Abstract
Six1 er en av transkripsjonsfaktorer som fungerer som master-regulatorer av utvikling og er ofte feilregulert i kreft. Imidlertid er rollen til Six1 i kreft i bukspyttkjertelen ikke klart. Her viser vi at den relative uttrykk for Six1 mRNA er økt i kreft i bukspyttkjertelen og korrelert med avansert tumor stadium.
In vitro
funksjonelle analyser viser at tvang overekspresjon av Six1 forbedrer vekst og spredning evne til kreft i bukspyttkjertelen celler betydelig. Knockdown av endogen Six1 reduserer spredning av disse cellene dramatisk. Videre fremmer Six1 veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler i en xenograft assay. Vi viser også at genet som koder for cyclin D1 er en direkte transcriptional mål av Six1 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Overekspresjon av Six1 oppregulerer cyclin D1 mRNA og protein, og i betydelig grad øker aktiviteten av cyklin D1-promoteren i PANC-1-celler. Vi viser at Six1 fremmer cellesyklusprogresjon og spredning av oppregulering av cyclin D1. Disse data tyder på at Six1 er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft og kan bidra til økt celledeling gjennom oppregulering av cyclin D1
Citation. Li Z, Tian T, Lv F, Chang Y, Wang X, Zhang L, et al. (2013) Six1 Fremmer spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler via oppregulering av cyclin D1 Expression. PLoS ONE 8 (3): e59203. doi: 10,1371 /journal.pone.0059203
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 23 november 2012; Godkjent: 12 februar 2013; Publisert: 20 mars 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Natural Science Foundation of China National (NSFC, NO 81172118) og med tilskudd fra Kina Postdoktor Science Foundation (til LZM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft-relatert dødelighet over hele verden [1]. Det har ofte en dårlig prognose på grunn av mangel på pålitelige tidlig diagnostikk og effektiv behandling [2]. Derfor er det et presserende behov for å forbedre vår forståelse av molekylære mekanismer for kreft i bukspyttkjertelen tumorigenesis og å utvikle effektive behandlingsstrategier.
Six1 er en pattedyr homolog av Drosophila sinus oculis genet og er sterkt konservert fra Drosophila til mennesker [3], [4]. Det er bredt uttrykt i mange vev under den tidlige utviklingen, mens sitt uttrykk er lav eller fraværende i de fleste voksne vev [5]. Under den tidlige utviklingen, fremmer Six1 den stamcelle spredning og overlevelse gjennom aktivering eller undertrykkelse av et variert utvalg av nedstrøms målgener [3], [6]. Det spiller også en rolle i cellulær migrering og invasjon under embryogenese gjennom induksjon av epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [7], [8]. Den korrekte ekspresjon av dette gen er kritisk for utvikling av forskjellige organer som hjernen, øre, øye, muskel, nyre sensoriske strukturer, og kraniofaciale strukturer [7], [9], [10]. I tillegg til rollen som Six1 i den tidlige utvikling, er det ofte feilekspriraert i forskjellige tumorer slik som brystcancer [5], [11], Wilms tumor [12], rhabdomyosarcomas [13], hepatocellulært karsinom [14], eggstokk kreft [15], [16], og livmorhalskreft [17], [18]. Enda viktigere, kan det misexpression av Six1 i kreft indusere utviklingsprogrammene ut av sin sammenheng, bidrar til tumor utbruddet og progresjon [19], [20]. Nylig har noen studier vist at overekspresjon av Six1 forenkler metastasering av brystkreft gjennom TGF-β signalering, epitelial-mesenchymale overgang [21], og indusere lymphangiogenesis via oppregulering av VEGF-C [22]. Hemming av endogen Six1 uttrykk undertrykker tumorigenesis og metastasering av leverkreft [23].
