Abstract
cadherin-17 (CDH17), ett medlem av 7D-cadherin super ble overexpressed i magekreft (GC) og er assosiert med dårlig overlevelse, tumorresidiv, metastase, og avansert stadium tumor. Så langt cellefunksjon og signalering mekanisme CDH17 i GC er fortsatt uklart. I denne studien vi viste at over 66% av GC-cellelinjer (20/30) var CDH17 positive. Tissue microarray (TMA) analyse viste at 73,6% kinesiske GC vev (159/216) var CDH17 positive, mens 37% respektive tilstøtende normalt vev var CDH17 positive. Knockdown av CDH17 hemmet celleproliferasjon, migrasjon, heft og kolonidannelse, og også induserte en cellesyklus og apoptose i AGS menneskelig GC celler. På den andre siden, overekspresjon av CDH17 lettes MGC-803 GC tumorvekst i nakne mus. Antistoff-matrise og Western blotting-analyse viste at knockdown av CDH17 i AGS-celler nedregulert integrin β serie proteiner, ytterligere inaktivert de Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien, og førte til p53 og p21 akkumulering, noe som resulterte i inhibering proliferasjon, cellesyklus arrest og apoptose induksjon. Kollektivt, våre data for det første demonstrerer kapasiteten til CDH17 for å regulere aktiviteten av Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien for celleproliferasjon i GC, og tyder på at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for videre forskning.
Citation: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Targeting cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK alarm og hemmer celleproliferasjon i magekreft. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296
Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrike
mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 26 november 2013; Publisert: 20 januar 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Roche R D-senteret (Kina) unntatt Yanfen Fang, som er ansatt i East China Normal University, Shanghai, Kina.. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Magekreft (GC) er rangert som den nest største årsaken til global kreftdødelighet og den fjerde vanligste kreftformen i verden [1], [2]. Median overlevelse av GC pasienter er 7~10 måneder. De fleste pasienter med GC stede med sent stadium sykdommen med en samlet 5-års overlevelse på ca 20% og objektiv responsrate til konvensjonell kjemoterapeutiske regimer utvalg kan forbedres fra 20% til 40% [1], [3]. Foreløpig er cisplatin-basert terapi fortsatt mye brukt i kliniske innstillinger for avansert og metastatisk GC. I tillegg, for HER2-neu overekspresjon mage adenokarsinomer, trastuzumab (Herceptin) i kombinasjon med kjemoterapi forlenger median total overlevelse fra 11,1 måneder (kjemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. Tatt i betraktning den høye dødeligheten av GC, er det fortsatt stort udekket medisinsk behov for å finne den følsomme og pålitelig biomarkør for tidlig diagnose av GC og potent terapeutisk mål for behandling av GC.
CDH17, ett medlem av 7D-cadherin super, presenterer i foster lever og mage-tarm under embryogenese, og dermed er også navngitt som lever og tarm cadherin (LI cadherin). CDH17 er overuttrykt i leverkreft [5], [6], magekreft [7], kreft i bukspyttkjertel ductal [8] og tykktarmskreft [9] – [11]. Som rapportert, CDH17 var hovedsakelig til stede på cellemembranen, og fraværende i normale mage vev og den positive hastigheten var nesten 78,4% [12]. Ekspresjonsnivået av CDH17 var karakteristisk for den avanserte gastrisk karsinom som var assosiert med dårlig prognose [13]; og det var også signifikant assosiert med den lymfeknutemetastase i magekreft [14]. Knockdown CDH17 med lentivirus-mediert miRNA inhiberte proliferasjonen, etterlevelse, tumorvekst og metastasering av BGC823 humane magecancerceller både in vitro og in vivo [15] – [17]. CDH17 har vært foreslått som et onkogen, og en nyttig markør for diagnose av magekreft [18]. Det er blitt påvist at CDH17 mediert onkogene signalisering i HCC har sammenheng med Wnt signalveien [5]. Nylig ble det rapportert at CDH17 indusert tumordannelse og lymfatiske metastaser i GC gjennom aktivering av NFkB signalveien [19]. CDH17 regulert α2β1 intealiserte til indusere bestemt brennvidde heft kinase og Ras-aktivering, noe som førte til økningen i celle adhesjon og spredning i tykktarm kreft celler [11]. Men den viktigste rollen og signalering mekanisme CDH17 i GC er fortsatt uklart. I denne studien, for å validere CDH17 som et potensielt terapeutisk mål for GC og å undersøke signal mekanismen for CDH17 i GC, karakterisert vi ekspresjonen av CDH17 i humane cellelinjer GC og GC kinesiske vev, kontrollert påvirkning av CDH17 knockdown eller over uttrykket på tumorigent og metastatisk effekt av GC cellelinjer, og utforsket de mulige signal kaskader knyttet til CDH17. Vi observerte en høy CDH17 uttrykk i humane GC cellelinjer og kinesiske GC vev, og en klar hemming i celle spredning, migrasjon, vedheft, kolonidannelse, apoptose induksjon, og cellesyklus arrest etter å kneble av CDH17 i humane GC cellelinjer. Videre viser våre resultater for det første kapasitet CDH17 for å regulere aktiviteten av integrin-Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien for celleproliferasjon i GC, og tyder på at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for videre forskning.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
bruk og stell av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), Roche R D-senteret (Kina). De menneskelige GC vevsblokker med tilhørende tilstøtende vevsblokker ble hentet fra Shanghai biochip Company, en CRO service selskap. Alle menneskelige vev ble samlet inn med skriftlig samtykke fra kilde pasienter. Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC, USA, japansk Innsamling av forsknings Bioressurser, og Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi, Chinese Academy of Science.
Cellelinjer og reagenser
Alle cellelinjene fra amerikansk Typisk Cell Collection (ATCC), japansk Innsamling av forsknings Bioressurser, og Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, ble Chinese Academy of Science opprettholdt i respektive vekstmedium som ble anbefalt av leverandørene. PMD-18T-CDH17 plasmid var fra Sino Biological Inc. Tetracycline (Tet) var fra Sigma, Cell Counting Kit-8 var fra Dojindo Molecular Tech. Human plasma fibronektin var fra R Revers primer: 5′-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3′) av miRNAs viste den høyeste effektivitet og ble valgt til per skjema BP rekombinasjon å skaffe pENTR-miRNA. Dette innlegget vektor ble så brukt i LR rekombinasjon med pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr K4920-00) for å få pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus hjelp Gateway® teknologi (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus ble anvendt til å transdusere TR-stabile AGS-celler og 200 ug /ml Zeocin (Invitrogen, katalog nr. R250-05) ble anvendt for å selektere for en stabil Tet-regulerte CDH17 shRNA ekspresjons-celler kalt TR-AGS-CDH17_KD stabil celle linjen.
Stabile MGC-803 celler med Tet-regulert overekspresjon av CDH17 genet
i korthet ble CDH17 sekvensen amplifisert fra PMD-18T-CDH17 plasmid (Sino Biological Inc.) og subklonet inn IRES -EGFP vektor for å oppnå CDH17-IRES-EGFP ved bruk av primerne: forover primer: 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 «; Revers primer: 5»-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 «). Denne konstruksjonen ble brukt til å utføre BP rekombinasjon å få pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Deretter trer vektor og pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr V370-06) vektor ble brukt i LR rekombinasjon å få pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Da lentivirus ble produsert for å omsette TR-MGC-803 stabile celler og 4 mikrogram /ml blasticidin ble brukt til å velge for en stabil Tet-regulerte CDH17 genuttrykk celler kalt TR-MGC-803-CDH17_Over stabil cellelinje.
