Abstract
Bakgrunn
3′-deoksy -3 «- [
18F] fluorothymidine (
18F-FLT) er et sporstoff som brukes til å vurdere celleproliferasjon
in vivo
. Målet med studien var å bruke
18F-FLT positronemisjonstomografi (PET) for å studere behandlingstiltak til en ny anti-kreft sammensatte. For å gjøre dette, studerte vi tidlig anti-proliferative effekter av den eksperimentelle kjemoterapi Top216 non-invasiv av PET.
Metodikk /hovedfunnene
In vivo
opptak av
18F-FLT i humane eggstokkkrefttransplantater i mus (A2780) ble studert ved forskjellige tidspunkter etter Top216 behandling (50 mg /kg iv på 0 og 48 timer) ble igangsatt. Baseline
18F-FLT skanninger ble gjort før enten Top216 (n = 7-10) eller vehikkel (n = 5-7) ble injisert og gjentatt etter 2 og 6 timer og 1 og 5 dagers behandling. En parallell studie ble laget med 2′-deoksy-2 «- [
18F] fluor-D-glukose (
18F-FDG) (n = 8). Tracer opptaket ble kvantifisert ved hjelp av små dyr PET /CT. Imaging resultater ble validert av svulst volumendringer og gen-uttrykk for Ki67 og TK1. Top216 (50 mg /kg 0 og 48 timer) hemmet veksten av A2780-tumor sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,001).
18F-FLT opptak sunket betraktelig på 2 timer (-52%; p 0,001), 6 timer (-49%; p = 0,002) og Dag 1 (-47%; P 0,001) etter Top216 behandling. På dag 5
18F-FLT-opptaket var sammenlignbare med opptak i kontrollgruppen. Opptak av
18F-FLT var uforandret i kontrollgruppen under forsøket. I behandlingsgruppen, opptak av
18F-FDG ble betydelig redusert på 6 timer (-21%; P = 0,003), Dag 1 (-29%; p 0,001) og Dag 5 (-19%; P = 0,05) sammenlignet med baseline.
Konklusjon /betydning
en injeksjon med Top216 initiert en rask og betydelig reduksjon i celle-spredning assessable av
18F-FLT etter 2 timer. De tidlige reduksjon i tumorcelleformering innledes forandringer i svulststørrelsen. Våre data tyder på at
18F-FLT PET er lovende for tidlig non-invasiv vurdering av kjemoterapi effekter i både narkotika utvikling og for å skreddersy behandling hos pasienter
Citation. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Højgaard L, et al. (2010) Tidlig påvisning av Respons på Experimental kjemoterapeutiske Top216 med [
18F] FLT og [
18F] FDG PET i Human Eggstokk kreft xenografter i Mus. PLoS ONE 5 (9): e12965. doi: 10,1371 /journal.pone.0012965
Redaktør: Andrew Boswell, Genentech, USA
mottatt: 08.07.2010; Godkjent: 28 august 2010; Publisert: 24.09.2010
Copyright: © 2010 Munk Jensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AP Moller Foundation, Det danske nasjonal Advanced Technology Foundation, Svend Andersens Foundation, Novo Nordisk Foundation, Lundbeck Foundation, Birthe og John Meyer Foundation, dansk Kreftforeningen, Rigshospitalet Research Foundation, Region hovedstaden og Topotarget A /S. Medforfatterne ansatt av Topotarget hadde en rolle i studiedesign og datainnsamling og analyse. De andre organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Følgende medforfattere har interessekonflikter: Peter Buhl Jensen: eierinteresser og sysselsetting i Topotarget A /S. Maxwell Sehested: eierinteresser og sysselsetting i Topotarget A /S. Fredrik Björkling: Sysselsetting i Topotarget A /S. Kamille Dumong Erichsen: Sysselsetting i Topotarget A /S. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikt. At noen av medforfatterne er ansatt Topotarget A /S endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
For evaluering av effekten i dyrestudier under preklinisk utvikling av nye anticancermidler, reduksjon i tumorvolum er den mest brukte kriteriet for effekt. Imidlertid kan tiden til tumorkrympning være lang, og det krever gjentatte tumorvolummålinger flere ganger ukentlig for å vise effekt. Non-invasiv molekylær avbildning som positronemisjonstomografi (PET) åpner for biologiske prosesser for å bli visualisert og kvantifisert non-invasiv over tid. En ikke-invasiv metode for å påvise tidlig biologisk respons etter behandling mot kreft ville være verdifulle i anticancerlegemiddelutvikling for å skille effektivt fra ikke-effektive legemidler før endringer i tumorvolumet bli avdekket.
