Abstract
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en sjelden, men svært ondartet svulst med ukjent opprinnelse. Inhibin α-subenheten (
Inha
) knockout mus utvikler ACC følgende gonadectomy. Hos mennesker
INHA
uttrykk varierer mye innenfor ACC vev og dets sirkulerende peptid inhibin pro-αC har blitt beskrevet som en roman svulst markør for ACC. Vi undersøkte om genetiske og epigenetiske endringer av
INHA
genet i menneskets ACC føre til tap eller variant av
INHA
uttrykk. For dette formål, analyser av
INHA
sekvens, promoter metylering og mRNA-ekspresjon ble utført i humane binyrebark vev. Serum inhibin pro-αC nivåer ble også målt i ACC pasienter.
INHA
genetisk analyse i 37 unike ACC avslørte 10 roman, heterozygot sjeldne varianter. Av de 3 kodebaser berørt, en variant var synonymt og to var missense varianter: S72F og S184F. Den mindre allel av rs11893842 på -124 bp ble observert ved en lav frekvens (24%) i ACC prøver og ble assosiert med redusert
INHA
mRNA nivåer: 4.7 ± 1.9 vilkårlige enheter for AA, sammenlignet med 26 ± 11 for AG /GG genotyper (P = 0,034). Den metylering av fire proksimale
Inha
promoter CPGs ble abnormt økt i fem ACC (47,7 ± 3,9%), sammenlignet med vanlige binyrer (18,4 ± 0,6%, P = 0,0052), mens de øvrige 14 ACC studert viste redusert promoter metylering (9,8 ± 1,1%, p = 0,020). CpG metylering ble inverst korrelert til
Inha
mRNA-nivåer i ACC (r = -0,701, p = 0,0036), men ikke i forbindelse med serum inhibin pro-αC nivåer. I konklusjonen, avvikende metylering og felles genetisk variasjon i
INHA
promoter forekommer i menneskelig ACC og er assosiert med redusert
INHA
uttrykk
Citation. Hofland J, Steenbergen J , Voorsluijs JM, Verbiest MMPJ, de Krijger RR, Hofland LJ, et al. (2014) Inhibin Alpha-subenheten (
INHA)
Expression i Adrenokortikal Cancer er knyttet til genetiske og epigenetiske
INHA
Arrangøren Variasjon. PLoS ONE 9 (8): e104944. doi: 10,1371 /journal.pone.0104944
Redaktør: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 18 mars 2014; Godkjent: 17 juli 2014; Publisert: 11 august 2014
Copyright: © 2014 Hofland et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er til stede i manuskriptet og Supplemental tabell
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
Konkurrerende interesser:. Prof. Wouter de Herder er en PLoS ONE Redaksjon medlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en sjelden kreft med dårlig overlevelse [1], [2] . Forekomsten av ACC har en kvinnelig overvekt og en bimodal fordeling med en økt forekomst hos barn og hos voksne over 60 år [3]. Familiær ACC forekommer i sammenheng med genetiske syndromer, slik som Beckwith-Wiedemann syndrom [4] og Li-Fraumeni syndrom [5]. Mutasjoner i gener som ligger til grunn for disse forstyrrelsene har også vært knyttet til sporadisk ACC dannelse, spesielt i tilfelle av
TP53 product: [6]. Den hyppigste endring funnet i ACC er overekspresjon av mordyret trykt IGF-II locus [7]. Mer nylig har mutasjoner i Wnt /β-catenin veien er blitt vist å forekomme i løpet av tumorprogresjon adrenokortikal [8]. Genetiske årsaker og rolle kromosomavvik i adrenocortical tumorigenesis fortsatt i stor grad ukjent.
inhibin α-subenheten (kodet av
INHA
) danner inhibin A eller B ved å koble til inhibin βA- eller βB-subenheter, respektivt. Dens uttrykk er begrenset til gonader, morkaken og binyrebarken. Den viktigste virkning av sirkulerende inhibiner A og B er hemming av lokal aktivin-indusert follikkelstimulerende hormon (FSH) sekresjon i hypofysen [9]. I en murin modell knockout, ble inhibin α-subenheten funnet å ha en tumor undertrykker rolle for gonadal vev [10] og, etter gonadectomy, for binyrebarken [11]. Ninety-ni prosent av
Inha Anmeldelser – /- mus utviklet binyrebark steroid-sekresjon karsinom etter gonadectomy [11]. Pathways involvert i denne effekten inkluderer differensiering i granulosa celle-lignende celler med uttrykk av føtale eller gonadale markører som
Gata4
,
Lhr, Fshr Hotell og
Cyp17a1 product: [12 ].
