdown av IL-8 hemmet ATP-mediert invasjon og migrering av prostatacancerceller. Disse funnene tyder på at P2Y2 reseptoren og EGFR samarbeide for å oppregulere IL-8 produksjon via ERK1 /2 vei, og dermed fremme prostata kreft celle invasjon og migrasjon. Dermed blokkering av P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway kan gi effektive terapeutiske intervensjoner for prostatakreft
Citation. Li WH, Qiu Y, Zhang HQ, Tian XX, Fang WG (2015) P2Y2 Receptor og EGFR samarbeide for å fremme Prostate Cancer Cell Invasion via ERK1 /2 Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0133165. doi: 10,1371 /journal.pone.0133165
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 21 mars 2015; Godkjent: 23 juni 2015; Publisert: 16.07.2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til WGF fra National Natural Science Foundation of China (81321003) og 973 Program (2010CB529402) fra departementet for vitenskap og teknologi i Kina
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste kreftformen hos mannlige befolkning [1]. De fleste dødsfall relatert til prostatakreft skyldes invasjon og metastasering. Cell invasjon og metastasering er komplekse prosesser som er regulert av flere signalveier som MAPK, Wnt og Notch veier. Aktivering av disse banene er i hovedsak avhengig av interaksjonen mellom ekstracellulære reseptorer og signalmolekyler [2].
ekstracellulær adenosin-5′-trifosfat (ATP) er en viktig signalmolekyl i vev mikromiljø, som medierer en rekke biologiske funksjoner via aktivering av P2-reseptorer [3]. To underfamilier av P2-reseptorer har være
α i pattedyrceller. En er P2X familie av ligand-gated ionekanal-reseptorer (P2X1-7), og den andre er P2Y familie av G-protein-koblede reseptorer (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14) [4]. Vår tidligere studie vist at aktivering av P2Y reseptorer av ATP forbedret prostata kreft celle invasjon [5]. Vi videre funnet at P2Y2, en foretrukket reseptor for ATP og UTP, bidro til invasjonen og metastasering av prostata kreft celler [6]. Men signalveien (e) nedstrøms P2Y2 reseptor, særlig i prostata kreft progresjon, er fortsatt ikke klart.
Som medlem av CXC chemokin familien, IL-8 uttrykket er lav i normalt vev og kan bli indusert ved en rekke stimuli, slik som vekstfaktorer og inflammatoriske cytokiner i patologiske tilstander [7]. Ekspresjonen av IL-8 er ofte forhøyet i humane tumorceller og vev [8]. Det er rapportert at IL-8 fungerer som en viktig regulerende faktor i svulstens mikromiljø, og spiller en avgjørende rolle i tumorinvasjon og metastase [9]. Vi har tidligere funnet at aktivering av P2Y2 reseptoren oppregulert ekspresjon og sekresjon av IL-8 [6]. Imidlertid er funksjonen av IL-8 i P2Y2 reseptor-promo invasjon av prostata kreftceller er ukjent. Denne studien hadde som mål å undersøke signalveien (e) nedstrøms P2Y2 reseptoren, og for å undersøke hvilken rolle IL-8 i P2Y2 reseptor-forfremmet prostata kreft celle invasjon.
