Abstract
Bakgrunn
5α-reduktase 1 (5αR1) og 5α-reduktase 2 (5αR2) omdanne testosteron til det mer potente androgen dihydrotestosteron. 5αR2 er den viktigste isoenzymet i normal prostata vev; Men de fleste prostatakreft økt 5αR1 og redusert 5αR2 uttrykk. Tidligere finasterid (5αR2 inhibitor) behandling begynt 3 uker etter tumorimplanteringen hadde ingen virkning på Dunning R3327-H rotteprostatatumorvekst. Vi tror svulsten kompensert for finasterid behandling ved å øke svulst 5αR1 uttrykk eller aktivitet. Vi hypotese at finasterid behandling ikke ville vesentlig endre tumorvekst selv om begynt før svulsten implantasjon, mens dutasterid (5αR1 og 5αR2 hemmer) behandling vil redusere tumorvekst uavhengig av om behandlingen ble igangsatt før eller etter svulst implantasjon.
Methodology /hovedfunnene
Sixty åtte uker gamle hann nakne mus ble randomisert til Control, før og etter Finasteride, og før og etter Dutasterid (83,3 mg medikament /kg diett) diettgruppene. Pre- og post-gruppene begynte sin behandling dietter 1-2 uker før eller 3 uker etter subkutan injeksjon av 1 x 10
5 WPE1-NA22 menneskelige prostata kreft celler, henholdsvis. Tumorene fikk vokse i 22 uker; tumor områder, kroppsvekt og matinntak ble målt ukentlig. Ved studiens konklusjon, prostata og sædvæske vekter ble betydelig redusert i alle behandlingsgrupper versus kontroll; dutasterid inntaket betydelig redusert sædvæske vekter sammenlignet med finasterid inntak. Ingen forskjeller ble målt i finalen tumor områder eller tumor vekter mellom grupper, trolig på grunn av dårlig tumorvekst. I oppfølgingsstudier, spredning av WPE1-NA22 prostatakreftceller og prostata epitelceller forelder linje RWPE-1 var uendret ved behandling med testosteron, dihydrotestosteron, eller Mibolerone, noe som tyder på at disse cellelinjene ikke er androgen-sensitive.
Konklusjon
den manglende responsen fra WPE1-NA22 prostatakreftceller til androgen behandling kan forklare den manglende tumorvekst observert. Ytterligere studier er nødvendig for å avgjøre om finasterid og dutasterid er effektive i å redusere prostatakreft utvikling /vekst
Citation. Opoku-Acheampong AB, Nelsen MK, Unis D, Lindshield BL (2012) Effekten av Finasteride og Dutasterid på veksten av WPE1-NA22 prostatakreft xenografter i nakne mus. PLoS ONE 7 (1): e29068. doi: 10,1371 /journal.pone.0029068
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 22 august 2011; Godkjent: 20 november 2011; Publisert: 05.01.2012
Copyright: © 2012 Opoku-Acheampong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet beskrevet ble støttet av National Institute for Health (NIH) Grant Number P20 RR017686, Institutional Development Award Program av National Center for Forskning Resources, og ved Johnson Senter for Basic kreftforskning ved Kansas State University (http: //cancer.ksu .edu /). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av Center of Biomedical Research Excellence for epithelial funksjon i helse og sykdom eller NIH. Dette er bidraget nei. 12-033-J fra Kansas Agricultural Experiment Station. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreftformen hos menn, anslås å stå for nesten 30% av krefttilfellene i 2011 [1]. Prostata tumorvekst er ofte stimulert av androgener. Testosteron, det viktigste sirkulerende androgen, omdannes ved hjelp av de isoenzymer 5α-reduktase 1 og 5α-reduktase 2 til det mer potente dihydrotestosteron, som binder seg med opp til ti ganger høyere affinitet til androgen reseptoren enn testosteron [2], [3] . 5α-reduktase 1 er den viktigste isoenzymet i human lever og nongenital hud, mens 5α-reduktase 2 er den viktigste isoenzymet i prostata, bitestikkel, sædvæske, og genital hud [4].
