Abstract
Bakgrunn
BORIS Twitter /
CTCFL
er en paralogue av
CTCF
, de store epigenetisk regulator av virveldyr genomer. BORIS normalt uttrykkes bare i kjønnsceller, men er abnormt aktivert i en rekke kreftformer. Mens nyere studier vist at BORIS er en transkripsjonen aktivator av testis-spesifikke gener, er lite allment kjent om dens biologiske og molekylære funksjoner.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at
BORIS
er uttrykt som 23 isoformer i germline og kreftceller. Isoformene består av alternative N- og C-termini i kombinasjon med varierende mengder sink fingre (ZF) i det DNA-bindende domene. Mønstrene av
BORIS
isoform uttrykk er tydelig i kjønns og kreftceller. Isoform uttrykk aktiveres ved nedregulering av
CTCF
, oppregulert ved reduksjon i CpG metylering forårsaket av inaktivering av DNMT1 eller DNMT3b, og undertrykt av aktivering av
p53
. Studier av ectopically uttrykt isoformer viste at alle er oversatt og lokalisert til kjernen. Bruk av testis spesifikke cerebrosid sulfotransferaseaktivitet (
CST)
promotoren og
IGF2 /H19
imprinting kontrollområdet (ICR), ble det vist at bindingen av BORIS isoformer til DNA mål
i vitro
er metylering følsom og er avhengig av antall og spesifikke sammensetning av ZF. Evnen til å binde mål-DNA, og nærværet av en spesifikk lang aminoenden (N258) i forskjellige isoformer er nødvendig og tilstrekkelig for å aktivere
CST
transkripsjon. Sammen sekvens analyser avslørte en evolusjonær briste hos pattedyr med sterk bevaring av BORIS isoproteins blant primater.
Konklusjoner
Den omfattende repertoar av skjøtes
Boris
varianter hos mennesker som konferere distinkte DNA binding og transkripsjonelle aktiveringsegenskaper, og deres differensial mønstre av ekspresjon hos kjønnsceller og neoplastiske celler tyder på at genet er involvert i en rekke funksjonelt viktige aspekter av både normal gametogenese og kreftutvikling. I tillegg kan et utbrudd i isoform diversifisering være evolusjonært knyttet til unike aspekter av primater arts
Citation. Pugacheva EM, Suzuki T, Pack SD, Kosaka-Suzuki N, Yoon J, Vostrov AA, et al. (2010) Den strukturell kompleksitet av Human
BORIS
Gene i gametogenesis og kreft. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10,1371 /journal.pone.0013872
Redaktør: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, USA
mottatt: 02.07.2010; Godkjent: 11 oktober 2010; Publisert: 08.11.2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av egenutført forskning program for NIAID og av egenutført tilskudd fra NIH Office of AIDS forskning til AVS og DL de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
BORIS plakater (Bror av regulatoren av trykt nettsteder) er en paralog av multifunksjonelle
CTCF
genet, som er involvert i lesing epigenetiske merker, transcriptional gene aktivering og undertrykkelse, X-kromosom inaktivering, kromatin sløyfe formasjonen gjennom dimerisering og i global tredimensjonale genomet organisasjon [1], [2], [3], [4], [5]. Mens de to proteinene har en sentral 11 sinkfingeren (ZF) DNA-bindende domene, de har tydelig amino- og carboxy-endene [2], [6]. I normale vev, de to paraloge gener viser gjensidig utelukkende uttrykk mønstre:
BORIS
mRNA er rikt på mannlige kjønnsceller, særlig i primær spermatocytter og runde spermatider, der
CTCF
, som er uttrykt overalt i somatiske celler, er undertrykt [2]. BORIS fungerer som transkripsjonen aktivator av flere testis-spesifikke målgener i løpet av spermatogenese, mens CTCF undertrykker de samme målene i somatiske celler [7], [8], [9]. I kjønnsceller, ble BORIS foreslått å være involvert i tilbakestilling av imprinting på
Igf2 /H19
imprinting kontrollområdet (ICR) [10]. I motsetning er CTCF den kjente leseren og beskytter av
Igf2 /H19
imprinting karakterer i somatiske celler [11], [12], [13], [14], [15]. Den segregering av
BORIS Hotell og
CTCF
uttrykk i ulike celletyper hos pattedyr er strengt kontrollert. Normalt CTCF, p53, og CpG metylering undertrykke
BORIS
transkripsjon i somatiske celler, effektivt begrense sitt uttrykk til testikkelkjønnsceller [8], [16], hvor fraværet av CTCF [2] og flere bølger av genome-wide demetylering skape forutsetninger for
BORIS
aktivering.