Materialer og metoder
kjemikalier og antistoffer
ATP (adenosin 5′-trifosfat), UTP (uridin 5′-trifosfat), AG1478 (EGFR-hemmer) og U0126 (MEK1 /2-hemmer) ble alle kjøpt fra Sigma (St Louis, MO , USA). ATP og UTP ble begge oppløst i normalt saltvann og ble brukt ved konsentrasjonen av 100 uM. AG1478 ble oppløst i DMSO og ble brukt ved konsentrasjonen av 100 nM. U0126 ble oppløst i DMSO og anvendt ved en konsentrasjon på 10 uM. Antistoffene P2Y2 (kanin polyklonale antistoff, sc-20124), β-aktin (mus monoklonalt antistoff, sc-8432), ERK1 /2 (kanin polyklonale antistoff, sc-94) og EGFR (mus monoklonalt antistoff, sc-373746) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffene fosfo-EGFR (kanin-monoklonalt antistoff, # 8543, Tyr-1068) og fosfo-ERK1 /2 (kanin-polyklonalt antistoff, # 9101, Thr202 /Tyr204) ble anskaffet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kulturforhold
To subkloner 1E8 og 2B4 ble avledet fra PC-3M menneskelige prostata carcinom cellelinje, som tidligere ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) . Den 1E8 cellelinjen var svært metastatisk, mens den 2B4-cellelinjen var ikke-metastaserende [10]. DU-145 cellelinje ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum, og opprettholdt i en vannmettet atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2.
Revers transkripsjon og real-time PCR
Celler ble dyrket i monolag med eller uten ATP behandling. Total RNA ble isolert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) for å oppnå cDNA, i henhold til produsentens retningslinjer. Deretter ble real-time PCR utført med primerne for IL-8 (sense: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 «, antisense: 5′- AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′) eller β-aktin (sense: 5»- GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3 « ; antisense: 5»-CGATCCACACGGAGTACTTG-3 «). The real-time PCR reaksjonen ble utført på en ABI StepOne Real-Time PCR System (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i tre paralleller. 20 pl reaksjonsblanding besto av 2 pl cDNA (20 ng /ul), 100 nM av primerene og 10 ul av SYBR grønn real-time PCR Master Mix (Toyobo, Japan) som inneholder gull AmpliTaq DNA-polymerase. Prøvene ble først denaturert ved 95 ° C i 10 minutter og deretter PCR-reaksjonen ble fortsatte i 40 amplifiseringscykluser som følger: 15 s ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Da en dissosiasjonskurve analyse ble utført og smeltetemperaturer (Tm) av de dannede PCR-amplikoner ble observert å skille de amplifiserte sekvensene av interesse fra ikke-spesifikk seg eller primer dimmere. Ekspresjonen av IL-8 ble normalisert ved β-aktin. De 2 –
ΔΔCt metoden ble brukt for relativ kvantifisering som tidligere beskrevet [11, 12]
Cell lyse og Western blotting
Celler ble skylt to ganger med iskald PBS og lysert. i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 4 mM EDTA, 0,5% NP-40, 20 mM β-glyserofosfat, 1 mM NaF med proteasehemmere (Roche, Mannheim, Tyskland). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en BCA protein assay kit (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina). Like mengder av totalt protein ble lastet og separert ved SDS-PAGE-gel, og deretter ble overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Etter blokkering med 5% BSA ved romtemperatur i 1 time, ble blottene probet med primære antistoffer mot P2Y2 (1: 500), β-aktin (1: 1000), EGFR (1: 500), ERK1 /2 (1: 1000 ), fosfo-EGFR (1: 1000) eller fosfo-ERK1 /2 (1: 1000) ved 4 ° C over natten. Deretter Blottene ble vasket med PBS tre ganger og inkubert med sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. De immunreaktive bånd ble visualisert ved en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Applygen Technologies Inc), og kvantifisert med programvaren for Kvantum One (Bio-Rad).
siRNA og transfeksjon
To P2Y2 sirnas ( P2Y2 si # 1 og P2Y2 si # 2) og en styre siRNA (negativ) ble anvendt som tidligere beskrevet [6]. To IL-8 sirnas (IL-8 si # 1 og IL-8 si # 2) ble brukt til å slå av ekspresjon av IL-8. IL-8 sirnas ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) med sekvensen som følger:
IL-8 si # 1, 5′-GAACTTAGATGTCAGTGCATA-3 «,
IL -8 si # 2, 5′-GCCAAGGAGUGCUAAAGAA-3 «.