økt celleproliferasjon er en av de viktigste funksjoner for kreft [1]. Mye forskning fokuserer på ikke-invasiv visualisering av celleproliferasjon, som kan brukes til å definere en biologisk respons på behandling tidlig i løpet av behandlingen. 3′-deoksy-3 «- [
18F] fluorothymidine (
18F-FLT) anvendes som en PET tracer for visualisering av celleproliferasjon [2].
18F-FLT er et tymidinanalogen og følgelig et substrat for DNA-synteseprosess [3]. Når det tas opp i cellene
18F-FLT blir fosforylert av tymidin-kinase-1 (TK1), noe som fører til intracellulær fangst. TK1 aktivitet er strengt regulert cellesyklusen og er hovedsakelig uttrykt i S-fasen av cellesyklusen; følgelig er det antas å gjenspeile mengden av prolifererende celler [4], [5].
18F-FLT-opptaket er positivt korrelert med cellevekst og TK1 aktivitet [5] – [7]. Flere studier har vist en sammenheng mellom
18F-FLT opptak og tumor celleproliferasjon både i krefttransplantater på mus [8] – [11] og humane tumorprøver [12] -. [14]
Flere prekliniske studier har evaluert proliferasjon målt ved
18F-FLT PET som respons på forskjellige lekkasje fra kjemiske og strålingsterapi i forskjellige dyremodeller for kreft [8] – [11], [15] – [19]. Resultatene fra disse studiene variere; den første endringen i
18F-FLT-opptaket er funnet i området fra 24 timer til en uke etter at behandlingen. Imidlertid har ikke alle studier har funnet en sammenheng mellom kreftsvulster og en endring i
18F-FLT opptak etter oppstart av behandlingen [20], [21]. Tilsynelatende, tidsrammen for å vurdere endringer i spredning er meget variable i henhold til forskjellige behandlingsregimer.
Tidlig ikke-invasiv påvisning av anti-proliferativ aktivitet med
18F-FLT PET kan også være nyttig i en klinisk innstillingen for å avgjøre om pasienter reagerer på konvensjonell behandling, og i løpet av fase i, II og III-studier ved evaluering svar på nye kreftmedisiner. I dag de mest brukte metoder for å vurdere tumorrespons klinisk er med anatomiske imaging teknikker som computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI) ved hjelp av Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST). Men dette krever ofte flere uker eller måneder før en mulig reaksjon blir tydelig [22], [23]. Nylig har føringer for analyse av tumorrespons ved bruk av PET og 2′-deoksy-2 «- [
18F] fluor-D-glukose (
18F-FDG) er blitt foreslått som angir behovet for ytterligere fremgangsmåter for måling av tumorrespons [24]. Nye kreftlegemidler er ofte tumorstatic snarere enn tumorici-dal og endringer i tumorstørrelse kan være minimal til tross for effektiv behandling og dermed generere et behov for nye metoder for å vurdere klinisk respons foruten tumorvolumet krymping.
18F-FDG er i dag den mest brukte radiotracer for bildebehandling i onkologi og er svært nyttig for å oppdage og karakterisere kreft. Flere studier har analysert endringer i
18F-FDG-opptak etter anti-kreft-behandling, men med varierende resultater [25].
18F-FDG lider av den begrensning at den ikke kan detektere effekter på et meget tidlig stadium og en inflammatorisk respons etter kreftbehandling kan til en viss grad skjule påvisning av anti-kreft effekt [26], [27].
Top216 er en mer potent og metabolsk stabilt derivat av Top001, som ble oppdaget av BioImage å ha potent og selektiv drepende effekt på brystkreftcellelinjer [28]. Top001 hemmer mTOR banen i en celle-selektiv måte etter langvarig inkubering (~24 timer). Korrelasjonen mellom mTOR-hemming og cellelinje følsomheten er god, men ikke perfekt.