Inha-
beslektet karsinogenese i mus har også blitt tilskrevet redusert aktivin signaleringspotensial og avvikende ekspresjon og effekter av TGF-β2 [13], [14].
I mennesket, hvis funksjon adrenal inhibiner er ukjent, selv om dens motstykke aktivin A er blitt beskrevet å være involvert i sonen spesifikk regulering av adrenokortikal steroid [15]. Bevisene for
INHA
som en tumor suppressor i menneskelig ACC er motstridende. Flere mRNA og protein-analyse studier har vist manglende
INHA
ekspresjon i en andel av pasienter med ACC samt
INHA
overekspresjon i en annen undergruppe [16], [17], [18] , [19], [20]. Nylig rapporterte vi at serumnivåene av det frie peptid form av α-subenheten, inhibin pro-αC, ble øket i pasienter med binyrebark karsinomer, og at disse nivåene kan benyttes som en svulst markør [21]; inhibin pro-αC nivåer kan være nyttig for differensiering mellom ondartede og godartede binyrebark svulster samt for oppfølging av den enkelte pasient. Selv om de fleste ACC pasientene viste økt serumnivå av inhibin pro-αC en undergruppe av pasientene hadde normale nivåer, muligens som representerer de svulster som ikke uttrykker
INHA product: [21].
Flere DNA forandringer er kjent for å påvirke genekspresjon i løpet av tumorigenesis. Bortsett fra de genetiske endringene som forårsaker avvikende eller fraværende uttrykk, epigenetiske forandringer, som for eksempel kromatin remodellering og CpG metylering kan påvirke gentranskripsjon og ofte forekommer i kreft [22]. Metylering av CpG øyer i genet promoter regioner kan resultere i transkripsjonen lyddemping og tap av genuttrykk på grunn av interferens med bindingen av transkripsjonsfaktorer [23].
Innsikt i offentlig regulerte
INHA
uttrykket kan kaste ytterligere lys over rollen som
INHA
i menneskelig adrenal tumorigenesis og på variasjonen i serum frie sirkulerende inhibin nivåer som kan fungere som serum svulst markør i ACC pasienter. For å løse dette undersøkt vi regulerende mekanismene for
INHA
uttrykk i menneskelig ACC. Sekvensering av
INHA
genet ble gjennomført for å søke etter genetiske varianter som kan påvirke genet funksjon eller et uttrykk nivåer. Videre ble utført kvantitativ metylering analyse av
INHA
promoter for å undersøke om metylering av CPGs bidrar til forskjeller i uttrykk. Disse analysene ble koblet til tumor mRNA nivåer av inhibin a-underenhet og serumkonsentrasjoner av inhibin pro-αC.
Materialer og metoder
Prøvetaking
parafininnstøpte vev blokker ble samlet inn fra de patologiske arkivene til Erasmus MC. Vevsprøver stammer fra pasienter operert mellom 1991 og 2010 i dette sykehuset. Diagnosen adrenocortical karsinom ble gjort om van Slooten indeksen skredet 8 [24]. Tumor iscenesettelse ble utført i henhold til det europeiske nettverket for studier av binyre svulster (ENSAT) staging system [1]. Hematoksylin og eosin-fargede objektglass ble undersøkt av en patolog og seksjoner med en høy prosentandel av levedyktige tumorceller ble microdissected for videre analyse. Vev ble skåret ut før 2007 ble samlet inn fra de patologiske arkivene til Erasmus MC. Informert samtykke for sekundær bruk av overskudds vev ble innhentet fra alle pasienter verbalt før operasjonen. Pasient nektet å gjøre vev tilgjengelig for forskning ble registrert skriftlig og disse prøvene ble ikke tatt med i denne studien tilsvarende. Fra 2007 og utover, ble det samlet inn prøver i en prospektiv studie av adrenal svulster og informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakere. Disse prøvene også inkludert adrenal vev fra pasienter som gjennomgikk adrenalektomi grunn av nyrecellekreft, adrenal hyperplasi og adenom. Tumorsnitt ble samlet inn fra levedyktige kreft deler og snap-frosset i flytende nitrogen eller tørris kort tid etter reseksjon. Preoperative serumnivåer av inhibin pro-αC ble målt i pasient undergrupper ved hjelp av en enzymbundet immunometrisk analysen (Diagnostic Systems Laboratory, Webster, Texas, USA). Studien ble utført i henhold til den nederlandske regelverket om bruk av gjenværende vev og godkjent av Medical Ethics Committee av Erasmus MC.