BORIS
er abnormt aktivert i mange typer kreftceller, dens uttrykk sammenfallende med tap av CpG metylering, den første epigenetisk endring identifisert i kreftceller [2], [6], [17]. Avvikende uttrykk for
BORIS
i kreftceller sannsynlig resulterer i en konkurranse mellom Boris og CTCF proteiner for binding til CTCF DNA-bindende målse (CTSes). BORIS kan forstyrre CTCF funksjoner i kreftcellene ikke bare i kraft av å ha den identisk ZF-bindende domene og overlappende DNA-bindende spesifisitet, men også på grunn av sin distinkte amino- og carboxy-endene som sannsynligvis gi et diskret sett av funksjoner molekyl [2] . Ja, både CTCF og BORIS binde
MAGE A1
promoter, men med motstridende resultater: mens CTCF fungerer som en transkripsjons repressor, BORIS fungerer som en aktivator [8]. En fersk studie viste også at BORIS og CTCF utføre forskjellige transkripsjons funksjoner ved binding til arrangøren av mus testikkel spesifikke
CST
spleisevariant [9]. I konklusjonen, selv om molekylære funksjoner av BORIS i kreft gjenstår å bli studert i dybden, avvikende co-uttrykk for
CTCF Hotell og
BORIS
er en av genekspresjon signaturer karakteristisk for mange kreftformer [6 ].
Tidligere studier har vist at den evolusjonære veksten av
BORIS
i amniotes skjedde før divergens av reptiler og pattedyr, og kan tilskrives en innledende duplisering av hele
CTCF
sekvens [18]. Mens BORIS er allment uttrykt i reptiler og monotremes, ble uttrykket vist seg å være gonade-spesifikk i pungdyr og eutherians, noe som indikerer at BORIS ble funksjonelt spesialiserte løpet pattedyr evolusjon i konsert med utviklingen av genomisk imprinting [18]. Mens
CTCF
er sterkt konservert fra Drosophila til mennesker [18], [19], [20],
BORIS
koding og ikke-kodende sekvenser er evolusjonært plast [18]. Faktisk er en sammenligning av amino- og carboxy-endene av humant
BORIS
med ortologer i andre arter viser relativt lav likhet, 32,3% og 23,7%, henholdsvis, mens den tilsvarende likheten av human
CTCF
med andre ortologer er 90,1% og 80,7%, henholdsvis. Likevel har BORIS ZF regionen 80,4% identitet til sine ortologer, ligner på 99,5% bevaring for CTCF ZFS [18]. Den raske utviklingen av
BORIS
er ikke begrenset til protein-kodende sekvenser. Bemerkelsesverdig, strukturen av locus som en helhet er merkbart forskjellig selv mellom mus og mennesker, noe som kan tyde på et spesialisert sett av funksjoner og /eller skjøting av isoformer. Den menneskelige
BORIS
gen strekker seg over 29 kb på 20q13 og består av 11 eksoner, hvorav 10 er koding [2]. Dette kan tillate generering av en rekke forskjellige isoformer ved alternativ spleising. Evolusjonært, er alternativ spleising den mest brukte mekanisme for å øke koding kapasitet på mRNA transkripter for å tillate produksjon av ulike protein isoformer med forskjellige aktiviteter.
Det første bevis for alternativ
Boris
transkripsjoner kom fra den siste demonstrasjonen at menneskelig
BORIS
uttrykkes fra minst tre alternative arrangører benytter fem forskjellige 5 «UTR [16]. I denne studien har vi preget 23
BORIS
spleise varianter med forskjellige uttrykk profiler i normale germline og kreftceller, og samtidig stille differensial DNA bindende aktiviteter og varierende transkripsjons egenskaper. Således
BORIS
er uttrykt som et repertoar av alternative transkripter og proteiner, noe som indikerer at alternativ spleising frembringer en kompleks mekanisme for BORIS-mediert funksjon i kimlinje og kreftceller.