celleproliferasjonsanalyse
for siRNA transient transfeksjon assays, ble cellene sådd ut i 10 cm plate med en tetthet på 5 x 10
6 celler /skål og transfektert med 20 nM siCDH17 eller krafse siRNA. Etter 48 timer inkubering ble cellene tilknytningen og overført til 96-brønn plate med en tetthet på 3000 celler /brønn, og deretter inkubert i en annen 72 timer. Den cellenes levedyktighet ble analysert med CCK-8 kit (Donjindo, Japan). For TR-induserbar AGS-CDH17_KD stabile celler, ble cellene sådd ut i 60 mm x 15 mm skål og behandlet med eller uten Tet (0, 2,5 og 5,0 ug /ml) i forskjellig tid. Cellene ble høstet etter 2, 3, 4, 5 og 6 dager, og celletallet ble talt ved ScepterTM Håndholdt Automated Cell Counter (millipore). For spredning redning assay, ble TR-induserbare AGS-CDH17_KD stabile celler sådd ut i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dager, med eller uten 5,0 ug /ml Tet. For redning gruppe, ble kulturmedium inneholdende Tet erstattet med friskt medium på dag 4, og cellene ble fortsatt dyrkes til dag 10. Cellene i hver gruppe ble høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celle nummer telling og Western blotting-analyse.
Cell migrasjon analysen
TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i 10 cm tallerken og behandlet med eller uten Tet (5 mikrogram /ml). Etter 120 timers dyrkning ble cellene samlet og tellet. 0,1 ml av cellesuspensjon (1, 2, 3 x 10
4 celler /ml) ble tilsatt til det øvre rom av kammeret. 0,6 ml 10% FBS-medium ble tilsatt til det nedre rom som et lokkemiddel chemo. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene fiksert med 90% EtOH ved 4 ° C i 30 min og deretter beiset med 0,1% krystallfiolett i 15 min. De ikke-migrerende celler ble fjernet fra den øvre flate av transwell membran med en bomullspinne. De fargede cellene ble deretter fotografert og tellet under lysmikroskopi.
Cell vedheft analysen
TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i 10 cm tallerken og behandlet med eller uten Tet (5 mikrogram /ml). Pre-belegg på 96-brønners plater ble utført ved inkubering av brønnene med 25 ug /ml fibronektin ved 4 ° C over natten. For å redusere ikke-spesifikk binding, ble 1% bovint serumalbumin (BSA) tilsatt til hver brønn og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C, ble BSA vasket to ganger med sterilt PBS. 120 timer etter knockdown CDH17 med Tet ble cellene oppsamlet og utsådd i pre-belagte 96-brønners plater med 4 x 10
4 celler /brønn. 2 timer senere, ble ikke-adherente celler fjernet ved vasking med steril PBS for to ganger. De adherente celler ble analysert ved hjelp av CCK-8 kit.
kolonidannelse assay
For det første, 6-brønns plater ble fremstilt med bunnagarlag (0,6% gel). Deretter, TR-AGS-CDH17_KD celler eller siCDH17 transfekterte celler (som proliferasjonsanalyse) ble suspendert i fullstendig medium inneholdende 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og sådd inn i stilles 6-brønns plate og dyrket i 7 eller 14 dager. Celler ble farget med tiazolyl blå tetrazolium-bromid (MTT) i 2 timer. Antallet cellekolonier ble talt.
Cell syklus analyse
TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i en seks brønn plate på 1,0 × 10
5 celler /brønn og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere ble cellene høstet med trypsin og fiksert med EtOH ved 4 ° C i 3 timer. Da celler ble sentrifugert ved 1500 g i 5 minutter og vasket med PBS. Re-suspenderes cellene i RNase /PBS-oppløsninger (20 ug /ml), inkubert ved 37 ° C i 15 min, deretter tilsatt PI /PBS-oppløsninger (20 ug /ml) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, inspisert fargede celler med BD FACS Calibur og analysert dataene med BD Cellquest Pro-programvaren.
apoptose analyse
TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i en seks brønn plate på 1,0 × 10
5 celler /brønn og ble behandlet med 5 pg /ml Tet. 120 timer senere ble cellene høstet med trypsin og vasket med forhåndsavkjølt PBS en gang. Celler ble resuspendert i 500 pl 1 x bindingsbuffer og 5 ul PI og 5 ul AnnexinV (BD) ble tilsatt. Etter inkubering i mørket (romtemperatur) i 10 minutter, ble de fargede cellene undersøkes med BD FACS Calibur. De innsamlede dataene ble analysert med BD Cellquest Pro-programvaren.