DNA-sekvense
DNA ble isolert med en DNA mini kit ( Qiagen, Venlo, Nederland) i henhold til produsentens protokoll og oppløst i H
2o. Konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av et Nanodrop dispenser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
inhibin α-underenhet-genet, som ligger ved 2q35, er sammensatt av to eksoner (figur 1). For DNA-analyse av parafininnstøpte vev primerpar ble valgt ut til å forsterke områder av 200-250 bp. For fersk frosset vev regioner opp til 500 bp kunne full forsterket. Primer steder er oppsummert i tabell 1. Primerne dekket kodende område, opp til -331 bp fra ATG-startsete (inneholdende den cAMP-binding, SF-1-respons og Gata elementer ved -151 til -112 bp [25], [ ,,,0],26]) og minst 153 bps av intron grenser til ekson-intron grenser (figur 1).
Tilhører 2q35,
INHA
er sammensatt av to eksoner atskilt av en 2 kb intron. Den kodende sekvens er sammensatt av 1101 bps. Regionene sekvensert i denne studien er angitt med de kontinuerlige piler. De områdene som ble undersøkt for metylering er vist ved de stiplede pilene; CpG dinukleotider hell kjennetegnet er vist som åpne sirkler.
PCR amplication ble utført i en 30 mL volum på 0,05 U /mL FastTaq polymerase (Roche Applied Science, Almere, Nederland), en ng /mL DNA, 250 nM forover og bakover primere, 200 mikrometer dNTP (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) og buffer inneholder MgCl
2 (Roche) i en GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Nederland) under følgende betingelser: 7 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 1 minutts intervaller på 95 ° C, 56-63 ° C og 72 ° C, og endte med 10 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter ble renset ved høy Pure PCR Vare Purification Kit (Roche).
både forover og bakover PCR primere ble brukt i egne sekvens reaksjoner med den BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Tre pl av renset PCR-produkt ble anvendt sammen med 500 nM av primeren i en reaksjon av 1 minutt ved 96 ° C og 25 sykluser på 30 sekunder ved 96 ° C, 15 sekunder ved 50 ° C og 4 min ved 60 ° C. Sekvensreaksjonsproduktene ble renset ved anvendelse av fargestoff-Ex 96 Purification Kit (Qiagen) og Micro-Bio-Spin Rense kolonner (Bio-Rad, Veenendaal, Nederland). Sequence påvisning ble utført ved hjelp av ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sequencher programvare (gener koder Corporation, Ann Arbor, MI, USA) ble brukt for DNA-analyse.
Metylering analyse
En mikrogram av DNA, hentet fra frosne prøvene, ble behandlet med bisulfite bruker EZ DNA-metylering kit (Zymo forskning, Irvine, CA, USA), eluert i 100 pl H
2O og lagret ved -80 ° C. Bisulfitt-behandlede DNA i promoterregionen av
INHA
ble amplifisert ved PCR ved en T7-promoter ble introdusert i revers primer. Bruke EpiDESIGNER programvare levert av Sequenom (San Diego, California, USA) to primersett ble utformet som dekket flere CpG dinukleotider oppstrøms av
INHA
starte hotellet (figur 1); primersekvensene er beskrevet i tabell 1.