A fluorescens-merkede siRNA oligonukleotid ble anvendt for direkte å observere siRNA transfeksjonseffektivitet, og en krafse siRNA oligonukleotid ble anvendt som kontroll siRNA (negativ). Celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn. Tolv timer senere ble cellene transfektert med sirnas av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Seks timer senere ble mediet erstattet med friskt 1640-medium supplert med 10% FBS. Tyve timer etter transfeksjon, ble cellene splittet. Etter ytterligere 12 timer ble knockdown effektivitet bestemt ved Western-blotting, og celler ble benyttet for de følgende eksperimenter.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Cell supernatanten ble oppsamlet for å måle IL-8 proteinnivå ved hjelp av Quantikine IL-8 ELISA kit (Invitrogen). Prøver ble analysert i duplikat. Avlesninger ble sammenlignet med standardkurven. Deretter ble cellene lysert i lyseringsbuffer og totalproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BCA-analyse. Til slutt ble den relative konsentrasjonen av IL-8-protein i cellesupernatanten bestemmes ved å normalisere til totalt protein av hele celleekstrakt.
Invasion assay
invasjon assay ble utført som beskrevet tidligere [6] . I korthet ble cellene høstet og resuspendert i RPMI 1640 med 0,1% BSA ved en tetthet på 5 x 10
5 celler /ml. Deretter ble 200 ul cellesuspensjoner med eller uten ATP behandling plasseres i det øvre kammer belagt med Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). NIH3T3-kondisjonert medium ble oppnådd ved å inkubere NIH3T3-celler i 24 timer i serumfritt medium 1640 og fylt i det nedre kammer (600 ul) som en chemo-tiltrekningsmiddel, i henhold til metoden beskrevet av Albini et al [13]. Celler ble tillatt å invadere i 12 timer ved 37 ° C. Etter fiksert med 4% formaldehyd, ble celler på den nedre overflate av membranene farget med krystallfiolett og observert under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Antallet invaderte celler i syv områder ble tellet og gjennomsnittet for hvert kammer ble bestemt.
Migration assay
Ett hundre tusen celler i 100 ul av RPMI 1640 supplert med 0,1% BSA ble plassert i det øvre kammer. NIH3T3-kondisjonert medium ble oppnådd ved å inkubere NIH3T3-celler i 24 timer i serumfritt medium 1640 og fylt i det nedre kammer (600 ul) som en chemo-lokkemiddel. Celler ble inkubert i 12 timer ved 37 ° C med eller uten ATP behandling. Deretter celler på den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med krystallfiolett. Antallet migrerte celler ble tellet under et lysmikroskop ved 200 x forstørrelse. Gjennomsnittlig antall migrerte celler ble bestemt ut fra sju representative felt.
Statistiske analyser
De kvantitative resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser og data ble analysert med programvarepakken av SPSS 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Student t test ble brukt for å påvise om det var en signifikant forskjell mellom to grupper. -Parametrisk ANOVA ble brukt når flere grupper ble sammenlignet. Enhver P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
ekstracellulær ATP eller UTP stimulering aktiverer EGFR og ERK1 /2
I denne studien, etter inkubering med 100 uM ATP, vi har oppdaget fosforyleringen av EGFR i 2B4, 1E8 og DU-145-celler ved western blotting ved 2 min, 5 min, 10 min og 15 min. Våre resultater viste at ATP stimulering resulterte i aktivering av EGFR (Tyr-1068) i prostatakreftceller (figur 1A). Lignende resultater ble observert med UTP behandling (figur 1B). Vår tidligere studie viste at ATP kan indusere aktivering av ERK1 /2 i prostatakreft 2B4, 1E8 og DU-145 celler [12]. Her fant vi videre at UTP også stimulert aktivering av ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) i 2B4, 1E8 og DU-145 celler (fig 1c). Blant åtte P2Y undertype-reseptorer som er identifisert i pattedyrceller, kan bare P2Y2 reseptoren være like aktiveres av ATP og UTP [14]. Derfor er disse resultatene indikerer at P2Y2 reseptoren kan være involvert i ekstracellulær ATP /UTP-indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2. De følgende eksperimenter ble utført bare med ATP behandling.