Top216 hemmer protein, RNA og DNA-syntese i sensitive cellelinjer etter 1-2 timers inkubasjon og induserer apoptose. Induksjon av apoptose målt ved kaspase 3/7 aktivitet er påvisbar etter 6 timer i mest sensitive cellelinjer. Top001 og Top216 ikke i vesentlig grad hemme kinaser (Upstate kinase panel) eller reseptorer (Cerep panel) ved relevante konsentrasjoner og ved foreliggende forblir nøyaktig mål eller virkningsmekanisme som skal identifiseres. Top216 viser potent
in vivo
effekt hos mus xenograft modeller av menneskelig bryst, prostata, eggstokk, og kreft i bukspyttkjertelen, både når det gis intravenøst og po. Top216 er for tiden under regulatoriske sikkerhet og toksikologi undersøkelse med sikte på å flytte det sammensatte inn i klinikken.
Formålet med studien var å bruke
18F-FLT PET for å studere behandlingstiltak til en nye anti-kreft sammensatte non-invasiv. For å gjøre så vi avbildes celleproliferasjon
in vivo
med
18F-FLT PET i en menneskelig kreft mus tumor modell etter oppstart av behandling med Top216. Opptak av
18F-FLT var sammenlignet med opptaket av
18F-FDG og Ki67 og TK1 genuttrykk.
Materialer og metoder
Tumor modell
Animal omsorg og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført under godkjenning av den danske Animal Welfare Council (2006 /561-1124). Kvinne NMRI (Naval Medical Research Institute) naken mus (8-11 uker gamle) ble kjøpt fra Taconic Europa (Lille Skensved, Danmark) og akklimatisert seg en uke i dyret anlegget før ethvert inngrep ble igangsatt. Den menneskelige eggstokkreft A2780 (en gave fra R. Ozols, Fox Chase Cancer Center i Philadelphia, PA januar 2004) ble brukt. 10
7 celler i 100 mL medium blandet med 100 mL Matrixgel ™ basalmembran Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ble injisert subkutant i venstre og høyre flanke henholdsvis under anestesi med 01:01 v /v blanding av Hypnorm® (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgia) og Dormicum® (Roche, Basel, Sveits). Cellelinjen er testet fri for mykoplasma; men det har ikke blitt godkjent. Celler ble dyrket i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium 1640+ Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (Biological Industries, Israel) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen) i 5% CO
2 ved 37 ° C.
Eksperimentell design
Seks grupper av mus ble fulgt (n = 5-10 svulster per gruppe). Behandlingen ble startet ved dag 12-24 etter implantasjon av tumorceller, når tumorvolumene var i gjennomsnitt 225 mm
3. Mus fikk Top216 behandling 50 mg /kg i.v. eller kjøretøy (2% DMSO, 20% HP-B-CD i saltløsning) ved 0 og 48 timer (figur 1). Denne dosen av Top216 var i foregående analysene vist seg å hemme vekst av A2780 xenograft tumor (data ikke vist). Før behandling ble startet, ble musene scannet med
18F-FLT eller
18F-FDG for å bestemme grunnlinjen nivået av sporstoffopptak.
18F-FLT eller
18F-FDG skanninger ble gjentatt ved 6, 30 (dag 1) og 126 (dag 5) timer etter injeksjon av Top216 eller bærer (figur 2) I tillegg er en gruppe mus ble skannet med
18F-FLT ved start og 2 timer etter behandlingsstart (Top216 eller kjøretøy). Tumorvolumet ble etterfulgt av CT under forsøkene [29]. Tumorvolumer ble beregnet i forhold til volum ved baseline.
Uttrykk for Ki67 og TK1 ble analysert
in vitro
i en parallell gruppe mus som ble behandlet med enten Top216 eller kjøretøy og biopsied før og på 6, 30 (dag 1) og 126 (dag 5) timer etter behandlingsstart. Biopsier ble fjernet med en 18G nål og plasseres umiddelbart i RNA later® (Ambion (Europe) Limited, Cambridgeshire, UK). Alle prøver ble lagret ved 4 ° C og den følgende dag RNAlater® ble fjernet og prøvene overført til -80 ° C inntil videre behandling qPCR.
