Abstract
AZD6244 (Arry-142886) er en hemmer av MEK1 /2 og kan hemme celleproliferasjon eller induserer apoptose i en celletype avhengig måte. Den nøyaktige molekylære mekanisme av AZD6244-indusert apoptose er ikke klart. For å undersøke mekanismer for AZD6244 indusert apoptose i humane lungekreft, bestemt vi de molekylære endringer i to undergrupper av humane lungekreft-cellelinjer som enten er sensitiv eller resistent mot AZD6244 behandling. Vi fant at AZD6244 fremkalte en stor økning av BIM-proteiner og en mindre økning av Puma og NOXA proteiner, og indusert celledød i sensitive lungekreft-cellelinjer, men hadde ingen virkning på andre Bcl-2 relaterte proteiner i disse cellelinjer. Knockdown av Bim av siRNA betydelig økt IC
50 og redusert apoptose for AZD6244 behandlede celler. Vi fant også at nivåene av endogen p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a var lavere i AZD6244-sensitive celler enn i AZD6244-resistente celler. I de sensitive celler, AZD6244 indusert FOXO3a kjernefysisk trans kreves for Bim aktivering. Videre ved å stanse all FOXO3a av siRNA avskaffet AZD6244-indusert celle apoptose. I tillegg har vi funnet ut at transfeksjon av konstitutivt aktiv AKT oppregulert p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a uttrykk og hemmet AZD6244-indusert Bim uttrykk i følsomme celler. Disse resultater viser at Bim spiller en viktig rolle i AZD6244-indusert apoptose i lungekreftceller, og at den PI3K /AKT /FOXO3a svei er involvert i regulering Bim og følsomhet av lungekreftceller til AZD6244. Disse resultatene har implikasjoner i utviklingen av strategier for å overvinne motstanden mot MEK-hemmere
Citation. Meng J, Fang B, Liao Y, Chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) apoptoseinduksjon av MEK Hemming i menneskelige lungekreft celler er mediert av Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10,1371 /journal.pone.0013026
Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA
mottatt: Mai 23, 2010; Godkjent: 31 august 2010; Publisert: 27.09.2010
Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute Specialized Program for fremragende forskning (SPORE) Grant CA-70907 (J. Minna og J. Roth), R01 Grant CA-092487 (B. Fang), og Cancer Center Support Grant CA-16672. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Dette arbeidet ble også støttet av en sponset stipend fra Astrazeneca Farmasi som hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble støttet ved en sponset stipend fra Astrazeneca Farmasi. Den Funder Astrazeneca hadde en rolle i begge studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Aktivering av Ras /Raf /MEK /MAP kinase veien har vært innblandet i ukontrollerte celleproliferasjon og tumorvekst. AZD6244 (Arry-142886), en roman, selektiv, ATP-ikke-konkurrerende inhibitor av mitogen-aktivert protein kinase kinase 1/2 (MEK1 /2), har vist aktivitet i nanomolare konsentrasjoner mot isolerte MEK enzym og mange cancercellelinjer [1] . In vitro studier viste at AZD6244 nedregulert nivåer av p-ERK effektivt. AZD6244 har vist aktivitet i flere tumor xenograft modeller av kreft hos mennesker [2] – [4]. I kliniske studier, mens pasienter fra flere tumortyper har vist respons på MEK hemmer monoterapi, andre pasientenes svulster, spesielt ikke-småcellet lungekreft, er naturlig motstandsdyktig mot MEK hemming. Derfor er det viktig å forstå de underliggende mekanismene som er ansvarlige for resistens mot MEK-hemning i tilfelle det blir viktig terapeutisk modalitet i denne meget vanlig kreft.