(A) Etter behandling med 100 uM ATP, fosforylering av EGFR ble påvist ved western blotting. (B) Etter behandling med 100 pM UTP, fosforylering av EGFR ble påvist ved western blotting. (C) Etter behandling med 100 pM UTP, fosforylering av ERK1 /2 ble påvist ved western blotting. Resultatene ble demonstrert av histogrammer å kvantifisere uttrykket nivåer. Data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05 vs. kontrollceller
P2Y2 reseptoren formidler aktivering av EGFR og ERK1 /2
Å identifisere hvilken rolle P2Y2 reseptor i ATP-indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2, ble siRNA introdusert til taushet uttrykk for P2Y2 reseptor i 2B4 og 1E8 celler. Fremtredende knockdown effektivitet ble identifisert ved western-blotting (figur 2A). Etter inkubasjon med 100 uM ATP i 5 min, ble fosforyleringen av EGFR og ERK1 /2 undersøkt ved hjelp av Western blotting. Her fant vi at ATP behandling indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2 i kontroll siRNA celler. Etter knockdown av P2Y2 reseptoren, ble aktivering av EGFR og ERK1 /2 indusert av ATP i betydelig grad undertrykkes (Fig 2B og 2C). Sammen utgjør disse data tyder på at ATP-indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2 ble hovedsakelig regulert av P2Y2 reseptoren.
(A) 2B4 og 1E8 celler ble transfektert med to forskjellige P2Y2 sirnas (P2Y2 si # 1 og P2Y2 si # 2) eller et kontroll siRNA (negativ), respektivt. Knockdown effektivitet ble bestemt ved Western blotting. Etter transfeksjon med to forskjellige P2Y2 P2Y2 sirnas (si # 1 og # 2 P2Y2 si) eller et kontroll siRNA (negativ) henholdsvis, ble 2B4 og 1E8 celler inkubert med eller uten 100 uM ATP i 5 min. Deretter proteinet ble ekstrahert for fosforylering deteksjon av (B) EGFR og (C) ERK1 /2. Resultatene ble demonstrert av histogrammer å kvantifisere uttrykket nivåer. Data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P 0,05
EGFR er involvert i ATP-indusert aktivering av ERK1 /2
For å undersøke hvilken rolle EGFR i ATP-indusert aktivering av ERK1 /2, AG1478 (. 100 nM), en selektiv inhibitor av EGFR, ble brukt før ATP behandling. Figur 3 viser at ATP-indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2 i kontrollgruppen (DMSO-behandlede celler), mens forbehandling med AG1478 undertrykte betydelig ATP-indusert fosforylering av EGFR og ERK1 /2, noe som tyder på at ATP aktiverer ERK1 /2 vei gjennom EGFR aktivering.
etter inkubering med 100 nM AG1478 (EGFR inhibitor) i 30 minutter, ble 2B4 og 1E8 celler behandlet med 100 uM ATP i 5 min. Fosforylering av EGFR og ERK1 /2 ble målt ved Western blotting. Resultatene ble demonstrert av histogrammer å kvantifisere uttrykket nivåer. Data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway er involvert i prostata kreft celle invasjon og migrasjon
Neste, for å undersøke om EGFR-ERK1 /2 pathway mediert ATP indusert invasjon og migrasjon, forbehandlet vi 2B4 og 1E8 celler med AG1478 (EGFR-hemmer, 100 nM) og U0126 (MEK1 /2-hemmer, 10 mm) henholdsvis før 100 mikrometer ATP stimulering. Invasion analysen og migrasjon analysen viste at ATP behandling forbedret celle invasjon og migrasjon i kontrollgruppen (DMSO-behandlede celler). Men i AG1478- eller U0126-behandlede grupper, ble ATP-forfremmet celle invasjon og migrasjon hemmet (figur 4A-4C). Siden P2Y2 reseptoren overveiende medierer ATP-indusert aktivering av EGFR og ERK1 /2 som beskrevet ovenfor, og P2Y2 reseptoren er ansvarlig for ATP-stimulert prostatakreft celle invasjon og migrering som vist i vårt tidligere studium [6], resultatene antyder sterkt at P2Y2 -EGFR-ERK1 /2 pathway er involvert i reguleringen av prostatakreft celle invasjon og migrering.