Men rollen Six1 i bukspyttkjertelkreft er ukjent. Den kritiske rollen Six1 i initiering og progresjon av mange kreftformer tvunget oss til å studere funksjonen av Six1 i bukspyttkjertelkreft. I denne studien, viser vi at Six1 er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft og korrelert med avansert tumor stadium. Ved hjelp av
in vitro Hotell og
in vivo
funksjonelle analyser, viser vi at tvangs overekspresjon av Six1 abnormt fremmer spredning, bidra til bukspyttkjertelen tumorigenesis. Vi viser også at genet som koder for cyklin D1 er et direkte mål transkripsjonen av Six1 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre viser vi at Six1 fremmer cellesyklusprogresjon og spredning av oppregulering av cyclin D1.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Samlingen av vevsprøver ble godkjent og overvåket av forskningsetiske komité for Zhengzhou universitet. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som følger prøver. Dyrestudier og xenograft tumor modell ble godkjent og overvåket av forskningsetiske komité for Zhengzhou universitet.
Cell Kultur
Menneskelig bukspyttkjertelkreft cellelinjer PANC-en (CRL-1469) og MIA PACA-2 (CRL-1420) ble oppnådd fra American Type Culture Collection ATCC (Rockville, MD, USA). Alle cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Hyclone, Logan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 enheter /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin (Invitrogen , California, USA) i 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
Menneske vevsprøver
Primær bukspyttkjertelen tumor (n = 51) og tilstøtende ikke-tumorvev (n = 13) ble samlet mellom 2005 og 2010 fra pasienter med resected primære pancreatic ductal adenokarsinomer på First Affiliated Hospital of Zhengzhou universitet. Den tilstøtende ikke-svulstvev ble oppnådd fra et segment av den resekterte prøvene som var lengst fra svulsten (mer enn 5 cm). Vev var flash frosset umiddelbart etter operasjonen. Ingen tidligere lokal eller systemisk behandling hadde blitt gjennomført på disse pasientene før operasjonen. Alle data som alder, kjønn, tumor størrelse, beliggenhet, scene, differensiering, perinevral invasjon og lymfeknute status ble oppnådd fra originale patologi rapporter. Patologisk iscenesettelse ble oppdatert i henhold til gjeldende amerikanske Joint Committee on Cancer retningslinjer. Genekspresjon for Six1 ble oppnådd for hver tumor i bukspyttkjertelen, og alle prøver ble bety sentrert. Prøvene ble deretter delt inn i to grupper for videre analyse: prøver hvor Six1 ekspresjon var over gjennomsnittet (Six1 «høy»), og de gjenværende prøver (Six1 «lav»). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og denne studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Zhengzhou University (Zhengzhou, Kina).
Plasmider Utarbeidelse og etablere stabile cellelinjer
Menneske Six1 cDNA var amplifisert fra human skjelettmuskel ved revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Human skjelettmuskel vev ble oppnådd fra det normale omgivende vev margin av sarkom reseksjon prøver. Den detaljerte reaksjonsbetingelser av PCR ble utført i henhold til tidligere rapport [5]. Den Six1 cDNA ble deretter subklonet inn i plasmid pcDNA4 /TO (Invitrogen, California, USA). pCMV-cyclin D1 ble hentet fra Sevicebio (Wuhan, Kina). pcDNA4 /TO-Six1 og pCMV-cyclin D1 ble renset i stor skala ved hjelp av EndoFree Plasmid Maxi kit (Qiagen, Tyskland) for transfeksjon. Panc-1 eller MIA PACA-2-celler ble sådd i seks-brønns plate og transfektert med pcDNA4 /TO-Six1 ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens som anbefalt av produsenten (Invitrogen, California, USA). Tjuefire timer etter transfections cellene ble passert og valgt med 100 mikrogram /ml Zeocin i 2 uker, og deretter fikk pcDNA4 /TO-Six1 stabile cellelinjer.