Syntese av
18F-FLT og
18F-FDG
[18F] FLT ble syntetisert ved anvendelse av 3-N-Boc-1- [5-O- (4,4′-dimetoksytrityl) -3-O-nosyl-2-deoksy-BD lyxofuranosyl] tymin som forløper og syntetisert på en GE Tracerlab MX Synthesizer. Alle reagenser og FLT kassetter ble kjøpt fra ABX (Radeberg, Tyskland). Den radiokjemiske renhet ble bestemt etter å måle innholdet av fluor-18 og andre radioaktive forurensninger i FLT oppløsningen målt med henholdsvis TLC og HPLC. Innholdet av etanol og acetonitril ble bestemt ved GC-analyse. PH ble målt med et pH-meter. I separate preparater stabiliteten av preparatene ble undersøkt etter 8 timer. HPLC ble utført på et Gilson HPLC-system (Biolab A /S, Danmark) som er utstyrt med en Dionex UV-detektor (Dionex Denmark A /S, Danmark) og en in-line radioaktivitet-detektor. HPLC-kolonnen var en Luna 5 μ C18 (2) 100A, 150 x 4,6 mm (Phenomenex, Danmark). Elueringsmidlet var vann /acetonitril 90/10 og en strømningshastighet på 1 ml /min. UV-deteksjon ved 267 nm. TLC-platene ble erholdt fra Merck og vann /acetonitril 5/95 ble anvendt som elueringsmiddel. Gjenværende oppløsningsmidler ble bestemt på et Shimatzu GC 2014 (Holm 98% med en spesifikk radioaktivitet som spenner 150-270 GBq /mikromol på EOS. Etanolinnholdet var i størrelsesorden 7-8%, og mengden av acetonitril var under påvisningsgrensen. PH var 07.05 til 07.08. Den radiokjemiske renheten, gjorde etanolinnhold og pH ikke endres etter 8 timers lagring ved romtemperatur.
18F-FDG ble kjøpt fra daglige produksjoner for klinisk bruk (Rigshospitalet, København, Danmark).
microPET og microCT bildebehandling
Mus ble injisert iv med 10,0 ± 1,5 (gjennomsnitt ± SD) MBq
18F-FDG eller 6,9 ± 2,4 (gjennomsnitt ± SD) MBq
18F-FLT. Musene ble fastet over natten før hvert
18F-FDG skanne [30]. En time etter sporstoffinjeksjonsanordninger mus ble bedøvet med 3% sevofluran (Abbott Scandinavia AB, Solna, Sverige) blandet med 35% O
2 i N
2 og festet på en seng i nærvær av tre fiducial markører slik fusjon av PET- og CT-bilder. En 20 min PET scan ble kjøpt ved hjelp av en MicroPET Focus 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA). Etter datainnsamling, ble PET data arrangert i sinograms og senere rekonstruert med maksimal a posteriori (MAP) rekonstruksjon algoritme. Pikselstørrelsen var 0,866 × 0,866 × 0,796 mm og i sentrum synsfeltet oppløsningen var 1,4 mm i full bredde-og-halv-maksimum.
Etter microPET scan, en microCT scan ble kjøpt med en MicroCAT® II-systemet (Siemens Medical Solutions). En 7 minutt og 10 sekunder CT-skanning ble utført med parameterinnstillingene: 360 rotasjonstrinn, rør spenning 60 kV, tube dagens 500 uA, binning 4 og eksponeringstid 310 ms. Pikselstørrelsen var 0,091 × 0,091 × 0,091 mm.
PET og microCT bildene ble smeltet i Inveon programvare (Siemens Medical Solutions). Før fusjon region av interesse (ROIs) ble tegnet opp på CT-bildene manuelt ved kvalitativ vurdering som dekker hele tumorer og deretter tumorvolum og sporstoffopptak, vurdert ved standard-opptaksverdier (SUV) bety og maksimum, ble samlet ved summering av voksler innenfor tomographic flyene.
kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR)
Total RNA ble isolert fra biopsier med TRI reagent® følge produsentens instruksjoner (Molecular Research Center Inc., OH, USA ) og deretter RNA integritet ble målt på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). RNA kvalitet er oppgitt som RNA integritet nummer (RIN) [31]. Konsentrasjonen av RNA ble bestemt ved Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Total RNA (0,3 mikrogram) ble reversert transkribert med Affinityscript ™ QPCR cDNA Synthesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble avkjølt og lagret ved -20 ° C inntil videre anvendelse.