(A) Cellene ble høstet, resuspendert og forbehandlet med AG1478, U0126 eller DMSO i 30 minutter, respektivt. Deretter ble cellene inkubert i Transwell plate med eller uten 100 uM ATP i 12 timer, invaderte /migrerte celler ble farget med krystall-fiolett og observert under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. (B) Effekter av AG1478 og U0126 på invasjonen av 2B4 og 1E8 celler. (C) Effekt av AG1478 og U0126 på migrering av 2B4 og 1E8 celler. Resultatene ble demonstrert av histogrammer, og data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway bidrar til IL-8 oppregulering
Vår tidligere studie har vist at ATP og UTP både stimulert produksjonen av IL- 8, og knockdown av P2Y2 trykkes sekresjonen av IL-8 [6]. Her ble 2B4 og 1E8 celler inkubert med 100 nM AG1478 (EGFR inhibitor) eller 10 uM U0126 (MEK1 /2-inhibitor) henholdsvis før 100 uM ATP stimulering. Ved hjelp av sanntids-PCR og ELISA-analyse, har vi funnet at blokkering av EGFR aktivering attenuerte ATP-promo IL-8-ekspresjon og sekresjon, samtidig blokade av ERK1 /2 aktivisering også hemmet ekspresjon og sekresjon av IL-8 (figur 5A-5D) . Som ATP induserte aktivering av EGFR og ERK1 /2 via P2Y2 reseptoren, sammen med de tidligere resultater som lyddemping av P2Y2 med siRNA undertrykte betydelig ATP-promo IL-8 produksjon [6] Disse data indikerer sterkt at ATP fremmer ekspresjon og sekresjon av IL-8 via P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway.
2B4 og 1E8 celler ble forbehandlet med AG1478, U0126 eller DMSO i 30 minutter, respektivt. Da celler ble inkubert med eller uten 100 uM ATP i 12 timer. (A) og (B) mRNA nivå av IL-8 ble påvist ved sanntids-PCR. (C) og (D) Protein nivå av IL-8 i celle supernatant ble undersøkt ved hjelp av ELISA-analyse. Resultatene ble demonstrert av histogrammer å kvantifisere uttrykket nivåer. Data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
Rolle av IL-8 i ATP-forfremmet celle invasjon og migrasjon
oppregulering av IL-8 uttrykket er assosiert med invasjon og metastasering i prostatakreft [9 ]. Derfor forstummet vi uttrykket av IL-8 i 2B4 og 1E8 celler med siRNA å undersøke rollen som IL-8 i ATP-forfremmet invasjon og migrasjon. To forskjellige IL-8 sirnas ble anvendt, og real-time PCR og ELISA-analyse viste at ekspresjon og sekresjon av IL-8 ble undertrykket etter transfeksjon med IL-8 sirnas (figur 6A og 6B). Vi har også funnet at IL-8 siRNA behandling kunne undertrykke den ATP-mediert økning i IL-8 produksjon (figur 6A og 6B). Dessuten, etter knockdown av IL-8, ATP-stimulert celle invasjon og migrering av prostata kreftceller var sterkt hemmet, noe som tyder på at IL-8 er en av de viktige spillerne i reguleringen av ATP-aktivert celle invasjon og migrering (fig 7A og 7B).