Hemme androgen produksjon og /eller blokkerer sin handling er vanlige metoder for å bekjempe prostatakreft [5]. De fleste studier rapporterer økt 5α-reduktase en og redusert 5α-reduktase 2 mRNA uttrykk eller aktivitet i prostatakreft [6] – [9]. Andre har rapportert økt 5α-reduktase en mRNA uttrykk og ingen vesentlige endringer i 5α-reduktase 2 mRNA uttrykk i prostatakreft versus normalt vev [10], økt uttrykk av begge isoenzymer i prostata kreft [5], eller tap av uttrykk for begge isoenzymer i metastatisk prostatakreft [11]. To 5α-reduktasehemmere, finasterid (5α-reduktase 2-hemmer) og dutasterid (5α-reduktase 1 og 2-hemmer), blir ofte brukt til å behandle benign prostatahyperplasi (BPH) [12]. Disse 5α-reduktasehemmere også kunne brukes til å forebygge eller behandle prostatakreft ved å redusere dihydrotestosteron nivåer [13].
Til støtte for denne muligheten, redusert finasterid forekomsten av prostatakreft med 24,8% i Prostate Cancer Prevention Trial ( PCPT) [14]. Tilsvarende, i Reduksjon av Dutasterid av Prostata hendelser (REDUSERE) rettssaken, dutasterid redusert forekomsten av prostatakreft med 23% [15]; imidlertid basert på resultatene fra disse studiene, Food and Drug Administration (FDA) har nylig revidert sikkerhetsinformasjonen for både narkotika å si at narkotika øker pasientenes risiko for å utvikle høyverdig prostatakreft [16]. I dyremodeller, dutasterid, men ikke finasterid, hemmet vekst av Dunning R-3327H rotte prostata-tumorer [17]. I nakne mus som bærer LNCaP humane prostatakreft xenotransplantater, både finasterid og dutasterid redusert tumorvekst, selv om dutasteride var mer effektiv ved en ekvimolar dose [17]. Hos rotter finasterid betydelig redusert androgen-sensitive vev vekter, men gikk ikke ned Dunning R-3327H tumorvekst [18]
I disse dyrestudier, begynte finasterid og dutasterid administrasjon etter svulster ble etablert.; finasterid administrasjon initiert før svulsten implantasjon kan være mer effektive. På den annen side, uavhengig av når finasterid behandling igangsettes, kan prostata kreftceller kompensere for 5α-reduktase 2-hemming ved å øke 5α-reduktase 1-ekspresjonen og /eller aktiviteten; således kan den doble hemmende effekt av dutasterid har en fordel i forhold til finasterid. Vi undersøkte effekten av finasterid og dutasterid dietter begynt en uke før eller 3 uker etter subkutan injeksjon av WPE1-NA22 menneskelige prostata kreft celler i de bakre flankene av mannlige nakne mus. Vi brukte WPE1-NA22 prostatakreft xenografter fordi disse menneskelige kreftceller kan dyrkes
in vitro
, men danner ikke-invasive svulster med vekstrater og patologi ligner på Dunning R-3327H tumor [19], [20].
Materialer og metoder
Den institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Kansas State University godkjent alle dyre prosedyrer (protokoll 2794).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
WPE1-NA22 prostatakreft og RWPE-1 prostata epitelceller (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i serumfritt keratinocytt-media inneholdende bovint hypofyse-ekstrakt, og epidermal vekstfaktor (GIBCO Invitrogen, Carlsband, CA). For dyret studien ble WPE1-NA22 celler dyrket i 75 cm
2 kolber (Fisher Scientific, Pittsburg, Pennsylvania), fjernet med trypsin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og sentrifugert i 7 minutter ved 130 x g ved 37 ° C. Supernatanten ble fjernet og cellene ble rekonstituert i Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i en konsentrasjon på 5000 celler /mL. Tyve mikroliter av Matrigel ™ som inneholdt ~ 1 x 10
5 WPE1-NA22 kreftceller ble injisert inn i hver bakre flanke av nakne mus ved bruk av en Hamilton-sprøyte holder (Hamilton, Reno, NV), utstyrt med en 1 ml sprøyte og en 25 gauge 5/8 inn. nål (begge fra BD Biosciences).