Resultatene
flere
Boris
transkripsjoner er uttrykt i menneskelig testikkel, ES-celler og cellelinjer fra ulike typer kreft
Vi har tidligere vist at uttrykk for
BORIS
er begrenset til testis vev og kreftceller, med ekspresjon avhengig av CpG metylering status av alternative
BORIS
promotorer [8], [16]. I analysere
CTCF Hotell og
BORIS
uttrykk i menneskelig testikkel, embryonale stamceller (ES) celler, og flere kreftcellelinjer ved RT-PCR, var vi i stand til å forsterke full-lengde ZF- koding regioner av både gener. Bare et enkelt PCR bånd spesielt for
CTCF
ZF domenet ble påvist i alle celletyper undersøkt; ble imidlertid flere PCR band som genereres av primere forsterke
BORIS
regionen tilsvarer ZF domene (Fig. 1a). Sekvensanalyser av klonede
BORIS
PCR produktene identifisert en rekke alternative transkripsjoner med ulike kombinasjoner av ZF eksoner som ble generert på grunn av utnyttelse av alternative spleiseseter (Fig. 1a). Overflod og distribusjon av
BORIS
transkripsjon varianter skilte seg blant kreftcellelinjer og i testikkel, noe som tyder på forskjellige mekanismer for regulering av
BORIS
genet i normale germline og kreftceller.
(A) Total RNA fra angitte cellelinjer og testikler vev ble analysert ved RT-PCR bruker primere designet for å forsterke full-lengde
CTCF Hotell og
Boris
ZFS domener. Sekvensene til primerne er vist i tabell S1. Nestet PCR ble utført med 20 og 35 sykluser for første og andre runde, henholdsvis. Kildene for RNA er vist på toppen av hver gel. Piler peke på enkelt
CTCF
transkripsjon og flere
Boris
alternative transkripsjoner. (B) 3 «RLM-RACE strategi for kloning alternativt spleisede
Boris
former. Tre
Boris
alternative arrangører og 12 eksoner med ikke-kodende sekvenser (hvite bokser) eller sekvenser (grå bokser) vises. Total RNA fra voksen human testikkel og K562-cellelinjen ble behandlet med GeneRacer PCR kit for amplifikasjon av full-lengde cDNA. Den første runden av PCR ble utført med tre frem gen-spesifikke (GSP) primere A, B og C som ble utviklet for å identifisere mRNA uttrykt fra tilsvarende alternativ
Boris
arrangører A, B eller C, henholdsvis. 3′-primeren GeneRacer festet til poly A-halen ble anvendt som en revers primer. l pl av den første runde PCR-blandingen ble anvendt som et templat for å utføre nested PCR med tre frem nested genspesifikke (NGSP) primere A1, B1 og C1. (C) 3 «RLM-RACE ble utført på menneskelige testikler og K562 cellelinje. Multiple
Boris
transkripsjoner ble oppdaget i begge prøvene. PCR-produkter fra den nestede PCR er vist adskilt på 1% agarosegeler. M er størrelsen markør.
Å vite at CpG hypometylering er involvert i
BORIS
aktivering [2], [8], [16], vi sammenlignet
BORIS
uttrykk i HCT116 tykktarmskreft cellelinje til HCT116-celler behandlet med 5aza-dC, og HCT116 bærer en dobbel knockout (DKO) av
DNMT3b Hotell og
DNMT1 product: [21]. En dramatisk reduksjon i CpG metylering i HCT116 DKO og HCT116-celler behandlet med 5aza-dC, som er beskrevet tidligere [21], korrelert med forekomsten av multiple
BORIS
-spesifikke RT-PCR-produktene (fig. 1A), hvilken var fraværende i foreldre HCT116 cellelinje. Interessant, ble humane ES-celler funnet å uttrykke minst to alternative
Boris
transkripsjoner, bekrefter
BORIS
uttrykk i ES cellelinjer som tidligere demonstrert ved immunfluorescens [22]. Vi konkluderer derfor med at mens
CTCF
uttrykkes som et enkelt transkript på human testikkel og cancere,
BORIS
er uttrykt som flere isoformer i testiklene, ES-celler og i kreftcellelinjer, nærmere bestemt i celler med økt DNA hypometylering.