PCR ble utført i et 5 ul volum inneholdende 0,04 U /ul HotStar Taq-polymerase (Qiagen), 200 uM dNTP, 200 nM av begge primerne, 1 ul av bisulfitt -behandlet DNA, HotStar PCR buffer og H
2o. Etter 10 minutter ved 95 ° C, ble 35 sykluser utført på 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 53 ° C og 45 sekunder ved 72 ° C. Reaksjonen ble avsluttet med en 7 minutters glødetrinn ved 72 ° C. Etter bekreftelse av PCR-produkt på en 2% agarose-inneholdende gel, ble produktet behandlet med 0,3 U alkalisk rekefosfatase i 20 minutter ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C.
Deretter
in vitro
transkripsjon og basespesifikk spaltning ble utført i et 7 pl blanding inneholdende 20 U T7 R A, -63A G og -56G T) i 5’UTR, mens en heterozygot variant direkte etter stoppkodon (* 1G A) ble påvist i en annen ACC. Vi lokaliserte tre intronic varianter, som ligger 179, 72 og 9 bp oppstrøms for intron 1-exon 2 grensen. I kodingen regionen i
INHA
vi har oppdaget en synonymt nucleotide endring (75C T, Ala25Ala) og 2 missense varianter, i tre distinkte ACC. De sistnevnte både består heterozygote C → T varianter, ved bps 215 og 552, som fører til serin til fenylalanin endringer på aminosyrer 72 og 184, henholdsvis
I vårt komplette serier av ACC prøver, det -124A g. SNP, rs11893842, var den mest utbredte genetisk variasjon med en mindre allel frekvens (MAF) på 24%, sammenlignet med 44% i en referansegruppe (www.1000genomes.org [27]). Videre er mindre allel av intronic SNP IVS1-87G A (rs116399602) var til stede i 16% av ACC prøver, tilsynelatende høyere enn hos friske individer (2,8% MAF). Rs7588807 (IVS1-314G T) ble kun målt i undergruppe av frosne DNA-prøver. Den mindre T-allelet ble tidligere rapportert å forekomme i 48% hos kontrollpersonene; ACC viste en lavere MAF på 29%. Rs35118453 (-16C T) og rs12720063 (532C T) var til stede ved lave frekvenser, kan sammenlignes med referanse [27]: 9% og 12%, respektivt. Rs144941390, rs374972575 og rs148455844 i
INHA
genet ble hver påvist i en ACC prøven.
Metylering analyse
Den første serien der
INHA
promoter metylering ble undersøkt, omfattet DNA fra 3 normale binyrene og 12 ACC. For de 4 CpG dinukleotider 558, 599, 719 og 751 bps oppstrøms av
INHA
starte språk lav metylering forhold ble oppnådd i alle prøvene som ble testet: 4,4 ± 1,1%, 4,5 ± 0,8%, 1,7 ± 0,7% og 2,5 ± 0,6% (gjennomsnitt ± SEM), respektivt. Videre var det ingen forskjeller mellom normale adrenal vev og ACC (data ikke vist). De CPGs i nærhet til start nettstedet ble metylert i større grad i en undergruppe av prøver; derfor har vi analysert ytterligere 7 ACC med nedstrøms primerpar bare.
Resultatene av metylering analyse av CPGs på -285, -241, -203 og -149 er avbildet i Figur 2. Fem ACC hadde abnormt høy metylering for alle fire proksimale CPGs undersøkt i
INHA
arrangøren. Gjennomsnitt metylering forholdet mellom disse ACC var 47,7 ± 3,9%, sammenlignet med 18,4 ± 0,6% for vanlige binyrer (P = 0,0052) og 9,8 ± 1,1% for den andre ACC (P 0,0001). Forskjellen i Metyleringen mellom normale binyrer og den andre ACC var også statistisk signifikant (P = 0,020). Prosentandelen av
INHA
promoter metylering i ACC prøvene var ikke assosiert med tumor egenskaper, for eksempel hormonelle overproduksjon, van Slooten indeks eller ENSAT scenen (data ikke vist).
Kvantitativ metylering analyse av fire CpG dinukleotider i
INHA
promoter ble utført i 3 normale binyrer og 19 ACC. Individuelle CPGs er indikert på x-aksen ved bp nummeret 5 «fra ATG nettstedet. 0 angir ingen metylering av DNA, mens 1 angir at alle DNA testet i vevsprøven metyleres. Individuelle datapunkter er sammensatt av et gjennomsnitt av tredoble målinger.