Vårt tidligere studie [5] viste at MEK-inhibitoren AZD6244 potent inhiberer proliferasjon på nanomolare konsentrasjoner i Calu-6, H2347 og H3122 lungekreft cellelinjer, men hadde liten effekt på H196, Calu-3, H522, eller HCC2450 cellelinjer. I tillegg fant vi at følgende sub-G1 cellesyklus arrest, 20-40% av AZD6244-sensitive celler gikk apoptose, vi observerte ingen apoptose i AZD6244-resistente celler. Vi har tidligere vist at p-AKT uttrykk er lav i AZD6244 følsomme lungekreftcellelinjer, men høy i resistente celler, noe som tyder på at p-AKT er en formidler av motstand mot AZD6244 behandling. I denne artikkelen undersøker vi nedstrøms meklere i AZD6244-indusert apoptose i humane lungekreftceller.
Apoptose kan reguleres via ytre (død reseptor) eller indre (mitokondrielle) celledødsveier. Intrinsic apoptose er formidlet av Bcl-2 familien proteiner, som består av tre underfamilier: de pro-overlevelse medlemmer, slik som BCL-2 eller Mcl-en, den pro-apoptotiske Bax /Bak undergruppe, og den pro-apoptotiske Bcl-2 homologi 3-only (BH3-only) proteiner. Apoptotiske stimuli utløse aktivering av spesifikke BH3-bare proteiner, som deretter engasjerer pro-overlevelse BCL-2 familiemedlemmer og frigjøre nedstrøms effektbokser Bax og Bak, for å lokke fram mitokondrie ytre membran permeabilization, slippe løs caspase kaskade og kulminerte i celledød. Bim, p53-oppregulert modulator av apoptose (Puma) og NOXA har nylig blitt rapportert å spille en viktig rolle i kjemoterapi og målrettet terapi-indusert apoptose i brystkreft [6], leukemi [7], myelom [8] og NSCLC [ ,,,0],9] celler.
FOXO transkripsjonsfaktorer medlemmer fremme eller inaktivere flere mål gener involvert i tumor undertrykkelse, for eksempel
Bim
,
Fasl
, og
TRAIL
gener for å indusere apoptose [10], [11],
p27kip1
,
cyclin D15
for cellesyklusregulering [12], og
GADD45a
for DNA-skade reparasjon [1. 3]. FOXO3a er en av de viktigste FOXO familie av transkripsjonsfaktorer som har et bredt spekter av cellefunksjoner. FOXO3a er fosforylert og inaktivert av AKT gjennom fosforylering på Thr32, Ser253 og Ser315 som resulterer i atom eksport og hemming av sin transkripsjon aktivitet [14], [15]. FOXO3a har også vist seg å være regulert av oncoproteinet ERK [16] ERK ved tre fosforyleringsseter, Ser 294, Ser 344, Ser og 425. Som med AKT, fosforylering av disse serinrester med ERK øket FOXO3a cytoplasmisk fordeling og atom eksport.
på grunn av at balansen mellom antiapoptotic og proapoptotiske proteiner er kritisk for medikament-indusert apoptose, evaluert vi endringer i Bcl-2-familieproteiner i AZD6244 sensitive og resistente lungekreft cellelinjer, og fant at MEK-inhibitoren AZD6244 opp-regulerer apoptosiske BH3-bare proteiner Bim, Puma og NOXA, en prosess assosiert med påfølgende celledød. Vi fant også at stanse enten FOXO3a, en transkripsjonen regulator av Bim, eller Bim med små interfererende RNA (siRNA) sterkt hemmet apoptose. Videre uttrykk for konstitutivt aktiv AKT (caAKT) i sensitive celler hemmet AZD6244-indusert Bim over-uttrykk og førte til AZD6244 motstand. I kontrast, stabil transfeksjon av dominant-negative AKT inn resistente celler forbedret AZD6244-indusert Bim over-exrpession.