Genekspresjon ble kvantifisert på Mx3000P® real-time PCR system fra Stratagene. Ki67 og TK1 ble hver kvantifisert i en tosidig med TATA boks bindende protein (TBP). Den Brilliant® QPCR Kjerne Reagent Kit (Stratagene) ble brukt. Optimalisering av analyser resulterte i 50% økning i dNTP og Taq polymerase. En MgCl konsentrasjon på 5,5 mm ble benyttet for alle eksperimentene. Den følgende termiske profilen ble anvendt i alle forsøk.: 10 minutter denaturering ved 95 ° C etterfulgt av 45 sykluser med denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C og gløding /forlengelse ved 60 ° C i 1 minutt
Relativ kvantifisering ved den komparative metode (2
-ΔΔCt) [32] ble anvendt. Målingene ble korrigert for effektiviteten av PCR-reaksjonen beregnes ved 5-gangers fortynning kurver for derved å erstatte 2 i formelen med (E + 1) [33]. Effektivitet korreksjoner ble gjort for hvert gen i hver analyse. Vev fra baseline prøvene fungerte som kalibrator. TBP ble anvendt som referanse-genet. Dette genet ble tidligere testet for å være stabil i tumor mot normalt vev og senere funnet å være stabil i denne eksperimentelle oppsettet.
Grunning og TaqMan dual-merkede prober ble utformet ved hjelp av Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA USA). Primere og prober er vist i (tabell 1). For hvert gen optimal primer og probe-konsentrasjonen ble funnet. Alle prøver ble kjørt i triplikat ved hjelp av en pl av cDNA. Til hver prøve en no-revers transkripsjon kontroll (NORT) ble inkludert, og på hver plate en no-mal kontroll (NTC) ble inkludert.
Statistisk analyse
Sammenligning av svulst volum mellom Top216 behandlede og kontrollgruppene ble beregnet ved hjelp av en uparet t-test. Paret t-test ble brukt for konserninterne sammenligninger. Bonferroni korreksjon av p-verdier for multiple sammenligninger ble brukt. Alle data ble testet for å være normalt fordelt ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-test. Beregninger gjort i SPSS 16.0. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SEM og P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av Top216 på tumorstørrelse
Top216 (50 mg /kg ved 0 og 48 timer) hemmet veksten av humane A2780 eggstokkkrefttransplantater i mus
in vivo
sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,001) (figur 3). Størrelsene på ubehandlede tumorer økte med omtrent en faktor 3 i løpet av studien og volumer av de behandlede tumorer var uendret.
A) Effektene av Top216 på veksten av A2780 tumorxenotransplantater. Tumorvolumet ble bestemt ved microCT. Mus ble behandlet med Top216 (50 mg /kg) eller bærer ved 0 og 48 timer. *) P 0,05, **) P 0,01 vs. baseline og
# # #) P 0,001 vs. kontroll. n = 15 svulster per gruppe. B) Endringer i tumorvolumet vurderes av forholdet Dag 5 /baseline i kontrollgruppen som en funksjon av grunnlinjen FLT opptak. n = 7-tumorer. R
2 = 0,61, P = 0,04.
18F-FLT og
18F-FDG opptak
Baseline svulst opptak av
18F- FLT i A2780 svulst modellen var relativt høy (SUVmean 1,05 ± 0,03), noe som gjør det enkelt å skille tumor fra ikke-tumorvev mens for
18F-FDG bare en beskjeden tumoropptak ble observert (SUVmean 0,48 ± 0,02). I kontrollgruppen, baseline
18F-FLT-opptaket forutsagte tumorvolumøkning i løpet av 5 dager (lineær regresjon av SUVmean referanse vs. tumorvolumforhold Dag 5 /baseline: r
2 = 0,61, P = 0,04) (figur 3). Ingen sammenheng mellom baseline
18F-FDG opptak og tumorvolumøkning ble observert.