Expression analyse
INHA
mRNA uttrykk nivåene ble målt i normal adrenal (n = 10), adrenocortical hyperplasia (n = 20), adenom (ADA, n = 11) og ACC (n = 25) vev. Kohorten inkluderte 10 normal binyre, 4 adrenal hyperplasi og 14 ACC prøver hvor
INHA
nivåer ble rapportert før [16]. Den foreliggende analyse viste fravær av
INHA
ekspresjon i 3 ACC mens den andre ACC viste et bredt spekter av ekspresjon fra 0,080 til 220 vilkårlige enheter (A.U.). Totalt sett var det ingen signifikante forskjeller mellom nivåene av
INHA
uttrykk i alle grupper undersøkt (figur 3A). Også mRNA nivåer av
INHA
i ACC var ikke relatert til tumor egenskaper (data ikke vist).
(A) Kvantitativ
INHA
mRNA-analyse var sammenlignbare i normale binyrer (Nl, n = 10), adrenocortical hyperplasia (Hyp, n = 20), adenomer (ADA, n = 11) og karsinom (ACC, n = 25). ACC prøve å huse den S184F variantis vises som en åpen sirkel. Bar representerer gjennomsnittet. (B) Variasjon i rs11893842 (-124A G) ble forbundet med endringer i
INHA
genuttrykk. Barer representerer midler, * P 0,05. (C) Negativ sammenheng mellom arrangøren metylering av
INHA
genet og
INHA
mRNA uttrykk (r = -0,701, p = 0,0036). (D) Mangel på sammenheng mellom
INHA
mRNA uttrykk og serum inhibin pro-αC Z-score i ACC pasienter (r = -0,473, p = 0,10).
Av 3 ACC prøver med sjeldne genetiske varianter i
INHA
eksoner, bare var tilgjengelig for uttrykk analyse; dette ACC huse den S184F endringen viste et normalt nivå av
INHA
mRNA (15 A.U., figur 3A, åpen sirkel). Når stratifisert for de fem vanligste SNPs, ble bare rs11893842 genet variasjon forbundet med endringer i
INHA
mRNA: bety uttrykk i vev med AA genotype var 4,7 ± 1,9 A.U., sammenlignet med 26 ± 11 A.U. for AG /GG genotyper (P = 0,034, figur 3B).
Kombinert mRNA og metylering analyser var tilgjengelig for 15 vev. Totalt var det en signifikant negativ sammenheng mellom gjennomsnittlig metylering forholdet mellom proksimale CpG øyer og
INHA
mRNA uttrykk (Figur 3C, r
s = -0,701, p = 0,0036).
Serum inhibin pro-αC nivåene var tilgjengelig i en undergruppe av pasienter. Det var ingen signifikante forholdet mellom serum inhibin pro-αC Z-score på den ene siden og metylering forholdet (n = 9, r
s = -0,10, p = 0,81, data ikke vist) eller mRNA ekspresjon (n = 13, r
s = -0,47, p = 0,10, figur 3D) på den andre. Inhibin pro-αC nivåer var bare tilgjengelig for en ACC pasient med sjeldne
INHA
varianter: dette premenopausale kvinnelig pasient med tre sjeldne varianter i 5’UTR av
INHA
hadde sterkt økt inhibin pro- αC nivåer på 3000 ng /l. (normal 780 ng /l)
Diskusjoner
inhibin α-subenheten har vært innblandet i adrenocortical tumorigenesis siden det ble observert at gonadectomized
Inha
– /- mus utviklet binyrebark karsinomer med nesten fullstendig pene [11]. Tap av
INHA
uttrykk er påvist i bare en liten undergruppe av menneskelig ACC [16], [17], [18], [20], [28], [29], bedende mot en betydelig svulst lyddemper rollen
INHA
i menneskelig adrenokortikal kreftutvikling. Dette er den første studien som viser at den store variasjonen i
INHA
uttrykk i ACC er delvis forårsaket av metylering og felles genetisk variant av
INHA
promoter og er ikke på grunn av sjeldne genetiske varianter.