tjuetre alternativt spleiset
Boris
isoformer er uttrykt i testikkel og i kreftceller
etter oppfordring fra våre tidligere identifisering av fem alternative 5′-UTR spleising
Boris
varianter generert fra tre alternative
Boris
arrangører (A, B og C) [16], gjennomførte vi en skjerm full lengde alternativt spleiset
Boris
transkripsjoner i menneskelig testikkel og K562 kreftcellelinje, cellene med de høyeste nivåene av
BORIS
uttrykk. For å isolere full lengde
Boris
alternative transkripsjoner, benyttet vi 3′-RLM-RACE tilnærming vist i figur 1B. Vi forsterket flere
BORIS
RT-PCR-produkter som deretter ble klonet og sekvensert (Fig. 1C). Fra dette har vi identifisert 19 tidligere ukjente
Boris
spleisevarianter (fig. 2). De to viktigste kildene til heterogenitet i
Boris
mRNA var bruken av alternative arrangører og spleiseseter. Vi har også observert differensial bruk av distinkte 5′- og 3′-UTR, så vel som alternative oversettings rammer i amino- og karboksy-terminale kodende områder. Justering av
BORIS
genomisk sekvens med alternative transkripsjoner avslørte at exon-intron grensene hadde klassiske spleisesete sekvenser (tabell S4). De fleste av de alternative
Boris
transkripsjoner besatt en polyA hale plassert 20-30 bp nedstrøms fra den kanoniske polyadenyleringssignal, AAUAAA (File S1), noe som indikerer at
Boris
isoformer nådd stadiet av uttrykk som modne mRNA.
(A) Skjematisk illustrasjon av
BORIS
gen med tre alternative arrangører og seksten eksoner som brukes til produksjon av 23 isoform mRNA. Eksoner størrelser er vist under ordningen, med minimum og maksimum antall nukleotider for de alternative eksoner. Start- og stopp kodoner for ORF er angitt som ATG og Stopp, henholdsvis. Den første
BORIS
transkripsjon representerer opprinnelig klonet
BORIS
form, her betegnet som
B0
;
Boris
transkripsjoner nedenfor er romanen klonet isoformer. På venstre er navnene på
Boris
isoformer, tilsvarende skjematisk fremstilling av gitte transkripsjoner. På høyre, de seks
Boris
underfamilier, fordelt på grunnlag av tilsvarende 3 «endene, indikeres. De røde og blå linjer på toppen eller bunnen av skjematisk fremstilling av isoformer skildre plasseringen av TaqMan prober. Translaterte regioner er representert ved åpne bokser. Introner (tynne linjer) vises ikke til eksakt skala. (B) Alternativ spleising oppretter en ny ZF i
C6
isoform. Aminosyresekvens sammenligninger av ZF 4 av
B0 Hotell og nytt alternativ ZF 4/9 av
C6, etter som kombinerer den første halvdelen av ZF 4 og den andre halvparten av ZF 9. (C) alternativ spleising skaper en ny koding spacer mellom ZFS 5 og 6 i
A3
isoform.