Opptak av
18F-FLT vurdert av SUVmean redusert betraktelig fra 1,09 ± 0,03 ved baseline til 0,53 ± 0,02 (-52 %; P 0,001) på 2 timer, til 0,56 ± 0,06 (-49%; P 0,001) etter 6 timer og 0,58 ± 0,03 (-47%; P 0,001) på dag 1 etter Top216 behandlingsstart (figur 4 5).
a) åtte bilder på venstre er representative koronale smeltet PET /CT-bilder av to mus skannet med
18F-FLT ved baseline og ved 6 timer og 1 og 5 dager etter behandling start . Bildene øverst viser en mus behandlet med Top216 og bilder nederst viser en kontroll mus som fikk bilen. De fire bildene på riktig vis smeltet PET /CT-bilder av to representative mus behandlet med enten Top216 eller kjøretøy og skannes ved baseline og 2 timer etter behandlingsstart. Pilene peker mot svulster. B) Representative koronale smeltet PET /CT-bilder av to mus skannet med
18F-FDG ved studiestart og 6 timer og 1 og 5 dager etter behandling start. Bildene øverst viser en mus behandlet med Top216 og bilder nederst viser en kontroll mus som fikk bilen. Pilene peker mot svulster.
Top216 /kjøretøy behandling ble igangsatt ved 0 timer og gjentas med 48 timer etter første injeksjon. N = 5-10 svulster per gruppe. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 sammenlignet med baseline. De to grafene på venstre viser data fra
18F-FLT eksperimenter og de to grafene på høyre viser data fra
18F-FDG eksperimenter.
Etter 5 dager
18F -FLT opptak (1,33 ± 0,08) var sammenlignbar med baseline opptak. SUVmean var uforandret i kontrollgruppen i løpet av eksperimentet. SUVmax verdiene sunket betraktelig fra 2,01 ± 0,09 ved baseline til 0,89 ± 0,05 på 2 timer (-55%; p 0,001), til 0,94 ± 0,08 på 6 timer (-53%; P = 0,002) og 0,84 ± 0,03 i dag 1 (-58%; P 0,001). SUVmax verdiene økt til 2,26 ± 0,12 på dag 5 etter behandlingsstart (13%; p = 0,04). SUVmax var uforandret i kontrollgruppen, men økt litt på dag 5 etter behandlingsstart sammenlignet med baseline (13%; p = 0,03).
Opptak av
18F-FDG vurdert av SUVmean redusert betydelig fra 0,49 ± 0,03 ved basislinjen til 0,39 ± 0,02 (-21%, P = 0,003) etter 6 timer, på 0,35 ± 0,01 (-29%; P 0,001) på dag 1 og til 0,40 ± 0,02 (-19%, p = 0,05 ) på dag 5 (figur 4 + 5). Opptak av
18F-FDG i kontrollgruppen ble betydelig øket på dag 5 i forhold til basislinje opptak (27%; p = 0,05). SUVmax verdiene sunket betraktelig fra 0,92 ± 0,06 ved baseline til 0,64 ± 0,04 6 timer etter injeksjon (-31%; p 0,001), til 0,53 ± 0,02 på dag 1 (-42%; P 0,001) og 0,66 ± 0,03 på dag 5 (-29%; p = 0,01). SUVmax var uforandret i kontrollgruppen under forsøket.
Uttrykk for Ki67 og TK1
Uttrykk av referansen genet TBP var konstant gjennom hele forsøket. Forskjeller i Ct-verdier mellom normale prøver og Nort prøvene var 13 (median). RNA integritet nummer (RIN-verdier) var 9,1 ± 0,1 (middelverdi ± SD) for alle prøver.
genekspresjon nivåer av Ki67 og TK1 er vist i figur 6. I behandlingsgruppen ekspresjon av Ki67 var signifikant lavere 6 timer etter injeksjon (-31%, P = 0,01) og Dag 1 (-71%; p 0,001) etter behandling begynner i forhold til baseline. Uttrykk av Ki67 var 21% økning på dag 5 (P = 0,04) sammenlignet med baseline. Uttrykk av Ki67 i kontrollgruppen var signifikant lavere ved 6 timer (-17%; p = 0,01). Sammenlignet med baseline
Data er presentert som fold endringer etter behandling med Top216 /kjøretøy i forhold til baseline nivå (n = 7 svulster per gruppe). Top216 behandling ble initiert ved 0 timer og gjentatt ved 48 timer etter den første injeksjonen. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 sammenlignet med baseline
I behandlingsgruppen uttrykk for TK1 ble betydelig redusert på dag 1 (-56%. P 0,001) sammenlignet med baseline. På dag 5 uttrykk for TK1 økte (30%, p = 0,013) sammenlignet med baseline. I kontrollgruppen uttrykk for TK1 var uendret i løpet av eksperimentet.