RNA interferens
For small interfering RNA (siRNA) -mediert nedregulering av Six1 eller cyclin D1, følgende siRNA sekvenser ble kjøpt fra Ribobio Company, Guangzhou, PRChina). Sekvensene til de Six1 målrettede siRNA er 5′-AGAACGAGAGCGUACUCAA-3 «eller 5′-GGGAGAACACCGAAAACAA-3′; sekvensen av cyklin D1 målrettet siRNA er 5»-GTTCATTTCCAATCCGCCC-3 «eller 5′-GCCGAGAAGUUGUGCAUCUUU-3». PANC-en og MIA PACA-2-celler ble sådd i 6-brønners plater, vokst til 50% konfluens og transfektert med siRNA eller rykke kontroll siRNA (gitt av Ribobio Company, Guangzhou, Kina) tomannsboliger ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen, California, USA ) i henhold til produsentens anbefalinger. 20 Nm sirnas ble brukt per brønn og cellene ble inkubert i ytterligere 48 til 72 timer før de blir høstet for protein utvinning og immunoblot analyse.
Kvantitativ Real-time RT-PCR
Total RNA ble isolert bruker RNeasy mini kit i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Tyskland). Den mengde og renhet av det isolerte RNA ble kvantifisert med et Nanodrop spektrofotometer 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) ved bølgelengder på 230, 260 og 280 nm. Kun RNA prøver med en 260/280-forhold 1,9 til 2,1 og et forhold 260/230 2,0 til 2,5 var akseptable for videre analyse. Integriteten av total RNA ble bedømt ved visualisering av 18S og 28S ribosomale RNA mønstre i en denaturerende agarose-gel (Qiagen, Tyskland). Og de skarpe, klare 28S og 18S rRNA band og et forhold 28S /18S av to anses å være god kvalitet RNA. Den første tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp av SuperScript® III First-Strand Synthesis System i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, California, USA). Kvantitativ PCR ble gjort ved hjelp SYBR Grønn farge på et Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, California). I korte trekk ble 10 pl av RNA /primer blanding fremstilles i et sterilt 0,2 ml rør som følger: 0,5 ug av total RNA, 1 pl Oligo (dT)
20 (50 uM), 1 pl 10 mM dNTP blanding og DEPC-behandlet vann til et sluttvolum på 10 ul. Blandingen ble deretter inkubert ved 85 ° C i 5 minutter og avkjølt på is i minst ett minutt før tilsetning av 10 pl av cDNA Synthesis Mix (2 ul av 10 x RT-buffer, 4 ul 25 mM MgCl
2, 2 mL 0,1 M DTT, 1 mL RNaseOUT ™ og en mL SuperScript® III revers transkriptase). Den 20 ul revers transkripsjonsreaksjon ble inkubert ved 50 ° C i 30 minutter, etterfulgt av 85 ° C i 5 minutter. RNA-templat ble fjernet ved tilsetning av 1 ul RNase H og inkubering ved 37 ° C i 20 min. Kvantitativ PCR ble gjort ved hjelp SYBR Grønn farge på et Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, California). Den kvantitative PCR ble utført med 12,5 ul av 2 x SYBR grønn PCR Mastermix (Tiangen Biotech, Beijing, Kina), 1 pl templat cDNA, 200 nM hver amplifikasjonsprimer og DEPC-behandlet vann til et sluttvolum på 25 ul. Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners optisk plate ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 sek. Terskelen syklus (C
T) data ble besluttede med standard terskelinnstillinger. C
T er definert som den fraksjonelle syklus nummeret som fluorescensen passerer den faste terskel. The real-time PCR data ble analysert ved komparativ C
T-metoden [24]. Alle reaksjoner ble kjørt i duplikat, og sterilt vann ble testet sammen med prøven som negativ kontroll. Gel-elektroforese ble utført for å bekrefte den eksklusive forsterkning av det forventede PCR-produkt. Primersett ble anvendt var som følger: for genet glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 «og 5′-GGCTG TTGTCATACTTCTCATGG-3′; for Six1, 5»-AAGGAGAAGTCGAGGGG TGT-3 «og 5′-TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT-3′; for cyclin D1, 5»-GCTGCGAAGT GGAAACCATC-3 «og 5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3»
Analyse av mikroarray data
Oncomine Cancer Microarray database [25] (http: //www. .oncomine.org) ble brukt til å studere genekspresjon av Six1 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen prøver som vi tidligere beskrevet [26]. Genuttrykk data ble også hentet fra NCBI genuttrykk Omnibus (GEO) database (deponeringsnummer GSE15471, GSE32676 og GSE28735; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [27] – [29]. Expression data for Six1 og cyclin D1 var log-transformeres, median sentrert per rekke, og standardavviket var normalisert til én per array.