Materialer og metoder
Material
AZD6244, levert av Astrazeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, UK), ble oppløst til 25 mM i dimetylsulfoksid (DMSO) og lagret ved -80 ° C. Antistoff mot Bim ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California). Antistoffer mot p-ERK, FOXO3a, p-FOXO3a (Thr32), ble p-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, NOXA og PUMA, og AKT kinase analysen kit kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mot Bak, BCL-XL og caspase-9 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). TEMMES FOXO3a siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California), og Bim og kontroll siRNA var fra Qiagene (Valencia, California). The full-lengde human BimEL cDNA, som er klonet inn i ekspresjonsvektoren pCMV6-XL4, ble kjøpt fra OriGene Technologies (Rockville, MD). Proteaseinhibitor cocktail, β-actin-antistoff, og sulforhodamin B (SRB) var fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Protein analyse materialer og SYBR Grønn Supermix ble kjøpt fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), og Geneticin var fra Life Technologies Corporation (Carlsbad, California). Lipofactamin 2000 og Trizol reagens ble kjøpt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, California), og omvendt transkripsjon reagenser var fra Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Deadend ™ Flurometic TUNEL System ble kjøpt fra Promega (Madison, WI).
Cell kultur
Cellelinjer H2347, H3122, H196, HCC2450, og H522 ble gitt av legene. A. Gazdar og J. Minna, Hamon Senter for Therapeutic Oncology Research, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Alle lungecancercellelinjer ble opprettholdt i høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 ug /ml ampicillin, og 0,1 mg /ml streptomycin; cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 og 95% luft.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved hjelp av SRB-analysen og hver analyse ble utført i fire paralleller. Lungekreft celler ble sådd ut ved omtrent 3000 per brønn i 96-brønners plater og inkubert i 24 timer i DMEM supplert med 10% FBS. Cellene ble deretter behandlet med AZD6244 ved de angitte konsentrasjoner som var ekvivalent med serumkonsentrasjoner som oppnås hos pasienter etter oral administrering. Celler behandlet med DMSO ble anvendt som kontroller. Celler ble fiksert i 96 timer etter behandling ved å tilsette 50 ul 10% trikloreddiksyre ved 4 ° C i 1 time. De ble deretter farget med 70 ul av 0,4% SRB i 60 minutter og vasket med 1% eddiksyre; 200 ul Tris-base (10 mmol /l; pH 10,5) ble tilsatt. Absorbansavlesninger ved 570 nm ble bestemt ved anvendelse av en mikroplate-analysator. Den relative overlevelsesrate (%) ble beregnet ved ligningen OD
T /OD
C x 100% (med OD
T representerer absorbans av behandlingsgruppene, og OD
C absorbansen styre grupper). Median inhiberende konsentrasjoner (IC
50-verdier) ble bestemt ved hjelp av CurveExpert 1,3 programvare og plottet i dose-responskurver. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Western blot-analyse
Whole-cellelysater ble fremstilt ved vasking av cellene med fosfat-bufret saltvann (PBS) og utsette dem for lysis med Laemmli-prøvebuffer supplert med proteasehemmer cocktail. Etter lysatene ble ultralydbehandlet i 15 sekunder, ble proteinkonsentrasjonen kvantifisert ved hjelp av Bio-Rad proteinanalyse kit. Ekvivalente proteiner ble lastet, separert ved 10% eller 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) gelelektroforese, og deretter overført til nitrocellulosemembraner ved 80 V i 2 timer. Membranene ble blokkert i 1 time med 5% fettfri tørrmelk i Tris-buffer inneholdende 0,1% Tween (TBST) og probet med fortynnet primært antistoff ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket tre ganger i TBST-buffer og probet med infrarøde fargestoffmerkede sekundære antistoffer; de immunreaktive bånd ble visualisert med bruk av Odyssey® Imager (Li-COR biovitenskap, Lincoln, NE).
Cellesyklus og apoptose analysen
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket to ganger i kaldt PBS, fiksert med iskald 70% metanol, og inkubert ved 4 ° C over natten. Cellene ble deretter vasket med PBS og inkubert med 25 ug /ml propidiumjodid inneholdende 30 ug /ml ribonuklease i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble analysert på en EPICS Profile II flowcytometer (Coulter Corp., Hialeah, FL) med Multicycle Phoenix Flow Systems program (Phoenix Flow Systems, San Diego, California). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Måling av apoptose ved TUNEL (terminal deoksynukleotidyltransferase mediert nick-end merking) assay
tunel Analysen ble utført ved å følge instruksjonene fra produsenten av et kommersielt tilgjengelig kit (deadend ™ Fluorometrisk TUNEL System) fra Promega. Apoptotiske celler utviser en sterk kjerne grønn fluorescens som kan påvises ved å bruke en standard fluorescein filter. Alle celler farget med DAPI utstillings en sterk blå atom fluorescens. Skinnene ble observert etter fluorescens mikroskopi med relative apoptotiske celler bestemt ved å telle TUNEL-positive celler i fem tilfeldige felt (ved x 100 forstørrelse) for hver prøve.