Diskusjoner
En injeksjon med Top216 initiert en rask og betydelig reduksjon i celleproliferasjon av 52% assessable av
18F-FLT PET så tidlig som to timer etter injeksjonen. Nedgangen varte i minst en dag, men på dag 5 (3 dager etter at to
nd behandling) opptak av
18F-FLT var sammenlignbar med opptak i kontrollgruppen som tyder på at kreftceller hadde gjenvunnet sin spredning kapasitet. Opptak av
18F-FLT i kontrollgruppen ikke endret under eksperimentet således validere den anti-proliferative effekt av Top216. I motsetning til det bratte fall i
18F-FLT-opptak etter behandling start, en liten, men signifikant, reduksjon i
18F-FDG-opptak ble observert ved 6 timer og på dag 1 etter initiering av Top216 behandling, og denne nedgangen varte til dag 5. endringer i
18F-FLT opptak (maks reduksjon: 52%, 2 h) var mer uttalt enn endringer i
18F-FDG opptak (maks reduksjon: 29%, dag 1). Men ved slutten av forsøket, holdt
18F-FDG opptak lavere enn ved baseline i Top216 gruppe, mens det ble økt i kontrollgruppen.
Reduksjonen i
18F-FLT opptak tidlig etter injeksjonen ble ikke ledsaget av en reduksjon i tumorvolum som volum av svulstene ikke endre seg i løpet av behandlingen. Dette illustrerer at bruken av ikke-invasiv avbildning for å vurdere tumorrespons er viktig ettersom evaluere reduksjon i tumorvolum som et endepunkt ville ha gitt et falskt negativt resultat. Anti-volum virkning av Top216 ble imidlertid fremdeles observert, sammenlignet med kontrollgruppen. Endringer i tracer tilgjengelighet f.eks som en konsekvens av tumor perfusjon endringer etter behandling, kunne forklare noe av effekten av redusert
18F-FLT-opptak. Men det faktum at
18F-FDG-opptaket ikke reduseres på samme måte som
18F-FLT fører til antagelsen om at avta i
18F-FLT-opptaket er ikke bare på grunn av en endring i tumor perfusjon men også til en fysiologisk forandring i tumorcelle-proliferasjon. Dette ble ytterligere bekreftet ved en tilsvarende reduksjon i Ki67 genekspresjon.
Målingene av sporstoffopptak på dag 5 kan tolkes både som et mål på celleproliferasjon 5 dager etter behandlingsstart, og som status spredning 3 dager etter andre injeksjon av Top216. Følgelig, en injeksjon av Top216 inhiberte proliferasjonen et sted mellom 1 og 3 dager, deretter tumorcellene utvunnet deres spredning kapasitet. Denne informasjonen kan være nyttig når du planlegger behandlingsplaner under pre-kliniske undersøkelser og i fremtidige kliniske protokoller for å finne den optimale behandlingsregimet.
På dag 5 etter behandlingsstart
18F-FDG opptak var 19% lavere sammenlignet med baseline, mens opptaket av
18F-FLT var sammenlignbar med baseline. Opptak av
18F-FDG ble dermed rammet for en lengre tid enn
18F-FLT opptak. Dette tyder på at selv om celleproliferasjon etter 5 dager (3 dager etter den 2
nd behandling) var sammenlignbare med grunnlinjen, biologiske effekter av behandlingen fortsatt til og ble visualisert ved
18F-FDG. Opptak av
18F-FDG var signifikant lavere ved 6 timer etter oppstart av behandling sammenlignet med baseline opptak. Men nedgang på 21% fra et allerede lavt opptak er ikke lett visualisert på PET /CT-bilder (figur 4).