Dyr, Study Dietter og Design
To kohorter av 30 (60 totalt) 8 uker gammel mannlig hårløse mus (Charles Rivers, Wilmington, MA) ble individuelt plassert i sterile betingelser. Musene ble overvåket daglig, veies ukentlig, og gitt dietter og vann
ad libitum
. AIN93-G behandlings dietter (Forskning dietter, New Brunswick, NJ) inneholdt dutasterid (gitt av GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Research Triangle Park, NC) og finasterid (Kemprotec, Middlesbrough, UK) på 83,3 mg /kg av kosthold, designet for å gi -10 mg medikament /kg kroppsvekt, som var i midten dutasterid anvendte dose av Xu og medarbeidere [17]. Etter mottak, ble musene akklimatisert for en uke før de ble randomisert til Control, Pre-Finasteride, Post-Finasteride, Pre-Dutasteride, og Post-Dutasterids grupper (n = 10-12, figur 1). Fem mus fullførte ikke studiet av helsemessige årsaker ikke er relatert til tumorvekst. Pre- og post-gruppene begynte sin behandling dietter 1-2 uker før eller 3 uker etter WPE1-NA22 celle injeksjon, henholdsvis. Den tre uker etter injeksjon endepunktet ble valgt fordi Canene-Adams og kolleger initiert finasterid behandling på samme punkt [18]. Studien ble avsluttet 22 uker post-tumor implantasjon. Mus ble avlivet etter CO
2 inhalering og blod ble umiddelbart trukket via hjertepunktering og sentrifugert i 1 minutt ved 2000 x g for å oppnå serum. Vev ble dissekert, flash frosset i flytende nitrogen, og lagret i en fryser ved -80 ° C.
før og etter grupper begynte sin behandling dietter 1-2 uker før eller 3 uker etter WPE1-NA22 celle injeksjon, respektivt. Studien ble avsluttet 22 uker post-tumor implantasjon
Tumor område ble beregnet ved hjelp av formelen for arealet av en ellipse. Areal = π * (lengde /2) * (bredde /2). Den gjennomsnittlige tumorområdet i en gruppe ble beregnet ved å summere de enkelte kreftområder for gruppen, deretter dele på totalt antall kreft steder i konsernet. Zeros ble registrert for svulst områder uten målbare svulster.
In Vitro
Androgen Behandling og celleviabilitet
WPE1-NA22 celler (passasje nummer ≤7) og RWPE-1 celler (passasje nummer ≤6) ble platet ved 10.000 celler per brønn i 96-brønners plater (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Tjuefire timer etter plating ble begge cellelinjene behandlet med testosteron (0,1 nM-30 nM), dihydrotestosteron (0,03 nM-100 nM, begge fra Sigma Aldrich, St. Louis, MO), og syntetisk androgen Mibolerone (0,01 nM- 20 nM, PerkinElmer, Waltham, MA) i 0,1% etanol. Medier og androgen behandlinger var forberedt daglig og skiftes hver 24 timer i løpet av fem-dagers behandlingsperioden. Celleviabilitet ble kvantifisert ved hjelp av CellTiter 96 vandige løsning analyse (Promega Corporation, Madison, WI) med en Bio-Tek uQuant Plate leser (BioTek, Winooski, VT). Resultatene som presenteres er fra 4 replikater av forsøkene
Statistical Analysis
Data ble analysert ved hjelp av SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina), med p. 0,05 ansett som statistisk signifikant. ANCOVA med kohort som kovariat ble brukt til å begynne analysere dyr studieresultatene. Den kovariat ble fjernet fordi den ikke står for en betydelig mengde avvik i alle analysene, og ANOVA med Tukey test ble brukt på data fra de to kohortene. Naturlig logger ble brukt til å transformere data når data ikke oppfyller modellforutsetninger. Kruskal Wallis ikke-parametrisk enveis ANOVA ble anvendt for tumor forekomst. Androgen behandlings celleviabilitet data ble analysert ved anvendelse av ANOVA med Dunnetts test