Western blotting-analyse
Celler ble lysert ved RIPA buffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholate og 10 mM Hepes (pH 7.4)] inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) metoden (Pierce). Tretti mikrogram protein per prøve ble kokt i lasting buffer og elektroforese i 8-12% gradient SDS polyakrylamidgeler (Invitrogen) og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble probet med antistoffer (CDH17, Inte ß1, integrin β4, integrin β5, p-p53, p53, p21 var fra R 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
Expression profilen til CDH17 i magekreft
Uttrykket nivået av CDH17 proteiner i 30 cellelinjer ble kategorisert. inn i 4 grupper basert på data fra tetthet analyse optisk mot beta-aktin. AGS-cellelinjen ble brukt som indre standard for å unngå avvik mellom geler. Over 66% av GC-cellelinjer (20/30) ble CDH17 positive (figur 1A).
(A) Tretti gastriske cellelinjer lyseres og utsatt for Western blot-analyse (til venstre). Alle testede celler er inndelt i fire uttrykk nivå av CDH17, Høy Median (Medi), Low, Ikke bestemt (ND), basert på tetthet analyse optisk mot beta-aktin (høyre); (B) Representant IHC bilder fra pasient 1 (godt differensiert gastrisk kreftvev), pasient 2 (dårlig differensiert gastrisk kreftvev) og pasient 3 (tilstøtende normalt vev); CDH17 viste klar membran beliggenhet i svulst eller tilstøtende vev; (C) Representant IHC bilder av positive CDH17 flekken med scoring fra + til +++.
Uttrykket og lokalisering av CDH17 i primær vev parafin delen ble oppdaget av immunhistokjemi på microarray. Sammenlignet med slides farget av normal mus IgG, CDH17 mAb farging ble vist et klart cellemembranen lokalisering (figur 1B). Blant 216 tilfeller med bekreftet patologi diagnose rapporten, 73,6% kreft vev (159/216) næret positiv CDH17 flekken med scoring fra + til +++, mens 37% positive CDH17 flekken i respektive tilstøtende normalt vev (tabell 1). I CDH17 positive tilfeller har ekspresjonsnivået av CDH17 positiv korrelasjon med lymfeknutemetastase. Imidlertid er ekspresjonsnivået omvendt forbundet med gastrisk vegg invasjon, tumor fjern metastase og tumor TNM etapper. Vår observasjon var i samsvar med tidligere kliniske rapporter [20] – [22]. Blant CDH17 positive tilfeller, kreftvevet utstilt sterkere farging av CDH17 (32,1% som scoring +, 25,2% som scoring ++ og 42,8% som scoring +++) enn tilstøtende normalt vev (62,5% som scoring +, 21,3% som scoring ++ og 16,3% som scoring +++). Mens ingen signifikant sammenheng ble observert mellom flekken scoring og klinisk stadium. Tar alt dette bevis sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidlig magekreft i kinesiske populasjoner.
RNAi-mediert slå ned CDH17 på GC cellelinjer viste undertrykkelse av celleproliferasjon og kolonidannelse in vitro
Basert på resultatene av CDH17 uttrykk profil i et panel av GC cellelinjer (figur 1A), AGS (høyere CDH17), BGC-823 (lavere CDH17) og HGC-27 (ingen CDH17) cellelinjene ble valgt for ytterligere in vitro celle funksjonell vurdering med RNAi-mediert CDH17 stanse. Western blotting viste at AGS cellene hadde høyt CDH17 protein nivå og uttrykk for CDH17 ble slått ned nesten helt av siCDH17. BGC823 cellene hadde lav CDH17 protein nivå og HGC-27 hadde ingen CDH17 protein (figur 2A). Sammenlignet med de rykke ut kontrollcellene, CDH17 slå ned hadde liten effekt på den proliferative evne BGC823 og HGC27 celler, mens hatt dramatisk effekt på AGS (med 60% på 72 timer, figur 2B). Soft agar-analysen viste at evnen til å danne koloni ble hemmet i AGS celler hvis CDH17 var banke ned (med 66% ved 14 d), men i BGC823 celler og HGC27 celler, CDH17 slå ned hadde liten effekt på kolonidannelse evne (Figur 2C). Det var ikke åpenbar forskjell mellom BGC823 celler (lavt CDH17 nivå) og HGC-27cells (non-CDH17) i hemming av spredning og kolonidannelse indusert av siRNA CDH17 knockdown.