Boris
isoformer ble kategorisert i henhold til arrangøren bruk (fig. 2A ). Isoformer drevet fra arrangøren A inkludert
BORIS A1
,
A2
,
A3, A4, A5
, og
A6
. Sammenlignet med opprinnelig beskrevet
BORIS
transkripsjon [2], som nå er utpekt som
BORIS B0
isoform, isoformer
A1 Hotell og
A2
inne alternative 5 «UTR, men kodet for det samme BORIS polypeptid (fig. 2A, Tabell S3). Isoform
A3
hadde flere nye funksjoner som skilte den fra
B0
inkludert en lang ikke-kodende 5 «UTR og utelukkelse av ekson 6 på grunn av alternativ spleising. Dette resulterte i nærvær av kun 9 ZFS, snarere enn den 11 av
BORIS B0
, men også fremstilt en ny lang avstandsstykke mellom ZF5 og ZF8 (fig. 2A, C). For isoformer
A4 Hotell og
C2
, som både koder samme polypeptid, ORF fortsette inn i intron 4 inntil en alternativ stoppkodon resulterte i avkutting av ZF domene mens produsere et alternativ COOH-terminal . Isoformer
A5
og
A6
begge kodet 10 fulle ZFS og halvparten av ZF11, som er alternativt spleiset fra ekson 8 til nye eksoner 9a eller 9a (1), henholdsvis, noe som resulterer i to alternative karboksy -termini. Isoformen
B1
har de samme 10 koding eksoner som
BORIS B0
prototype, men besatt en ekstra ekson 11, som kodet en alternativ karboksyterminal. I tillegg er noen isoformer hadde alternativ amino-endene på grunn av utnyttelse av ulike startkodonene, som følge av alternativ spleising av ekson Eb til ekson 2 (i
B3 Hotell og
B4
) eller til ekson 3 (i
B2, B5, B6, B7
).
De fleste overraskende, bare 7 av 23
Boris
isoformer kodet en full-lengde 11 ZF DNA-binding domene, med antallet ZF i de andre isoformer i området fra 1 til 10 (File S1, Tabell S3). Som vist ved de følgende eksempler, reduksjon i antall ZFS resulterte fra bruken av alternative spleiseseter og stoppkodonene. Isoformen
C5
hadde bare en ZF, og en alternativ karboksy-terminus som følge av spleising fra midten av ekson 3 til ekson 10b. Mens isoform
C8
inneholdt alle 11 eksoner, tilstedeværelse av et ekstra ekson 6a med en i leseramme stoppkodon resulterte i bare seks ZFS. Bemerkelsesverdig, spleising fra ekson 4 til ekson 8 i isoform
C6
opprettet en ny hybrid ZF består av halvparten av ZF 4 og halvparten av ZF 9. Dette øker muligheten for at den nye ZF kunne gi ny DNA-bindende egenskaper til dette isoform (fig. 2B). Endelig noen alternative eksoner, for eksempel 5a i
B6, B7, C7
, og
C9
, beholdt intronic sekvenser som innlemmet premature stoppkodoner, og kan derfor ikke produsere stabile protein på grunn av nonsense-mediert mRNA nedbrytning (NMD) vei, en mulighet som bør verifiseres eksperimentelt.
Karakteristiske trekk
Boris
alternative varianter og deres evolusjonære bevaring hos mennesker og ikke-menneskelige primater
23
Boris
mRNA spleisevarianter har potensial til å kode 17 forskjellige polypeptider som vi betegner som BORIS isoform proteiner 1 til 17. for å kategorisere isoformene, den alternative amino- og carboxy-endene ble navngitt i henhold til antallet av aminosyrerester oppstrøms og nedstrøms av den ZF domenet, henholdsvis (tabell S3). For eksempel betegner N258 en amino-terminal med 258 aminosyreresidier oppstrøms av ZF domene som er kodet i mange
Boris
isoformer inkludert
B0, B1, A3, A4, A5, A6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9 Hotell og
C8
. Spesielt, N24 og N53, avkortede versjoner av N258, har ingen aminosyre forskjeller med N258 innenfor 24 og 53 aminosyrer oppstrøms fra ZF1. Elleve alternativ karboksy-termini som finnes i forskjellige isoformer er betegnet som «C», med deres antall svarer til antallet av kodoner nedstrøms av den siste ZF. For eksempel
B1
har C132,
C3
har C97,
C5
har C53, etc. (File S1, Tabell S3).