i murine knockout-modell,
Inha
antas å disponere subcapsular binyrebark celler til å gjennomgå en fenotypisk bryteren til gonadale-lignende celler [11], [12], [14]. Dette har vært antatt å være forårsaket av økt tilgjengelighet av TGF-β type III-reseptoren betaglycan fører til utvidet TGF-β2 signalering [13]. Samtidig økning i sirkulerende gonadotropin nivåer kan sikre spredning av binyrebark cellene gjennom en cyclin D2-avhengige veien [30]. Selv om histologi av disse svulstene ligner den av adrenokortikal kreft hos mennesker [11] er de funksjonelt mer sammenlignbare med østrogen-utskillende gonadal-lignende celler [12]. Enten lokale knockdown av
INHA
i menneskelige binyrebark celler bidrar til adrenocortical tumorigenesis er ukjent. Siden forekomsten av overvekt ACC viser i postmenopausale kvinner som har økt gonadotropin nivåer, kan denne mekanismen forekomme i denne undergruppen av pasienter.
foregående uttrykket studier har avslørt at inhibin α-subenheten ikke blir uttrykt i en liten undergruppe av ACC prøvene [16], [17], [18], [20], [28], [29]. I motsetning til dette,
in vivo
Studier har vist økte nivåer av inhibin α-subenheten i serum fra pasienter med ACC [21], [31], [32]. Disse funnene er sannsynlig å være en konsekvens av den store variasjon i tumor
Inha
ekspresjonsnivåer, i denne studien over en 1000-fold. Årsaker til tap av eller variasjon i
INHA
uttrykk var ukjent.
En tidligere studie har undersøkt
INHA
genetiske varianter i ACC. Longui
et al.
[19] studerte pediatriske ACC pasienter med kimcellelinje
TP53
mutasjoner og fant 3 sjeldne, heterozygote
INHA
varianter i 6 av 46 (13%) pasienter. Av disse tre nye varianter, var ett (G227A, rs12720061) deretter vist å være et felles SNP, og ikke forekomme i vårt ACC kohort. Konsekvenser av de to andre genetiske varianter (P43A og A257T) er ukjent; de ble ikke funnet i den nåværende etterforskningen av sporadisk ACC. Interessant, den ovennevnte studien fant tap av heterozygositet (LOH) i nærheten av
INHA
genet i åtte av ni ACC studert [19], noe som tyder på at LOH kunne føre til redusert uttrykk nivåer. Videre komparativ genomisk hybridisering analyser av menneskelig ACC beskrevet sporadisk kromosom tap av
INHA
regionen på 2q33-36, med en overvekt i barndommen svulster [33], [34], [35]. På den annen side ble det inhibin α-subenheten tidligere er vist å være overuttrykt i pediatrisk ACC [21].
I denne studien, to nye heterozygot missense genetiske varianter ble oppdaget. Serin for å fenylalaninnivå substitusjoner ved aminosyrene 72 og 184 kan påvirke aktiviteten av det resulterende inhibin α-subenhet, men ettersom funksjonen for inhibin i den menneskelige binyrene er ukjent [36], er det vanskelig å undersøke konsekvensene av potensielt forandres aktivitet. Svulsten huse den S184F endring uttrykt et normalt nivå av
INHA
mRNA, men funksjon eller protein degradering kan fortsatt bli påvirket av innføringen av benzyl side ringen. De genetiske varianter som ligger 179, 72 og 9 bps oppstrøms av intron-exon grensen kan føre til alternativ spleising av
INHA
genet. Viktigere, ble det ikke homozygot varianter oppdages, bedende mot total knockout av
INHA
fører til ACC formasjon. Dessverre hadde vi bare en pasient med
INHA
varianter og samtidig tilgjengelig serum inhibin pro-αC nivåer. Her ble det funnet høye serumnivåer til tross for tre varianter i promoterregionen heve sannsynligheten for øket promoteraktivitet. Gitt den lave hyppigheten av
INHA
genetiske varianter i sporadisk og familiær ACC [19], kan disse DNA endringene bare være involvert i adrenocortical tumorigenesis i en liten undergruppe av ACC pasienter. Flere felles
Inha
SNPs ble påvist i våre pasienter. Mindre alleler av rs11893842 og rs758807 ble funnet å forekomme hos pasienter ACC ved lavere frekvenser enn tidligere rapportert hos friske kullene, noe som kan tyde på at de store lene av disse SNPs spille en rolle i onkogenesen adrenal. Intriguingly, den mindre allel av rs11893842, som ligger i promotorområdet i umiddelbar nærhet til viktige regulatoriske sekvenser [25], [26], ble forbundet med lavere nivåer av
INHA
mRNA-ekspresjon. Den lavere frekvens av dette SNP i ACC prøvene ser ut til å motsi hypotesen om at
INHA
er en tumor suppressor i menneskelig ACC.