(A) siRNA knock-down effektivitet ble bekreftet ved Western blotting 48 timer etter transfeksjon med 20 nM siCDH17 eller rykke siRNA; (B) proliferasjonsanalyse. Cellene ble transfektert med 20 nM siCDH17 eller rykke siRNA i 10 cm retter. 48 timer senere ble cellene suspendert og reseeded i 96-brønners plater. Cellen levedyktighet ble analysert med CCK-8 celleproliferasjon kit 72 timer etter seeding. Forsøket ble utført i triplikat, og dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik; (C) kolonidannelse assay. Cellene ble transfektert med siCDH17 som proliferasjonsanalyse og reseeded inn i 6-brønners plater. Koloniene ble tellet under mikroskop etter farget med MTT 14 dager etter såing. Forsøket ble utført i triplikat, og de typiske bildene ble vist. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
stabile cellelinjer som bærer TR induserbar knockdown av CDH17 i AGS celler og overekspresjon av CDH17 i MGC-803 celler
Målet sekvens i exon13 (90-2) ga over 90% reduksjon i mRNA nivå (figur 3A). Deretter brukte vi pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus å omsette TR-AGS stabile celler og fikk en stabil Tet-regulert uttrykk shRNA av CDH17 genet celler (TR-AGS-CDH17_KD) som CDH17 proteinnivået ble redusert omtrent 90% etter indusert med 5 ug /ml Tet (figur 3B). Den pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus ble brukt til å omsette TR-MGC-803 stabile celler og valgt med blasticidin å få en stabil Tet-regulert uttrykk CDH17 genet celler (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Overekspresjon av CDH17 i denne stabil celle ble bekreftet på proteinnivået ved Western blotting (figur 4A).
Different-analyse ble beskrevet i materialer og metoder. (A) Real-time PCR-analyse viste dunke ned av CDH17 på mRNA nivå i AGS celler (C), AGS celler transient transfektert med pcDNA
TM6.2-GW /EmGFP-scramble MIR plasmid (NC) og pcDNA
TM6.2-GW /EmGFP-CDH17 MIR plasmider (90-1, 90-2, 90-3 og 90-4); (B) Western blotting for virkningen av CDH17 knockdown anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av Tet i 48 timer i TR-AGS-CDH17_KD celler; (C) Celleproliferering, migrasjon (6 dager etter behandling), adhesjon (6 dager etter behandling **
P
. 0,01). Og kolonidannelse i soft agar (7 dager etter behandling **
P
0,01); (D) sprednings redning analysen. TR-induserbare AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dager, med eller uten 5,0 ug /ml Tet. For redning gruppe, ble kulturmedium inneholdende Tet erstattet med friskt medium på dag 4, og cellene ble fortsatt dyrkes til dag 10. Cellene i hver gruppe ble høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celle nummer telling (til venstre) og Western blotting-analyse (til høyre); (E) cellesyklusanalyse etter at cellene ble behandlet med 5,0 pg /ml Tet i 6 dager; og (F) Celle apoptose-analyse etter at cellene ble behandlet med 5,0 pg /ml Tet i 6 dager ved strømningscytometri
(A) Western blotting viste induksjon effektiviteten av CDH17 overekspresjon.; (B) Tumorvekst i nakne mus. Når tumorvolumet nådde ~ 100 mm
3, drikkevannet ble erstattet med 2,5% sukrose inneholdende 0,2 mg /ml Tet eller ikke. *
P
0,05, Tet-on gruppe vs Tet-fri gruppe; (C) Western blotting-analyse av xenograft tumor vev.