Western Blot analyse
Western blot analyse ble utført som vi tidligere beskrevet [30]. I korthet ble cellene lysert i kald lyseringsbuffer [Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl
2, 0.5% Triton X-100, fosfatase-inhibitor blanding (1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4 og 1 mM β-glyserofosfat), og en protease inhibitor blanding (1 mM PMSF, 2 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A)]. Lysater ble clarifed ved sentrifugering ved 10.000 x g i 20 min. Proteiner (10-25 ug) ble løst i SDS-PAGE, overført på nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Membranen ble blokkert i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,05% Tween-20) inneholdende 5% (vekt /volum) fettfri melk ved romtemperatur i 1 time og deretter probet med antistoffer for Six1, cyclin A, cyclin B1, cyclin E, GAPDH (alt fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), Phospho-Rb (# 8516, Cell Signaling Technology), Rb (# 9313, Cell Signaling Technology ) og cyclin D1 (# 2926, Cell Signaling Technology) ved 4 ° C over natten. Deteksjon ble utført med SuperSignal West Femto maksimal følsomhet Substrat Trial Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Bandet bildene ble digitalt fanget og kvantifisert med en FluorChem FC2 bildesystem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
MTT og Cell Count analysen
Ett tusen celler ble sådd på 96 -vel kulturplater og inkuberes ved 37 ° C i forskjellige tidsperioder. Deretter ble 20 ul av MTT (tetrazolium-bromid, 5 mg /ml, GE Healthcare) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Dyrkningsmediet ble fjernet, og 150 ul DMSO ble tilsatt for å oppløse krystallene i 20 minutter ved romtemperatur og absorbansen ved 570 nm ble lest ved en ELISA-plateavleser (modell 680, Bio-Rad, CA). For celletelling, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater inkuberes ved 37 ° C i forskjellige tidsperioder og deretter fjernet ved trypsinering, og antallet levedyktige celler ble tellet i et hemocytometer ved bruk av trypan blå farging. Hver prøve ble målt i tre eksemplarer og gjentatt tre ganger.
BrdU innlemmelse
Celler ble utsatt til 10 mikrometer BrdU (BD Biosciences, Mountain View, CA) for 30 min og fiksert i 70% etanol , og deretter vasket med PBS, resuspendert og inkubert med 4 N HCl og 0,5% Triton X-100 i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS ble cellene nøytralisert med 0,1 M natriumborat før den blir merket med FITC-konjugert BrdU-antistoff (BD Biosciences, Mountain View, CA) og inkubert med 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO ) i henhold til produsentens protokoll før de blir analysert ved hjelp av en Becton Dickinson FACStar Plus strømningscytometer.