Å søk etter homologi med kjente proteiner eller domener, ble de elleve unikt alternativ C-termini sammenlignet med BLAST til GenBank aminosyresekvenser. Kun en alternativ karboksy-terminus, C97, viste en vesentlig grad av likhet med flere ikke-BORIS proteiner, herunder flere som er involvert i prosessene for transkripsjon eller translasjon (fig. S2). Dette nylig anerkjent antatte domene er et tidligere uncharacterized komponent av en kjent helikase-lignende domene (COG0553). Ytterligere analyser av alternative 3’UTRs av visse isoformer avslørte tilstedeværelsen av spesifikke repeterende DNA-elementer. For eksempel, en del av 3’UTR for
B6 Hotell og
C7
isoformer tilhører en Alu-J konsensus. Den 3’UTR av isoformen
B1
er også svært repeterende i menneskelige og primater genomer. Isoformer
C3, B2, B3, C4, C5
, og
C8
har primat-spesifikke repetitive DNA element, MER1 [23] i sine 3’UTRs.
det faktum at
Boris
isoformer er bevart i andre arter antyder deres biologiske betydning. For eksempel, alle funksjonene til menneskelig
Boris
isoformer er høyt konservert i aper
Pan troglodytes Kjøpe og
Macaca mullata, etter med konserverte spleiseseter og tilsvarende protein identiteter som spenner fra 96 % til 100% og fra 53% til 97%, henholdsvis (fig. 3). Blant de mest bevarte C-endene er: C95 (med identiteten til 99% og 89% i sjimpanse og makaker, henholdsvis), C97 (97% og 91%), C68 (98% og 96%), C35 (100% og 97%), og C24 (96% og 96%). C132 er svært konservert i sjimpanse (96%), men i mindre grad hos aper (53%). Selv om innretting av humane
BORIS
isoformer med musen genomiske lokuset avdekket flere antatte mus BORIS karboksy-termini (C95, C90, C35 og C34), er homologien nivåene var ganske lav, som strekker seg fra 9% til 42% . Dette tyder på at tempoet i
BORIS
evolusjon hos pattedyr har vært ganske rask og kompleksiteten av
BORIS
locus sannsynlig falt sammen med fremveksten av primater. Det faktum at musen
Boris
locus ikke har den samme rekke isoformer som mennesker eller andre primater kan være relatert til primat-spesifikk utviklingen av intronsekvenser
BORIS
loci [18]. Det gjenstår å fastslå om mus har alternative
Boris
isoform arter. Hvis de finnes, bør det være forventet at de vil være forskjellig fra de for mennesker til tross for bevaring av spleisesetene. Fremveksten av isoformer i primater kan dermed tilskrives antatte intronic spleiseforsterkere.
(A) Prosent identitet menneske (
H.sapiens
) BORIS isoformer C-endene til antatte alternativ aminosyre sekvenser de av sjimpanse (
P.troglod.
), macaque (
M.mulatta
), og mus (
M.mus
.). Elleve alternative C-termini som finnes i forskjellige isoformer er definert av antall kodoner nedstrøms av den siste ZF. Tabellen viser navnene på BORIS isoformer med tilsvarende C-termini og sin identitet i prosent. (B) Justering av BORIS alternativ C-termini i menneske, sjimpanse, macaque og mus. De alternative aminosyresekvenser av human, sjimpanse, macaque og mus blir justert av ClustalW (Vector NTI). Humant BORIS spleisevarianter er sterkt konservert hos primater, men ikke i mus. Aminosyresekvenser for noen av BORIS alternativ C-termini (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) er helt fraværende hos mus. Gul markert sekvenser er 100% identisk med den humane aminosyresekvensen; den blå høydepunkt indikerer konservative erstatninger i forhold til menneske homologe BORIS sekvenser. Prikkene indikerer innskudd eller slettinger.