Real-time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av Trizol reagens og revers transkribert til cDNA. Som tidligere beskrevet, brukte vi Bim primere [6] i vår studie. Kvantitativ polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført i 25 ul av blandingen, med 12,5 ul av 2 x SYBR grønn Supermix, 1 uM av hver forover og revers primer, og 4 til 12 ng templat, ved hjelp av CFX96 real-time PCR deteksjon system (Bio-Rad). PCR ble utført i en innledende denaturering av 10 minutter ved 95 ° C etterfulgt av 39 sykluser på 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C, og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle prøver ble analysert i tre paralleller, og human glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en endogen kontroll. Relativ uttrykk ble beregnet ved hjelp av to-δδCt metoden.
siRNA og Bim cDNA transfeksjon
Celler ble dyrket i 6-brønners plater inntil 70% sammenflytende og transfektert med 200 nmol /L av kontroll uspesifikke siRNA, Bim-målrettet siRNA eller FOXO3a målrettede siRNA ved hjelp Lipofectamine ™ 2000 i henhold til produsentens instruksjoner. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med DMSO (kontroll) eller AZD6244 ved angitte doser og tidspunkter. Cellene ble deretter samlet og behandlet for immunblotting eller propidiumjodidfarging for cellesyklus-analysen.
For Bim cDNA-transfeksjon, ble cellene også dyrket i 6-brønns plater inntil 70% konfluens og transfektert med kontroll vektor eller BimEL ekspresjonsvektoren, i en konsentrasjon på 4 ug i 250 ul medium, ved hjelp av Lipofectamine 2000. Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon ble cellene høstet for immunblotting eller fiksert med 4% formaldehyd for TUNEL assay.
AKT-kinase-aktivitet analysen
Cell ble vasket to ganger med PBS, underkastet lysis i cellelyseringsbuffer, og ultralydbehandlet i 15 sekunder. Ekstraktene ble sentrifugert for å fjerne cellerester, og proteinkonsentrasjoner i supernatantene ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad proteinanalyse reagens. En 200 ul cellelysat prøve ble inkubert med 20 ul av immobilisert anti-AKT-antistoff ved 4 ° C over natten med forsiktig vugging. De resulterende immunopresipitater ble vasket tre ganger med lyseringsbuffer og to ganger med AKT-kinase buffer. Kinasebestemmelser ble utført i 30 minutter ved 30 ° C under kontinuerlig omrøring i kinase-buffer inneholdende 200 uM ATP og 1 mikrogram av GSK-3-fusjonsprotein. Reaksjonsprodukter ble vedtatt med 10% SDS-PGAE, etterfulgt av Western blotting med en anti-fosfor-GSK-3α /β antistoff i henhold til produsentens instruksjoner for ikke-radioaktivt AKT kinase analysen. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
immunfluorescens farging
Cellene ble dyrket på CultureSlides (BD Biosciences, CA). Mediet ble aspirert, og cellene ble vasket tre ganger med PBS og deretter fiksert med nyfremstilt 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur. Etter en annen vasketrinn med PBS ble cellene permeabilisert i 20 minutter ved romtemperatur ved å bruke PBS-buffer inneholdende 0,2% Triton X-100 og 0,1% natrium-citrat. Deretter ble cellene inkubert i PBS som inneholdt 5% fettfri tørrmelk ved romtemperatur i 1 time. Primært antistoff inkubasjon ble utført med anti-FOXO3a (1:100 fortynninger) ved 4 ° C over natten. Etter en annen vasketrinn med PBS ble cellene inkubert med det sekundære