Colony Forming Assay
Seks hundre celler ble sådd inn i en 6-brønns plate. Etter 14 dager ble cellene farget med 0,5% krystallfiolett (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i metanol i 10 min. Kolonier (mer enn 50 um diameter) ble tellet direkte på tallerkenen. Statistisk signifikans ble beregnet fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Rapportør Assays
Panc-1-celler ble sådd ut i 24-brønners plater ved 100.000 celler /brønn og får vokse under vanlige kulturbetingelser. Ved 80% kon fl-frekvensen,-celler ble transfektert med ekspresjonsvektorene (Six1 eller tom vektor), full-lengde human cyclin D1 promoter (-1745D1 /LUC, -1745-155) [31] og Renilla reniformis luciferase ekspresjonsvektor PRL-TK (Promega, Madison, WI, USA). Det molare forhold mellom PRL-TK til pGL3-reporter-vektoren var 1: 10. Deretter ble luciferase-aktivitet ble målt ved hjelp av den doble luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble lysert etter 48 timer med 500 pl 1 x Passiv Lysis Buffer (Promega) per brønn, inkubert i 20 minutter ved romtemperatur, og celleavfall ble fjernet ved sentrifugering. 50 ul supernatant ble blandet med 50 ul Dual-Glo reagent I (Promega) og brann fl y luciferase luminescens målt i en GloMax® 20/20 luminometer (Promega, Madison, WI, USA). 50 ul Dual-Glo reagens II (Promega) ble tilsatt og Renilla luciferase luminescens bestemt. Relative lysenheter ble beregnet som Renilla /brann fl y luminescens fra tredoble brønner og normalisert til den negative kontrollen.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
chip analysene ble utført ved hjelp av en chip analysesett ( Upstate Bioteknologi, Inc., Lake Placid, New York) som foreslått av produsenten. Brifely,-celler (15 cm kulturskål, omtrent 1,0 x 10
7-celler) ble fiksert med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av vasking to ganger med 20 ml kald 1 x PBS og høstet ved skraping. Etter sentrifugering ble cellepelletene lysert i 1 ml lysebuffer inneholdende SDS Protease Inhibitor Cocktail II. Cellelysat ble sonikert på våt is fire ganger i 15 sekunder hver gang med intervaller på 15 sekunder for å oppnå kromatin fragmenter på omtrent 200-1000 bp nukleotider. Sentrifugert ved 12 000 x g ved 4 ° C i 10 minutter for å fjerne uoppløselig materiale, og deretter fjernes supernatanten til ferske mikrofugerør i 100 pl alikvoter. Hver 100 ul supernatanter ble fortynnet med 900 pl chip fortynningsbuffer og preinkubert med protein G-agarose ved 4 ° C i 1 time, og deretter pelletert agarose ved kort sentrifugering og fjernes 10 ul (1%) av supernatanten som inngang. Supernatanter ble inkubert ved 4 ° C over natten med 5 mikrogram Six1 (sc-9709, Santa Cruz), RNA Polymerase II antistoff (Pol II, sc-56767, Santa Cruz) og normal IgG, (sc-2028, Santa cruz) inkuberes over natten ved 4 ° C med rotasjon, og deretter tilsatt 60 ul av protein G-agarose til hvert rør og inkubert i 1 time ved 4 ° C med rotasjon. Etter sentrifugering fjernes supernatanten og vasket Protein G Agarose-antistoff /kromatin komplekset ved å resuspendere kulene i 1 ml hver av lav Salt /High Salt /LiCl immunkompleks vaskebuffer Bufferwash for en tid, etterfulgt av vasking to ganger med TE-buffer. Etter den siste vasking ble immunopresipitatene eluert og omvendt tverrbundet ved inkubering over natten ved 65 ° C i elueringsbuffer. DNA ble deretter renset med en PCR-rensesett (Qiagen, Hilden, Tyskland). Immunoutfelt DNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR ved anvendelse av de følgende primere: cyklin D1 promotor (-1189 til -985), 5′-AGGAACCTT CGGTGGTCTTG-3 «og 5′-CCTTGACCAGTCGGTCCTTG-3′; cyklin D1 promoter (-348 til -190), 5»-CTCAGGGATGGCTTTTGGGC-3 «og 5′-ACTCCCCTGTAGT CCGTGTG-3′; den positive kontrollen GAPDH genet proksimale promoter, 5»-TACTAGC GGTTTTACGGGCG-3 «og 5′-TCGAACAGGAGGAGCAG AGAGCGA-3».