Alternative
Boris
transkripsjoner er uttrykt i normale mannlige og kvinnelige gonader
Vi har tidligere rapportert at uttrykk for
BORIS B0
i normale humane vev ble begrenset til testis [2]. For å analysere mønstre av
BORIS
isoform uttrykk i testikkel, har vi designet en serie med primere og TaqMan prober til å forsterke de alternative transkripsjoner av QRT-PCR. Bare 8 av 23
Boris
isoformer kan være spesielt diskriminert av QRT-PCR fordi de fleste isoformer dele sekvenser, noe som gjør det umulig å designe primere og prober som ville oppdage hver
BORIS
isoform som en egen art . Følgelig vi operativt oppdelt de 23 isoformene til seks underfamilier (SF1 til SF6) basert på deres unike 3 «terminale sekvenser, som ble brukt til å utforme 6 TaqMan prober for QRT-PCR (fig. 2A, Materialer og Metoder). Blant 13 voksen og 13 fostervev testet, ble ekspresjon av de seks
BORIS
underfamilier detektert bare i voksne testikler og i embryonale eggstokk, men de relative nivåer av ekspresjon isoform var reproduserbart forskjellig i de to vev (Fig. 4A , B). Hos voksne testikler, ble alle seks underfamilier uttrykt ved sammenlignbare nivåer, med SF1 å være den mest utbredte gruppen, uttrykt ved omtrent 1.3- til 3-ganger høyere nivåer enn de øvrige fem underfamilier (Fig. 4A). I kontrast, SF3 var den mest utbredte formen i embryonale eggstokkene (Fig. 4B), blir uttrykt på nivåer ca 4 ganger høyere enn SF1 og SF4, og 11- til 127 ganger høyere enn SF6, SF2, og SF5 grupper ( fig. 4B). Mens blant voksne vev bare testis var sterkt positive for
BORIS
isoformer, ble de uttrykt ved meget lave nivåer riktignok reproduserbare i flere vev i foster panel, inkludert testis, hud, og milt (fig. 4B). Dette tyder på at
Boris
isoformer kan være funksjonelt aktiv utenfor kimcellelinje under fosterutviklingen.
QRT-PCR analyse av
BORIS
isoform uttrykk i normal voksent menneske (A) og føtale vev (B), respektivt, ble kvantifisert ved hjelp av absolutt kvantifisering tilnærming. Den 23
Boris
isoformer ble delt inn i 6 underfamilier basert på deres unike 3 «sluttsekvenser for å muliggjøre utforming av TaqMan prober (Material og metoder). (C)
BORIS
isoform uttrykk i menneskelig normal voksen testis analysert av
in situ
hybridisering RNA FISH. For FISH analyser, sondene for seks
Boris
underfamilier (SF1-SF6) ble merket med digoxygenin-11-dUTP ved PCR og individuelt hybridisert til formaldehyd-fiksert voksent menneske testikkel. Glassene ble inkubert med anti-DIG-antistoffer over natten og deretter visualisert med rhodamin-konjugert sekundært antistoff. Å identifisere spermatogoniene og spermatocytter, utførte vi farging med antistoffer mot SCP3 (rød) og E-cadherin (lys grønn), henholdsvis. Sammenslåtte bilder av DAPI-farget kjerner (blå) og
BORIS
isoform RNA (rød) tatt med 20X forstørrelse; høyere forstørrelse bilder er 63X. Piler med bokstaver indikerer: Sg-spermatogoniene, SC – spermatocytter, St – spermatider (små, avlange celler med avlange kjerner, henholdsvis). Kontrollen (CTR) er farging med rhodaminkonjugert sekundært antistoff alene.
For å identifisere de spesifikke celletyper som uttrykker
Boris
isoformer i voksen testikkel, gjennomførte vi RNA
in situ
hybridisering ved hjelp av faste preparater av normal menneskelig testikkel. Farging av testikkel med antistoffer mot SCP3 og E-cadherin ble brukt til å skille spermatogoniene og spermatocytter, henholdsvis, mens spermatider ble identifisert morfologisk som små og langstrakte celler med avlange kjerner (Fig. 4C, E-cad, SCP3). Etter hybridisering til seks merkede PCR prober utviklet for å spesifikt oppdage hver av de seks
Boris
underfamilier, isoform transkripsjoner ble oppdaget ved nesten alle stadier av spermatogenesen (fig. 4C). Alle seks
Boris
transkripsjon underfamilier var mindre rikelig i cytoplasma av spermatogonier enn spermatocytter, mens spermatider var svært positivt for
BORIS
sf2 og marginalt positivt for SF5 og SF6. Dermed SF2, SF5 og SF6 ser ut til å prege de senere stadier av spermatogenese fra spermatocytter til spermatider. En tidligere studie [2] med kylling anti-BORIS antistoff og en 5 «end-merket
BORIS
sonde, både spesifikt for N258 endestasjonen, viste at uttrykk for
BORIS B0
isoform var begrenset primært til spermatocytter. Den nåværende arbeid utfyller vår tidligere vurdering av
BORIS
transkripsjon lokalisering ved å gi bevis for uttrykket av alle seks
Boris
underfamilier i voksent menneske testikkel. Den tilsynelatende differensial uttrykk for individuelle underfamilier i løpet av progresjon fra tidlig til senere stadier av spermatoge indikerer at uttrykk for
Boris
isoformer er utviklingsmessig regulert.