2B4 og 1E8 celler ble transfektert med to forskjellige IL-8 sirnas (IL-8 si # 1 og IL-8 si # 2) eller en kontroll siRNA (negativ), henholdsvis. Celler ble behandlet med eller uten 100 uM ATP i 12 timer. (A) IL-8-mRNA-ekspresjon ble påvist ved sanntids-PCR, og (B) IL-8-sekresjon ble målt ved ELISA-analysen. Resultatene ble demonstrert av histogrammer å kvantifisere uttrykket nivåer. Data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05 vs. Negativ
Etter knockdown av IL-8 ved siNRA, ble cellene behandlet med eller uten 100 uM ATP, og deretter underkastes (A) invasjon assay og (b) migrering analyse. Resultatene ble demonstrert av histogrammer, og data ble presentert som betyr ± SD (loddrette streker). Tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
Diskusjoner
En rekke studier har funnet at i svulstens mikromiljø ekstracellulært ATP og dets derivater kan fungere som skadelige signaler i tumorprogresjon [15, 16]. Vår tidligere studie viste at aktivering av P2Y2 av ekstracellulært ATP fremmer celle invasjon og metastasering av prostata kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo product: [6]. Tilhørighet til G-protein-koblet reseptor (GPCR) underfamilier, har P2Y2 reseptorer blitt rapportert til par med flere intracellulære signalveier [17, 18]. De fleste av disse reaksjonsveier er regulert samtidig av EGFR-aktivering og er involvert i tumorinvasjon og metastase [19]. Imidlertid er det ingen overbevisende bevis så langt at P2Y2 reseptoren fremmer prostatakreft progresjon via EGFR. I denne studien viste at vi EGFR og ERK1 /2 kan begge bli aktivert av ATP eller UTP stimulering. Knockdown av P2Y2 reseptoren trykkes ATP-indusert fosforylering av EGFR og ERK1 /2. I tillegg blokade av EGFR trykkes ATP-regulerte aktivering av ERK1 /2. Videre forsøk viste at aktivering av EGFR-ERK1 /2 pathway økt ATP-forfremmet IL-8 produksjon, som deretter fremmet invasjonen og migrasjon av prostatakreftceller. Sammen med vår tidligere studie at aktivering av P2Y2 reseptoren av ATP fremmer celle invasjon og metastasering av prostata kreft celler, viser denne studien sterkt at P2Y2 reseptoren fremmer prostatakreft celle invasjon og migrasjon hovedsakelig via aktivering av EGFR-ERK1 /2 sti og oppregulering av IL -8 produksjon (fig 8).
Flere veier har blitt identifisert nedstrøms GPCR. Det er flere mulige forklaringer på den pro-invasiv effekt etter P2Y2 reseptor aktivering. En reaksjonsvei er at ATP stimulerer G
qα avhengig fosfolipase C (PLCb) aktivitet, som genererer inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglyserol (DAG), som resulterer i en økning i den intracellulære kalsiumkonsentrasjon og DAG -avhengig aktivering av proteinkinase C (PKC), respektivt. PLCb2 har vist seg å være viktig for brystkreft cellevandring [20]. Endringer i intracellulær Ca
2+ konsentrasjon endre viktige prosesser i tumor celle migrasjon og invasjon [21]. PKC regulerer metastase gjennom fosforylering av mange viktige proteiner i ulike trinn av metastasering. Alle disse regulatoriske elementer er aktivt involvert i våre prostatakreft studier. I våre tidligere studier, observerte vi bemerkelsesverdig opphopning av IP3 og betydelig intracellulær Ca
2+ mobilisering i prostatakreftceller etter ATP behandling [22]. Dette er åpenbart skyldes aktivering av PLCb av G-proteinkoblet P2Y2 reseptoren.
En annen vei er at P2Y2 reseptoren kan samhandle med αVβ
3/5 inte via et ekstracellulært orientert RGD domene for å regulere virksomheten G
12-avhengige Rho, Go-avhengige Rac, LIM kinase, og cofilin, proteiner som regulerer aktin cytoskeletal rearrangements som er viktige funksjoner i celle migrasjon [23]. Vi har tidligere vist at ATP indusert aktivering av Rac1 og Cdc42, fremmet dannelsen av lamellipodia og filopodia, og økt bevegelighet av prostatakreftceller [12], som indikerer en mulig rolle P2Y2 reseptor i prostatakreft cellemotilitet.