Mus xenograft modell
Kvinne BALB /c (6-8 uker gamle) atymiske nakne mus ble kjøpt fra Experimental Animal Center of Henan-provinsen (Zhengzhou, Kina). Musene ble plassert på fem /bur i mikroisolatorbur enheter i henhold til luftfuktighet og temperatur kontrollerte forhold med 12-timers lys-mørk sykluser. Det ble matet med en standard sterilt laboratorium diett (Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina) minst tre dager før bruk. Dyrehelse ble undersøkt før svulsten implantasjon og randomisering å sikre at bare dyr uten noen symptomer på sykdom ble valgt ut til å gå inn testprosedyrer. I løpet av forsøkene ble dyrene overvåkes to ganger daglig angående tumorbyrden, generell tilstand, mat og vann. Musene ble tilfeldig fordelt i to grupper og injisert subkutant i flanken regionene med 5,0 x 10
6-celler i 0,1 ml PBS. Gruppe 1 (vektor kontroll) ble injisert med PANC-1 celler som ble stablely transfektert med pcDNA4 /TO; gruppe 2 (Six1) ble injisert med PANC-1 celler som ble stablely transfektert med pcDNA4 /TO-Six1. Når nålen ble injisert under huden, holdes nålen parallelt med dyrets kropp for å unngå punktering underliggende strukturer og suget av sprøyten slik at nålen ikke har kommet inn i et blodkar. Svulsten størrelse ble målt hvert 5 dager med calipers. Tumorvolumet ble beregnet med formelen: (lengde x bredde
2) /2. Fem uker etter implantering, begynte en svulst å vises på implantasjonsstedet med 400 til 800 mm
3 i volum. Musene ble avlivet ved kvelning i en CO
2 kammer og tumorer skåret ved hjelp av standard tang, saks, og kirurgiske kniver. Alle prosedyrer ble utført i henhold til Animal Care og bruk komité retningslinjer Zhengzhou universitet.
Statistical Analysis
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik Mellom grupper og blant grupper sammenligninger ble utført med Student t-test og ANOVA, henholdsvis. Mann-Whitney U-testen brukes for ikke-parametriske variabler. Foreningen av Six1 mRNA uttrykk og clinicopathological egenskaper som alder, kjønn, tumor størrelse, beliggenhet, scene, differensiering, perinevral invasjon og lymfeknute status ble analysert ved enten Chi-square eller Fishers tosidige eksakte test. Den Spearman rank korrelasjon test ble vurdert å bekrefte sammenhengen mellom uttrykk nivåer av Six1 og cyclin D1 på log-transformerte verdier. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism programvare versjon 4.0 (PRISM4) (GraphPad Software Inc, LaJolla, CA), og
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Six1 er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft og korrelert med Advanced tumor Stage
for å undersøke hvilken rolle Six1 i bukspyttkjertelkreft utvikling, testet vi uttrykk for Six1 i 51 bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer og 13 tilstøtende ikke-tumorprøver bukspyttkjertelen vev ved hjelp av kvantitativ real-time RT-PCR. Ekspresjonen av mRNA Six1 i bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer prøvene var betydelig høyere enn i de tilstøtende ikke-tumor pankreatiske vev etter normaliseringen ved hjelp av GAPDH (
P
0,01) (figur 1A). Vi undersøkt videre uttrykk for Six1 ved å spørre den ONCOMINE database. I fire microarray expression studier [28], [32] – [34], er det uttrykk for Six1 mRNA signifikant høyere i kreft i bukspyttkjertelen vev enn i de tilstøtende ikke-svulst i bukspyttkjertelen vev; mRNA nivåene øker mellom 1,5- og 11,2 ganger (figur 1B). Det skal bemerkes at ikke-tumor vev tilstøtende til ondartet kreft i bukspyttkjertelen er ikke vanlig pankreas vev og derfor disse data viser ikke nødvendigvis helt ekspresjon av normal pankreas vev.