metylering av promoter regioner av tumorsuppressorgener er en vanlig mekanisme involvert i kreftutvikling [23]. Redusert
INHA
uttrykk i ACC kan være forårsaket av økt metylering av
INHA
promoter. Metylering av follistatin, involvert i aktivin og inhibin signalveien som en aktivin antagonist, ble tidligere funnet i den humane cellelinjen ACC H295R [37]. Vi viser nå at en undergruppe av menneskelig ACC (21%) har en økt metylering forhold på flere CPGs i
INHA
promoter, i motsetning til de fleste av ACC som viser en redusert metylering av
INHA
arrangøren i forhold til normal adrenal vev. Denne bredt spekter av metylering antagelig står for en del av det brede
INHA
uttrykk utvalg, som vist ved den inverse forholdet mellom
INHA
promoter metylering og
INHA
mRNA uttrykk. Dette epigenetisk modifikasjon i
INHA
promoter og rs11893842 kan også være involvert i offentlig regulerte
INHA
uttrykk i den andre
INHA
-expressing vev, dvs. gonader og morkaken.
nivåene av metylering av
INHA
promoter og
INHA
mRNA uttrykk var ikke forbundet med serum inhibin pro-αC nivåer. Videre har vi tidligere funnet noen sammenheng mellom pro-αC nivåer og tumorstadium eller størrelse [21]. Derfor kan disse nivåene være primært avhengig (post-) translasjonelle modifikasjoner, tumor celleaktivitet, eller klaring fra sirkulasjonen.
Study begrensninger omfatter den lille utvalgsstørrelse, usikkerhet om tilstedeværelsen av LOH og om romanen variantene er bakterie linje eller somatisk. Gitt den svært lav forekomst av
INHA
genetiske varianter i denne betydelige sett av 37 ACC, er det svært usannsynlig at
INHA
mutasjoner spille en betydelig rolle i ACC dannelse i mennesket. Selv om LOH ikke ble undersøkt direkte i disse prøvene, forekomst av heterozygote varianter i ACC ber mot fullstendig utstansing av genet. Viktigere, bare homozygot
Inha
knock-out mus utviklet binyrebark svulster [11] bedende mot tumorigent potensialet i ett eksemplar nummer sletting. Til slutt, sammen sekvensering av normal og tumorvev kan avsløre om de tidligere ubeskrevet varianter har en bakterie linje eller somatiske opprinnelse, men dette var ikke tilgjengelig for den aktuelle studien. Disse funnene viser en ny kobling mellom metylering og uttrykk for inhibin. Knockdown av inhibin α-subenheten under ACC formasjon gjennom metylering kan disponere for uhindret parakrint TGF-β eller activin handling på adrenocortical spredning eller steroidogenesis. Gjenopprette inhibin og også follistatin [37] nivåer i ACC etter demethylating midler kan bidra til antiproliferative og steroidogenic effektene sett med DNA metylering hemmer 5-aza-2′-deoxycytidine i binyrebark celler [38]. Motsatt kan metylering av inhibin arrangøren også være en felles reguleringsmekanisme av inhibin uttrykk i gonadal, adrenalin og placenta vev og behandling med demethylating agenter kan bli spekulert å påvirke inhibin produksjon i disse organene.
I konklusjonen, avvik metylering og felles genetisk variasjon innen promoter-regionen i
INHA
genet er assosiert med
INHA
mRNA uttrykk i menneskelig ACC. Disse genetiske og epigenetisk
Inha
endringer kan bidra til menneskelig adrenocortical tumorigenesis, ligner på situasjonen i murine
Inha
knockout modell. Sjeldne
Inha
varianter ser ikke ut til å være involvert i patofysiologien ved sporadisk ACC.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Study datasett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104944.s001 plakater (XLSX)