P2Y2 reseptoren kan også samvirke med EGFR å aktivere ERK1 /2 bane, da er det noen bevis på at transaktivering av P2Y2 reseptoren og EGFR eksisterer i noen celletyper, for eksempel membran fordeling av den P2Y2 transregulated av EGFR i blodkar glatte muskelceller [24 ], fremme dannelsen av EGFR /ErbB3 heterodimerer av P2Y2 reseptor i spyttkjertelceller [25]. Fosforylering av EFGR av P2Y2 reseptoren antas hovedsakelig på grunn av Src-avhengig rekruttering av P2Y2 reseptoren til et signalkompleks inneholdende EGFR som reaksjon på P2Y2 ligander [26]. I den foreliggende undersøkelse har vi vist at EGFR og ERK1 /2 kan bli aktivert av ekstracellulært ATP eller UTP stimulering. Knockdown av P2Y2 reseptoren trykkes ATP-indusert fosforylering av EGFR og ERK1 /2. Så vidt vi vet, vår nåværende data representerer det første eksemplet på at EGFR deltar i P2Y2 reseptor-regulert celle invasjon av prostatakreft.
Det er vel kjent at EGFR deltar i ulike cellulære prosesser som vekst, differensiering, tumorigenesis, invasjon og metastase av kreft [27, 28]. Øket ekspresjon av EGFR blir ofte detektert i prostata cancer, og er assosiert med dårlig prognose [29]. Monoklonalt antistoff mot EGFR har fått en effektiv bedring hos pasienter med prostatakreft [30]. Som en underfamilie av MAPK, ERK1 /2 er best karakteriserte cytoplasmatiske kinase aktivert av EGFR, og inhibering av ERK1 /2 er blitt benyttet som en biomarkør for EGFR-inhibitor handling [31]. Inhibering av ERK1 /2 pathway også har vært ansett som et viktig behandlingsstrategi for prostatakreft [32, 33]. I denne studien demonstrerte vi en vesentlig funksjon av P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway i mediering av prostatakreft celle invasjon og migrering. Sammen med vår forrige observasjon at ekstracellulære ATP er et viktig pro-invasiv middel innenfor svulstens mikromiljø, kan dette bidra til å belyse reguleringsmekanismen (e) underliggende EGFR aktivitet i prostata kreft progresjon.
IL-8 er funnet å være sterkt uttrykt i androgen-uavhengig metastatisk cellelinjer, så som PC-3-cellelinjen [9]. Kliniske studier viser også at IL-8-produksjon er forhøyet i tumorvevet, og serum av pasienter med prostatakreft, og det er en direkte sammenheng mellom høyt nivå av IL-8 og tumorprogresjon [34]. Økning av IL-8 produksjon er assosiert med tumor angiogenese, spredning og metastasering av prostata kreft
in vitro Hotell og
in vivo product: [35]. Her viser vår studie at ATP oppregulert uttrykket og sekresjon av IL-8 via P2Y2-EGFR-ERK1 /2 vei, og IL-8 produksjon bidro til ATP-forfremmet invasjon og migrasjon av prostata kreft celler.
i sammendraget, våre resultater viser at P2Y2 reseptor oppregulerer IL-8 produksjon, og dermed fremme invasjonen og migrasjon av prostatakreftceller. Kryss snakke med EGFR og etterfølgende aktivering av ERK1 /2 pathway kan være en av de viktige mekanismer for P2Y2 reseptoren funksjon. Derfor kan behandlinger som er rettet mot P2Y2-EGFR-ERK1 /2 pathway gi effektive behandlingsstrategier for prostatakreft.
Takk
Vi takker professor Jian Zhang for å gi nyttig diskusjon for sluttbehandling av manuskriptet .