Boris
isoformer kode antatte kreft -testis antigener
Tidligere studier viste at
BORIS B0
isoform er unormalt uttrykt i mange typer kreft hos mennesker, inkludert både primære kreft og kreftcellelinjer, kvalifiserer det som koder for en antatt kreft testikkel antigen (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. For å forstå relevansen av det nyoppdagede flere
Boris
isoformene til kreftutvikling og progresjon, testet vi NCI-60 kreftcellelinje panelet ved RT-PCR og funnet at ca 70% av disse cellelinjer uttrykte transkripsjoner av noen isoformer (fig. 5A). De fleste av de positive linjer, men uttrykte nivåer av
Boris
transkripsjoner som var ganske lav på mindre enn 500-1,500 utskrifter per 50 ng av total RNA. Likevel nivåene var tilstrekkelig til å påvise to forskjellige mønstre av
BORIS
isoform uttrykk. Den første mønsteret, eksemplifisert i figur 5B for K562 cellelinje, ble assosiert med mer enn 20.000
Boris
transkripsjoner (summert over alle seks
Boris
underfamilier) per 50 ng av total RNA. I denne undergruppe av cellelinjer (av 60, 13% av NCI-60 panel 8), SF1 transkripsjoner var til stede på høyeste nivå, i snitt ca 3 ganger høyere enn nivåene for SF2, 10 ganger høyere enn for SF3 og SF4, 50 ganger høyere enn for SF6, og mer enn 100 ganger høyere enn for SF5 (fig. 5B). Cellelinjene som viser denne uttrykksmønster stammer fra forskjellige vev, inkludert ovarie, lunge, bryst, blod, og hud, noe som indikerer at ekspresjon av
BORIS
isoformer ikke er spesifikt assosiert med kreft i bestemte opprinnelse.
(A)
Boris
underfamilier er betydelig oppregulert i kreftceller sammenlignet med normale celler. For normale celler (N) – uttrykk for
Boris
isoformer ble analysert i 13 vev og 4 primære cellelinjer. For tumorceller (T) – av NCI-60 cancercellelinjer ble analysert. 59 av NCI-60 cancercellelinjer ble 13 normale vev, og 4 normale primære cellelinjer analysert ved hjelp av absolutt kvantifisering tilnærming med normalisering til GAPDH-nivåer, og plottet ved bruk av en logaritmisk skala. Nivåer av
BORIS
isoform uttrykk varierer sterkt (fra 0 til 60 000 utskrifter per 50 ng av total RNA). Røde linjer viser gjennomsnittsverdiene for hver
BORIS
underfamilie. (B) Den første mønster av
BORIS
isoform ekspresjon i NCI-60 kreftceller, som representert ved K562 cancercellelinje. (C) Et andre mønster av
BORIS
isoformer ekspresjon i NCI-60 panel er eksemplifisert ved Ovcar3 cancercellelinje. (D-J)
BORIS
isoformene uttrykk analysert av RPA. Aliquoter av total RNA erholdt fra nyre, testikler og K562-cellelinjen ble hybridisert med
32P-merkede antisense RNA-prober. RNase beskyttede fragmenter (pilhoder) ble påvist bare i testikkel og K562, men ikke i nyrene. Den første kjørefelt på hver gel er en kontroll, en ufordøyd sonde inkubert med gjær RNA. (D) RPA med riboprobe SF1 /SF5 gir 154 bp og 40 bp fragmenter, tilsvarende SF1 og SF5 hhv.