antistoff, FITC-konjugert-anti-kanin-antistoff (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) i 30 minutter ved romtemperatur. Alle antistoffer ble fortynnet i PBS pluss 5% fettfri tørrmelk. Glassene ble deretter farget med forlenge antifade oppløsning (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 5 minutter ved romtemperatur etterfulgt av vasking tre ganger i PBS. Bilder ble kjøpt opp av fluorescens mikroskopi med en omvendt Zeiss laser-scanning mikroskop. Individuelle kjerner ble skissert ved hjelp DAPI fluorescens, og den kjernefysiske fluorescens av Cy3 ble kvantifisert ved hjelp av Zeiss KS400 bildeanalyse programvare (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Tyskland). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD og beregnet som middelverdiene med 95% konfidensintervaller. Statistisk sammenligning mellom forsøksgruppene ble utført av to-veis ANOVA test ved hjelp av Microsoft Excel-programvare. Verdier av
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
AZD6244 øker Bim uttrykk i lungekreftcellelinjer
Vår tidligere studie [5 ] viste at AZD6244 hemmet spredning i Calu-6, H2347 og H3122 lungekreft cellelinjer, men hadde liten effekt på H196, Calu-3, H522, eller HCC2450 cellelinjer. I tillegg fant vi at følgende sub-G
en cellesyklus arrest, 20-40% av AZD6244-sensitive celler gikk apoptose, men vi observerte ingen apoptose i AZD6244-resistente celler. I denne studien brukte vi de samme cellelinjene for ytterligere å bestemme mekanismene for AZD6244-indusert apoptose
mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei er kjent for å spille en avgjørende rolle i tyrosin kinase inhibitor-indusert apoptose [6] -. [ ,,,0],9]. For å vurdere hvilke BCL-2 familiemedlemmer er kritisk påvirket av AZD6244 behandling, fant vi ut sine protein nivåer i de tre følsomme lunge kreft cellelinjer etter behandling med tre mikrometer AZD6244, konsentrasjonen nådde i serum hos pasienter som får oral AZD6244. Calu-6 har en mutant KRAS og villtype BRAF mens H2347 i mutant NRAS og H3122 [17] har både villtype KRAS og BRAF. Western blot analyse viste at behandling med AZD6244 indusert raske og vedvarende økning i nivåene av BimEL og i noe mindre grad, av BimL og Bims, i alle sensitive cellelinjer (Fig. 1a). Videre behandling med sub-mikromolare konsentrasjoner (0,03, 0,1, 0,3, 1 og 3 uM) av AZD6244 i 24 timer induserte markert økning i nivåene av Bim (Fig. 1C). Disse funn indikerte at AZD6244 induserte effekten på Bim ekspresjon i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. Men i disse cellene, nivåene av andre BCL-2 familiemedlemmer (Bax, Bak, og BCL-XL) endret ikke merkbart når som helst konsentrasjon av AZD6244 eller på noe tidspunkt (Fig. 1a). I kontrast, gjorde AZD6244 ikke induserer åpenbare endringer i Bim uttrykk i resistente cellelinjer (Fig. 1B). De resistente cellelinjer er alle villtype for BRAF og KRAS. Vi har også oppdaget at undertrykkelse av p-ERK uttrykk med AZD6244 i både følsomme og resistente celler (Fig. 1A og 1B). Vi har også undersøkt uttrykk for BH3-bare proteiner PUMA og NOXA følgende tre mikrometer AZD6244 behandling. PUMA og NOXA uttrykk ble økt på AZD6244 behandling, men nivåene av økningen var mye mindre enn den som ble observert med Bim (Fig. 1a). Siden oppregulering av Bim er mye mer dramatisk enn PUMA og NOXA i AZD6244-behandlede celler, vi fokusert på rollen Bim i senere studier.