Resultatene
Sluttkroppsvektene til Pre-finasterid gruppe var betydelig høyere enn kontrollen (tabell 1, p 0,05). På tross ingen forskjeller i daglig matinntak eller mat effektivitet (data ikke vist) mellom gruppene. Tumor forekomsten var høy, 86,4% til 95,5%, med ingen forskjell mellom gruppene (figur 2). Ingen forskjell ble funnet i tumorvekt og tumorområder mellom grupper (Tabell 1 og figur 3), sannsynligvis et resultat av dårlig tumorvekst. Den største gjennomsnittlige svulst diameter i noen gruppe var 4,33 mm. Til tross for ikke å endre tumorvekst, både finasterid og dutasterid betydelig redusert prostata og sædblæren vekter som en prosentandel av kroppsvekten (p 0,05). I tillegg var det en betydelig nedgang i sædvæske vekter i dutasterid grupper versus finasterid grupper (Tabell 1)
Zeros ble registrert for svulst områder uten en svulst.; ingen signifikante forskjeller mellom gruppene
Zeros ble registrert for svulst områder uten svulster.; ingen signifikante forskjeller mellom gruppene.
Disse reduksjonene i androgen-sensitive vev foreslår at finasterid og dutasterid ble utøver sin anti-androgene handling. En forklaring på den dårlige veksten er at WPE1-NA22 cellene ikke androgen-sensitive som sine foreldre RWPE-1 human prostata epitelceller [21]. Således ble WPE1-NA22 og RWPE-1-celler behandlet med varierende konsentrasjoner av testosteron, dihydrotestosteron, og den syntetiske androgen Mibolerone. Vi fant ingen forskjell i celletall i begge cellelinje ved behandling med varierende konsentrasjoner av androgener (figur 4 og 5).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi effektene av to 5α-reduktasehemmere, finasterid og dutasterid, før og etter svulst injeksjon på veksten av WPE1-NA22 transplantater i nakne mus. Tumor forekomsten var høy for alle grupper fra 86,4% til 95,5%, lik den ~92-99% rapportert i tidligere Dunning R-3327H rotte prostata kreft studier [18], [22]. Den dårlig vekst av WPE1-NA22 transplantater i hårløse mus var en overraskelse gitt at xenograft tumor volum ble tidligere rapportert å være 0,2 cm
3 7 uker etter implantasjon [20]. Back-beregning dette er en svulst diameter på ~7.26 mm, som er mye større enn vi observert når som helst i løpet av vår studie.
En metodisk forskjell mellom studier som trolig bidro til forskjeller i tumorvekst er forskjellen i antall WPE1-NA22 kreftceller injisert inn i flankene av mus. Webber og kolleger subkutant injisert 5 × 10
5 WPE1-NA22 celler, fem ganger flere celler enn vi injisert i denne studien [20]. Færre celler ble injisert på grunn av bekymring for at tumorvekst ville være for rask, gitt størrelsen rapportert på 7 uker sammenlignet med Dunning R-3327H svulster som ikke er opplagt til 9-10 uker etter tumor implantasjon [18], [22] . To andre mulige forklaringer på dårlig vekst av WPE1-NA22 xenografter er at de nakne mus ble generere en immunrespons mot kreftcellene, eller at cellene ble ikke androgen-sensitive, så androgener ikke stimulere veksten.