(A) Den relative mRNA-ekspresjon nivå Six1 ble bestemt av kvantitativ real-time RT-PCR i 51 bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer og 13 tilstøtende ikke-tumorprøver bukspyttkjertelen vev. Resultater ble normalisert til uttrykket nivået av GAPDH mRNA i hver prøve. *
P
0,05. (B) ONCOMINE databasen ble brukt til å analysere tidligere publiserte microarray data. Nivåer av mRNA Six1 økes i bukspyttkjertelkreft sammenlignet med tilstøtende ikke-tumor pankreasvevet. Alle resultater, inkludert
p
-verdier, ble beregnet ved hjelp ONCOMINE data. N, ved ikke-svulst i bukspyttkjertelen vev; T, pancreatic ductal adenokarsinomer; *
P
. 0,05
genuttrykk mønster av Six1 i bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer ble sammenlignet med sine clinicopathological egenskaper (tabell 1). Overekspresjon av Six1 mRNA var signifikant korrelert med tumorstadium (
P
= 0,018). Om 67% (18 av 27) av avansert stadium (III IV) av pankreas duktale adenokarsinomer ble funnet å overuttrykker Six1. Det er ingen signifikant sammenheng mellom Six1 og alder, kjønn, tumor størrelse, beliggenhet, differensiering, perinevral invasjon og lymfeknute status (alle
P
0,05; Tabell 1)
Six1 fremmer vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og
in vivo
for å utforske den funksjonelle rollen Six1 i kreft i bukspyttkjertelen, undersøkte vi effekten av Six1 overekspresjon på spredning av både PANC-en og MIA PACA-2 celler. Cellene ble stabilt transfektert med enten pcDNA4 /TO-Six1 eller kontroll vektorplasmider. Western blot-analyse bekreftet at uttrykket av Six1 økte både PANC-1 og MIA PACA-2-celler transfektert med pcDNA4 /TO-Six1, i sammenligning med de transfektert med kontroll-vektor (figur 2G og fig S1A).
Cell nummer (A), prosentandelen av BrdU positive celler (B) og antall kolonier (C) av PANC-1-celler som er stabilt transfektert med enten Six1 eller kontroll plasmider. Solid linje, kontroll; stiplet linje, Six1. D, Antall Panc-1 celler transfektert med Six1 siRNA og rykke kontroll. Heltrukken linje, scramble kontroll siRNA; stiplet linje, Six1 siRNA.
E, Tumor størrelse av subkutane xenografter måles innenfor fem-dagers intervall. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen: (lengde x bredde
2) /2. F, Representative subkutane tumorxenotransplantater generert på mus
5 uker
etter vaksinasjon (øvre panel), og Selge vekten av svulstene (
nedre panel
). G, Ekspresjonen av Six1 i begge PANC-1 og MIA PACA-2-celler ble bestemt ved western blot-analyser. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Alle forsøk ble utført in triplo; barer, s.e.m .; *
P
. 0,05
Celleproliferering ble vurdert ved direkte celletall, MTT
vekstanalyse
, BrdU innlemmelse, og kolonidannelse analysen. Både MIA PACA-2 og Panc-1-cellene ble anvendt. I henhold til celler resultatene, formeringshastigheten av cellene med overuttrykt Six1 var signifikant høyere enn den til kontrollcellene; flere Six1-transfekterte celler ble observert ved 4, 5, og 6 dager etter plating (*
P 0,05
, figur 2A).
MTT vekst analyser
viste at cellevekstraten betydelig økt etter overekspresjon av Six1 (*
P 0,05
, figur S1B). I BrdU-inkorporering assay antall BrdU positive celler i kontroll og pcDNA4 /TO-Six1 gruppen var 29,3% ± 1,7% og 44,0% ± 1,1%, henholdsvis (*
P
0,05, figur 2B ). I kolonidannelse analyse for PANC-1 antall kolonier dannet for vektor kontroll og pcDNA4 /TO-Six1 var gruppe 84 ± 16 og 184 ± 28, henholdsvis (*
P
0,05, figur 2C). Vi oppnådde lignende resultater
for
MIA PACA-2 celler i koloni-analysen (*
P
0,05, figur S1C)
For å teste om Six1 er nødvendig for. spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler, forstummet vi Six1 i begge Panc-1 og MIA PACA-2 celler ved hjelp av siRNA metode. Celletallet analysen viste at antallet Six1-knockdown-celler var betydelig lavere enn antallet av både PANC-1 og MIA PACA-2-celler transfektert med egge kontroll (figur 2D og fig S1D). Inhibering av endogen Six1 på MIA PACA-2-celler resulterte i tilnærmet 1,8 ganger reduksjon av BrdU positive celle priser, sammenlignet med det forvrengte kontrollgruppen. (Egge siRNA vs. Six1 siRNA-1, 43% vs. 26%; Egge siRNA vs. Six1 siRNA-2, 43% vs. 23%; *
P
0,05, figur S1E). Lignende resultater ble oppnådd i de PANC-1-celler (Figur S1F). Ved å stanse all Six1 uttrykk ble bekreftet etter Six1 siRNA behandlinger (20 nM i 72 timer) av både kvantitativ PCR og Western blot analyse (figur S2). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at Six1 fremmer celle spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler.