Western blot av BCL-2 familiemedlemmer etter behandling med AZD6244. (A) human lunge-cancercellelinjer (Calu-6, H2347 og H3122) ble behandlet med 3 uM AZD6244 i 4, 8, 24, 48 og 72 timer. (B) human lunge-cancercellelinjer (Calu-3, H196, H522, og HCC2450) ble behandlet med 3 uM AZD6244 til 4, 24 og 72 timer. (C) Calu-6, H2347, H196 og H522-celler ble behandlet med 0,03, 0,1, 0,3, 1 og 3 uM av AZD6244 i 24 timer. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
AZD6244-indusert Bim overekspresjon skyldes både økt transkripsjon og økt proteinstabilitet
For å undersøke mekanismene for AZD6244-indusert Bim uttrykk, vi analyserte nivåer av Bim mRNA etter behandling med AZD6244. Sensitive og resistente celler ble behandlet med 3 uM AZD6244 i 4 og 24 timer, og cellene ble høstet for real-time PCR-analyse. MRNA nivåene av GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Resultatet viste at, etter normalisering med intern kontroll, behandling med AZD6244 førte til en betydelig økning i mRNA-nivåer av BIM på en tidsavhengig måte i de sensitive Calu-6, H2347 og H3122 celler. AZD6244, ved en konsentrasjon på 3 uM, Bim øket mRNA mellom 2.2- til 2.5-ganger etter 4 timer, og 2.9- til 3.8-ganger etter 24 timers inkubering i disse tre cellelinjer (Fig. 2A). Det er betydelige forskjeller i mRNA-ekspresjon Bim mellom behandlings- og kontrollgrupper eller mellom 4 timer og 24 timer behandlingsgrupper (
P
0,05 blant alle parvis sammenligning). I kontrast, kan AZD6244 ikke indusere Bim mRNA uttrykk i de fire resistente cellelinjer H196, HCC2450, Calu-3 og H522.
(A) Total RNA ble isolert i parallell. Uttrykk for
Bim
ble målt ved real-time PCR, og normalisert til nivået av
GAPDH
. Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Kolonner
, mener;
bar
, SD. *,
P
0,05, sammenlignet med ubehandlede celler. (B) Calu-6, H2347, H3122 og H196-celler ble behandlet med 30 uM MG132 for 2, 4, 6 og 8 timer og Western blot-analyse med Bim ekspresjon ble utført. (C) Calu-6, H2347, H3122 og H196-celler ble behandlet med DMSO, 3 uM AZD6244, eller 30 uM MG132 i 6 timer, og deretter med 25 ug /ml cykloheksimid for å blokkere proteinsyntesen. Western blot-analyse med Bim ekspresjon ble utført. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Fordi ERK1 /2 signalveien aktivering fosforylerer Bim og fremmer proteasome avhengig nedbrytning av Bim [18], vi testet om Bim protein ble stabilisert av AZD6244 behandling. For dette formålet, må vi først behandlet sensitive (Calu-6, H2347 og H3122) og resistente (H196) celler med proteosom inhibitor MG132 på 30 mikrometer for 2, 4, 6 og 8 timer, høstet celler og oppdaget Bim uttrykk ved Western blot ( fig. 2B). Bim protein nivåer økt 2 timer etter eksponering for MG132 og fortsatte å øke i 6-8 timer. Vi behandlet da disse cellene med DMSO, 3 uM AZD6244, eller 30 uM MG132 i 4 timer og deretter tilsatt 25 ug /ml cykloheksimid for å blokkere proteinsyntesen i cellene. Cellene ble deretter høstet over tid og Bim ekspresjon ble påvist ved Western blot-analyse (Fig. 2C). Vi fant at Bim protein ble raskt nedbrytes i celler behandlet med DMSO i alle fire testede cellelinjer. I motsetning til dette, i celler behandlet med AZD6244 eller MG132, ble BIM-proteinnivåene stabilisert selv etter 6 timers cycloheximide behandling, noe som indikerer at nedbrytning av Bim proteinet ble blokkert ved behandling med AZD6244. Sammen våre resultater indikerer at den økte BimEL ekspresjon indusert av AZD6244 behandling kan være forårsaket av to mekanismer: en økning på
Bim
gentranskripsjon og en inhibering av Bim proteindegradering. Som AZD6244 kan hemme Bim proteindegradering i både følsomme og resistente cellelinjer, var økningen i
Bim
gentranskripsjon kan være av større betydning i indusering av AZD6244-indusert apoptose.