Vi dro ut for å undersøke sistnevnte muligheten ved å behandle WPE1-NA22 celler og deres foreldre cellelinje, RWPE-1 human prostata epitelceller med en rekke konsentrasjoner av tre androgener. Tidligere vekst av RWPE-1-celler økte på en doseavhengig måte ved behandling med Mibolerone i doser på 0,01-10 nM [21]. Androgen konsentrasjoner brukes i vår
in vitro
studier var basert på flere studier som undersøkte proliferativ respons på de tre androgener [21], [23] – [25]. Fysiologiske intraprostatic nivåer av både testosteron (~0.2 nM-0,7 nM) [26] og dihydrotestosteron (5 nM-18 nM) [17], [27], [28] i mennesker falle innenfor området av konsentrasjoner som benyttes. For Mibolerone, brukte vi er konsentrasjonene med Bello og kolleger [21], men vi også doblet sin topp konsentrasjon for vår høyeste konsentrasjonen.
Interessant, vi fant ingen forskjell i celletall i begge cellelinje som svar på ulike konsentrasjoner av respektive androgen behandlinger. Vi prøvde å gjenta metodikken i Bello og kolleger; den eneste forskjellen er at vi brukte MTS-analysen, mens de brukte en metylenblått assay for kvantifisering av cellelevedyktighet [21].
Den manglende androgen følsomheten av både celler kan forklare den observerte dårlig tumorvekst. Videre støtter våre funn er at kjernefysisk androgen reseptor, kjernekraft 5α-reduktase to, og cytosoliske 5α-reduktase 1 proteinnivåer er umulig å oppdage i RWPE-1 celler [29]. Cellelinjer er avledet fra denne forelderen linjen sannsynlig har lignende nivåer av disse viktige androgen metabolisme /handlings proteiner. Videre er begge cellelinjer dyrket i medium uten føtalt bovint serum og eksogene androgener, noe som betyr at det er androgen-fri. Til sammen skal disse resultatene vurderes før du bruker eller tolke resultatene fra RWPE-1 og dets kreftfremkallende stammer cellelinjer.
Et annet overraskende resultat var betydelig høyere kroppsvekt i Pre-Finasteride gruppe uten en endring i mat inntak eller mat effektivitet. Basert på utviklingen i veksten i Pre-Finasteride gruppe, tror vi gruppen var tyngre ved randomisering selv om forskjellene i kroppsvekt var ikke signifikant på den tiden. Pre-Finasteride gruppen var allerede betydelig tyngre enn Pre-Dutasterid gruppe 1 uke etter randomisering tross ubetydelige forskjeller i matinntak (Pre-Dutasterid gruppe forbrukes numerisk mer i løpet av denne uken), som støtter vår tro. Finasterid er blitt funnet å øke svakt vektøkning hos menn med prostatacancer [30], men langtidsinntak økte ikke av rottenes kroppsvekt [31]. Dietter i alle behandlingsgrupper ble godt tolerert uten noterte bivirkninger.
Omfanget av reduksjonen av prostata og sædblære vekter som reaksjon på dutasteride og finasterid var tilsvarende de som tidligere er rapportert [18], [32], [33]. Vi fant også en signifikant reduksjon i sædvæske vekter i dutasterid grupper versus finasterid grupper. Så langt vi kjenner til, er vi de første til å rapportere at dutasterid resulterer i et større omfang av nedgang i sædblære vekter enn finasterid. Mus i vår studie forbrukes omtrent 13 mg /kg /dag av finasterid eller dutasterid, som er større enn 5 mg /kg /dag av finasterid som brukes ved Canene og medarbeidere [18], men i likhet med den midtre dutasterid anvendte dose av Xu og kolleger [17].
i sammendraget, selv om vi ikke ser en effekt av både hemmere på veksten av WPE1-NA22 xenograft
in vivo
, resultater fra prostata og sædblærene indikere at inhibitorer var effektive til å hemme deres respektive 5α-reduktase-enzym (er). Videre forskning på ulike modeller vil være nødvendig for å besvare vår problemstilling; men våre resultater spørsmålet tumorigenitet av WPE1-NA22 celler i nakne mus og androgen-følsomheten WPE1-NA22 og RWPE-1 celler.