knockdown av CDH17 indusert hemming i celle spredning, migrasjon, vedheft, kolonidannelse og induksjon i cellesyklus og apoptose
TR-AGS celler (kontrollceller) og TR-AGS-CDH17_KD celler ble brukt for å vurdere de mulige cellulære funksjonelle effekter av shRNA-mediert CDH17 knockdown i AGS celler. TR-AGS-CDH17_KD-celler ble behandlet med 5 pg /ml Tet viste en reduksjon i celleformering (med 75,8% etter 5 dager), cellemigrering evne (med 68,1% ved 16 timer), celleadhesjon evne (med 46,8% ved 30 minutter ) og kolonidannende evne (med 92,7% ved 7 dager) sammenlignet med Tet fri (figur 3C). I spredning redning studie, kan CDH17 knockdown i TR-AGS-CDH17_KD celler indusert av Tet bli reddet ved å fjerne Tet. Etter å ha fjernet Tet på dag fire, ble gjen uttrykk for CDH17 observert på dag 8 og 10 av kultur i CDH17 shRNA knockdown AGS celler. Re-uttrykk for CDH17 kunne redde spredning evne til TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3D). Sammenlignet med Tet frie TR-AGS-CDH17_KD celler, Tet på celler viste en signifikant økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2 /M-fase og en dramatisk avdøde prosentandelen av celler i S-fasen (figur 3E). I mellomtiden har vi også observert at antallet av apoptotiske celler (med 52,2% etter 5 dager) ble økt ved nedregulering av CDH17 i TR-AGS-CDH17_KD celler (figur 3F). Ingen signifikant forskjell ble funnet i TR-AGS stabil cellelinje med eller uten Tet inkubasjon.
Overuttrykte av CDH17 fremmet veksten av tumorxenotransplantater i nakne mus
TR-MGC-803-CDH17_Over celler ble injisert subkutant inn i flankene av BALB /c nakne mus for å danne fast tumor. Ekspresjonen av CDH17 var under kontroll av Tet i drikkevann. Resultatene viste at etter 35 dager induksjon, Tet-indusert gruppe (tumor volum = 1849,08 ± 423.46m3) viste en 2,27 ganger høyere vekst fremgang rente versus Tet-fri gruppe (tumor volum = 814,04 ± 234.69m3) (p 0,05) ( Figur 4B), og indusert CDH17 ekspresjon i tumorvevet kan bli analysert ved Western blotting (figur 4C). Det indikerte at CDH17 spiller en viktig rolle i kreftutvikling av magekreft. Vi har også brukt TR-AGS-CDH17_KD celler for å observere om lyddemping av CDK17 kan påvirke tumorgenisiteten i nakne mus. Dessverre, svulsten ta sats på denne cellelinjen var svært lav, og ingen pålitelig in vivo resultater ble observert med TR-AGS-CDH17_KD cellelinje.
Fastsettelse relaterte protein nivåer etter knockdown CDH17 av antistoff arrays analyse
i henhold til tumorigene effekter (inhibering av celleproliferasjon, kolonidannelsen, og tumorvekst in vivo) og metastatiske effekter (inhibering av cellemigrering og adhesjon) av CDH17 knockdown, velger vi tre antistoff arrays (fra R (B) Endre forholdet mellom beslektede proteiner mellom Tet-on og Tet-frie celler; (C) Endring av relaterte proteiner som finnes i antistoff rekke analysen ble bekreftet ved hjelp av Western blotting-analyse.
knockdown av CDH17 i AGS downregulated betainte og Ras /Raf /MEK /ERK-signalveien
protein~~POS=TRUNC endringer fra antistoff rekke analysen ble bekreftet ved Western blotting-analyse. Resultatene viste en signifikant reduksjon av integrin β1, β4, β5 og fosfo-ERK i CDH17 knockdown AGS-celler, men ingen signifikant endring i total ERK (figur 5C). Deretter vurderte vi å involvere andre Ras /Raf /MEK /ERK signalveien komponenter. Knockdown av CDH17 resulterte i nedregulering av Raf, fosfo-MEK og ERK fosfo-proteiner (figur 5C). Fra TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo studie, observerte vi at overekspresjon av CDH17 forbedret integrin β1, β4, β5 uttrykk og ERK-aktivering (figur 4C), og det er i samsvar med ovennevnte funn.