Bim er nødvendig for AZD6244- indusert apoptose i lungekreftceller
for å undersøke hvilken rolle Bim i AZD6244-indusert celle apoptose, genererte vi bestemte siRNA konstruksjoner for Bim i Calu-6 og H3122 cellelinjer. Som vist på fig. 3A, siRNA knockdown av Bim vesentlig hemmet ekspresjon av Bim etter behandling med 3 uM AZD6244 i 48 timer. PARP-spaltning og caspase-9 spaltning /aktivering ble inhibert.
(A) Calu-6 og H3122-celler ble transfektert med Bim spesifikk eller tak siRNA og deretter behandlet med 3 uM AZD6244 i 48 timer. Uttrykk av Bim, PARP og caspase-9 ble analysert ved Western blotting. (B) Cellene ble dyrket i medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av AZD6244 i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved sulforhodamin B, og relativ cellelevedyktighet ble plottet som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige analysene triplikat. (C) som er parallell ble cellene fiksert med etanol og farget med propidiumjodid; DNA-innholdet ble analysert ved flow-cytometri. Tallene representerer prosenter av apoptotiske sub-G
1-fase celler. Data representerer en av tre uavhengige forsøk med lignende resultater.
Kolonner
, mener;
bar
, SD. *,
P
0,05, sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler. (D) Parallell celler ble også løst for TUNEL og DAPI farging. Apoptotiske cellekjerner i TUNEL-farging ble merket med FITC og visualisert under fluorescens mikroskopi. De relative apoptotiske celler ble bestemt ved telling TUNEL-positive celler i fem tilfeldig felt (ved 100 x forstørrelse) for hver prøve.
Kolonner
, mener;
bar
, SD. *,
P
0,05, sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler. De representative fotografier av Calu-6 ble vist i det øvre felt, og andelen av apoptotiske celler fra både Calu-6 og H3122 ble vist i det nedre panel. (E) Calu-6-celler ble transfektert med BimEL ekspresjonsvektor og kontroll vektor i 48 timer. Uttrykk for Bim ble analysert ved Western blotting og apoptotiske celler ble detektert med TUNEL analysen.
Vi testet også antiproliferative effekt av AZD6244 på kontroll og Bim siRNA-transfekterte celler ved SRB analyse og bestemt IC
50 verdier. Vi fant at IC
50 til AZD6244 øket 0,7 til 76,3 uM i Calu-6 celler og 1,4 til 89,3 uM i H3122-celler (fig. 3B). Kontrollen og Bim siRNA-transfekterte celler ble behandlet med 3 uM AZD6244 i 72 timer, og cellene ble høstet for cellesyklusanalyse. Resultatene viste at etter behandling med AZD6244, andelen av apoptotiske (sub-G
1) celler ble redusert fra 38,6% til 8,4% i Bim siRNA-transfektert Calu-6 celler og fra 29,8% til 7,5% i Bim siRNA-transfekterte H3122-celler (fig. 3C). Tunel analysen viste også Bim siRNA transfeksjon hemmet AZD6244-indusert apoptose, fra 56,6% til 12,1% i Calu-6 og fra 65,3% til 18,5% i H3122 celler henholdsvis (Fig. 3D).
Vi testet videre om økt Bim uttrykk er tilstrekkelig til å indusere apoptose. Et plasmid som koder for full-lengde BimEL ble transient transfektert til Calu-6 og apoptose av de transfekterte celler, ble bestemt ved TUNEL assay. Vi fant ut at nesten alle celler transfektert med kontroll vektor er TUNEL-negative etter 48 timer, mens BimEL uttrykk vektor transfekterte celler viste signifikant økt TUNEL-positive apoptose (Fig. 3E).