Våre funn som
18F-FLT var overlegen
18F-FDG for å vurdere de tidlige reaksjoner følgende anti-kreft-behandling er i samsvar med andre studier [8], [11], [21]. Baseline nivå av
18F-FDG opptak i svulsten modellen var lav og bare om lag halvparten av baseline nivåer av
18F-FLT opptak som er i overensstemmelse med funnene i andre [11], [17]. Imidlertid har andre studier funnet en høyere
18F-FDG opptak i flere xenograft modeller sammenlignet med
18F-FLT opptak [16], [19], [21]. Det har tidligere blitt vist at det er vanskeligere å måle behandlingsrespons i tumorer med lav grunnlinje sporstoffopptak, noe som er i overensstemmelse med resultatene funnet i denne undersøkelsen [11], [21], [34].
resultatene fra andre undersøkelser ved å bruke
18F-FLT PET for å vurdere tidlige respons på anti-kreft-behandling har vært svært variabel, hvor responsen på en histondeacetylase-inhibitor ble observert etter 4 dager, [10], som reaksjon på cisplatin ses etter en dag [9], er respons på cyklofosfamid og mTOR-hemming tydelig etter 2 dager [16] og ErbB kinase inhibitor igangsatt en reduksjon i
18F-FLT opptak 2 dager etter behandlingsstart mens ingen respons ble observert ved 6 og 24 timer [11]. Men sammenligning av studiene er vanskelig på grunn av ulike behandlings og skanning tidsplaner og variable tumormodeller. Sammenlignet med andre studier fant vi en bratt nedgang i
18F-FLT opptak vurderes av PET og denne nedgangen ble observert mye tidligere (2 og 6 timer). Det gjenstår å bli etablert om dette tidlig respons er sammensatt bestemt eller rett og slett på grunn av vår protokoll være den første til å vurdere respons så tidlig etter behandling.
Hvorvidt tidlig endring i
18F-FLT og
18F-FDG kan være en prediktor for klinisk resultat er fortsatt ukjent og videre studier undersøker tidlige endringer og total overlevelse er nødvendig for å kunne svare på det spørsmålet.
Sammenligning av
18F-FLT opptak og Ki67 genuttrykk viste en tilsvarende endring etter behandling med Top216. Men gjorde Ki67 mRNA nivåer reduseres ikke så mye som
18F-FLT opptak 6 timer etter behandlingsstart. En mulig forklaring kan være at endringer i enzymaktivitet skje før endringer i mRNA nivåer. Korrelasjonen mellom Ki67-genekspresjon og
18F-FLT opptak i vårt studium er i samsvar med andre studier finne sterk korrelasjon mellom Ki67 på proteinnivået og
18F-FLT-opptak [8] – [11]. Vi fant en signifikant reduksjon i
18F-FLT opptak så tidlig som 2 og 6 timer etter oppstart av behandling; Men til tross for en betydelig lavere
18F-FLT opptak på 6 timer, en nedgang i TK1 genekspresjon var først tydelig på dag 1 etter behandlingsstart. TK1 enzymaktivitet er positivt korrelert med
18F-FLT-opptak [6], [7], og det har vist seg at transkripsjonelle mekanismer kan delta i reguleringen av TK1 aktivitet hvor både TK1 protein og mRNA-nivåer var relatert til en reduksjon i
18F-FLT-opptak etter behandling med en histondeacetylase-inhibitor [10]. Tidlige forandringer i
18F-FLT opptak uten endringer i TK1 mRNA-nivåer er sannsynlig på grunn av endringer i proteinnivåer, posttranslational proteinmodifiseringer eller endringer i ATP-nivåer [7], [10], [35]. ATP er nødvendig for TK1 aktivitet [36] og andre studier har likeledes funnet en redusert
18F-FLT opptak, til tross for et høyt TK1 nivå, noe som kan forklares ved et lavt nivå av ATP [8].
i konklusjonen, fant vi en 52% reduksjon i
18F-FLT opptak så tidlig som 2 timer etter den første injeksjonen med Top216.
18F-FLT var overlegen
18F-FDG som en ikke-invasiv verktøy for å vurdere tidlige biologiske responser til Top216.