For å bekrefte de ovennevnte funn, en
in vivo
tumor xenograft modell ble brukt. PANC-1-celler som stabilt overuttrykker Six1 eller kontrollceller ble injisert subkutant i to grupper på nakne mus (n = 5). Som forventet, tumorvekstkurve viste at svulster avledet fra Six1 gruppe vokste hurtigere enn de fra kontrollgruppen. Fem uker etter injeksjon, tumorvolumet av Six1 gruppe var 0,47 ± 0,26 cm
3, mens tumorvolumet i kontrollgruppen var 0,08 ± 0,06 cm
3 (*
P 0,05
, figur 2E). Videre er den midlere tumorvekt ved slutten av eksperimentet var betydelig høyere i gruppen overekspresjon Six1 (1,69 ± 0,44 g) sammenlignet med kontrollgruppen (0,39 ± 0,25 g; *
P 0,05
, figur 2F ). Disse resultatene viser at Six1 øker veksten av kreft i bukspyttkjertelen
in vivo
.
Six1 transcriptionally Aktiverer genet som koder Cyclin D1 i kreft i bukspyttkjertelen celler
Det har blitt rapportert at Six1 er en cellesyklus regulator og påvirker cellesyklusprogresjon både i normal utvikling og i kreft [3], [5], [20], [35]. For å studere de underliggende molekylære mekanismer som Six1 fremmer cellevekst av kreft i bukspyttkjertelen celler, analyserte vi flere cellesyklus regulatorer og fant at cyklin D1-protein nivåene var signifikant høyere i PANC-1 og MIA PACA-2-celler transdusert med Six1, mens cellene med Six1 knockdown viste en redusert cyclin D1 uttrykk (figur 3A og figur S1 A). Six1 er en transkripsjonsfaktor som fungerer som en av hoved regulering av utviklingen. For å avgjøre om Six1 indusert cyclin D1 uttrykk ved transkripsjon nivå, analyserte vi cyclin D1 uttrykk ved kvantitativ PCR-analyse. Vi fant ut at cyclin D1 mRNA nivået økes minst fire ganger i Six1 omformet PANC-1 celler (*
P 0,05
, figur 3B). Vi neste spurt om Six1 kan direkte regulere aktiviteten av cyclin D1 promoter. PANC-1-celler ble transfektert med den humane Cyclin D1 promoter reporter i nærvær av økende konsentrasjoner av humant Six1-ekspresjonsplasmid. Dataene viste at Six1 forbedret i betydelig grad luciferaseaktiviteten av cyclin D1 promoter reporter på en doseavhengig måte (*
P 0,05
, figur 3C). Deretter utførte vi ChIP analyse for å fastslå hvorvidt Six1 binder seg til cyclin D1 promoter i kromatin. Normal IgG bundet til cyklin D1-promoteren ble anvendt som negativ kontroll. RNA polymerase II antistoff-immunopresipitert DNA ble amplifisert med primere av GAPDH-promotoren for å tjene som positiv kontroll. Figur 3D viser at Six1 kan binde til cyclin D1 promoter mellom -1189 og -985, et område som inneholder de to MEF3 lignende motiver (TCAGCTTTC og TAATATTTC) [36]. I kontrast, gjorde en irrelevant sekvens nær transkripsjonsstartsetet (-348 til -190) ikke binde Six1. For å oppsummere, Six1 positivt regulert cyklin D1 uttrykk både mRNA og proteinnivå, noe som tyder på at cyklin D1 er en
in vivo
Målet Six1 i bukspyttkjertelen celler.
A og B, Effekten av