Rollen FOXO3a i AZD6244 -indusert Bim uttrykk
Det er blitt rapportert at aktivering av transkripsjonsfaktorer induserer FOXO Bim mRNA-ekspresjon og fremmer celle apoptose i en Bim avhengig måte [19], [20]. FOXO transkripsjonsfaktorer fosforyleres av AKT på tre svært konservert nettsteder, Thr32, Ser253 og Ser315, noe som fører til cytoplasma oppbevaring og nedskrivning av FOXO atom transkripsjonen aktivitet. ERK også er blitt vist å fosforylere FOXO3a og for å øke atom eksport. I vår tidligere studie [5], fant vi at p-AKT uttrykk var mye høyere i resistente celler enn i følsomme celler. Som forventet, endogene nivå av p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a var høyere i resistente celler enn i følsomme celler (Fig. 4A). Ingen konsistente forskjeller ble sett mellom de to gruppene for total FOXO3a.
(A) Endogene uttrykk for p-Thr32-FOXO3a, p-Ser253-FOXO3a, og total FOXO3a ble påvist i 8 cellelinjer. (B) subcellulære lokalisering av FOXO3a i Calu-6 og H522 celler ble oppdaget med immunfluorescens farging etter AZD6244 behandling. (C) Calu-6-celler var enten mock-transfektert eller transfektert med en FOXO3a-spesifikk liten interfererende RNA (siRNA) og deretter behandlet med 3 uM AZD6244 i 4 timer. Uttrykk av FOXO3a, Bim, PARP og caspase-9 ble analysert ved Western blotting. (D) I parallell ble Calu-6 cellene fiksert med etanol og farget med propidiumjodid; DNA-innholdet ble analysert ved flow-cytometri. Tallene representerer prosenter av apoptotiske sub-G
1-fase celler. Data representerer en av tre uavhengige forsøk med lignende resultater.
Kolonner
, mener;
bar
, SD. *,
P
0,05, sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler. (E) TUNEL-analyser ble utført som beskrevet i fig. 3D. De representative fotografier av Calu-6 er vist.
Transkripsjonell aktivering av FOXO3a er sterkt påvirket av sin subcellulære lokalisering i en prosess strengt regulert av AKT og ERK. Vi undersøkte om AZD6244 behandling forårsaket FOXO3a til omplassering til kjernen hvor den er aktivert. Immunfluorescens farging viste at i sensitive Calu-6 celler, behandling med tre mikrometer AZD6244 indusert betydelig subcellulære lokalisering av FOXO3a fra cytoplasma til kjernen. Men i resistente H522 celler, vi har oppdaget ingen åpenbare endringer i subcellulære lokalisering av FOXO3a etter AZD6244 behandling. Videre la vi merke til at i ubehandlede Calu-6 celler, FOXO3a bodde i både cytoplasma og kjernen; i ubehandlede H522-celler, det meste av FOXO3a oppholdt seg i cytoplasma, og nukleær farging var forholdsvis ubetydelig (Fig. 4B). Disse funnene er konsistente med de oppdaget på Western blotting av p-FOXO3a uttrykk (Fig. 4A).
For å undersøke hvilken rolle FOXO3a i AZD6244-indusert Bim, vurderte vi effekten av spesifikke siRNA konstruksjoner for FOXO3a i Calu-6 og H3122 celler. Som vist på fig. 4C, siRNA knockdown av FOXO3a inhiberte ekspresjon av FOXO3a, noe som resulterte i sterk undertrykkelse av AZD6244-indusert Bim, PARP-spaltning og caspase-9 spalting /aktivering etter behandling i 24 timer. Analyse av apoptose følgende FOXO3a siRNA transfeksjon i følsomme celler etter AZD6244 behandling viste den prosentandel av sub-G
1 apoptotiske celler ble redusert fra 32,5% til 10,9% etter behandling med AZD6244 i 72 timer (fig. 4D). Tunel analysen viste også at FOXO3a siRNA transfeksjon betydelig hemmet AZD6244-indusert apoptose fra 56,7% til 18,4% i Calu-6 (
P
. 0,05, figur 4E). Våre resultater antydet at FOXO3a aktivering er nødvendig for AZD6244-indusert Bim uttrykk.
caAKT transfeksjon opp-regulerer uttrykket av p-FOXO3a og hemmet AZD6244-indusert apoptose
Vår tidligere studie viste at høy Som vist på fig.
