Abstract
Avansert eggstokkreft (AOC) er en av de ledende dødelige gynekologisk kreft i utviklede land. På bakgrunn av den viktige rollen av angiogenese i eggstokkreft onkogenese og ekspansjon, hypotese vi at utviklingen av en «angiogen signatur» kan være nyttig for å forutsi prognose og effektiviteten av anti-angiogene terapier i denne sykdommen. Seksti-ni prøver av ascitic fluid-35 fra platina sensitiv og 34 fra platina resistente pasienter behandlet med cytoreduserende kirurgi og en
st-linjen carboplatin-baserte chemotherapy- ble analysert ved hjelp av Proteome Profiler
TM Menneskelig Angiogenese Array Kit, screening for tilstedeværelse av 55 oppløselige angiogenese-relaterte faktorer. Et protein profil basert på uttrykk for en undergruppe av 25 faktorer kan kunne skille motstandsdyktig fra sensitive pasienter med en suksessrate på ca 90%. Proteinet profil som svarer til «sensitive» undergruppe assosiert med signifikant lengre PFS (8 [95% konfidensintervall {KI}: 8-9] vs 20 måneder [95% CI: 15-28]; Hazard ratio {HR} : 8,3, p 0,001) og OS (20,5 måneder [95% CI: 13.5-30] vs 74 måneder [95% KI: 36-ikke nådd]; HR: 5.6 [95% CI: 2.8-11.2]; p Godkjent: 13 mai 2016; Publisert: 03.06.2016
Copyright: © 2016 Trachana et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en pedagogisk stipend for den hellenske Society of Medical Oncology (Hesmo). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk krefttypen i utviklede land. Ifølge Seer data, ca 23000 kvinner vil bli diagnostisert med eggstokkreft i de kommende årene, og om 15 000 av dem vil dø av sykdommen [1]. Dødeligheten av denne sykdommen er hovedsakelig på grunn av det faktum at mer enn 75% av ovarialcancer lider stede med langt fremskreden sykdom [2]. Behandling av avansert sykdom innebærer cytoreduserende kirurgi kombinert med carboplatin /paclitaxel kjemoterapi. Til tross for den opprinnelige effekten av dette terapeutisk tilnærming, vil de fleste kvinner tilbakefall, med en median PFS på rundt 18 måneder, og til slutt dø av kreft i eggstokkene [3]. Den one-size-fits-all tilnærming ikke står for den brede genomisk og proteomikk mangfold av ovarietumorer. Nøyaktig måling av proteinmarkører vil være avgjørende i å skille virkning fra ineffektive behandlinger. En voksende portefølje av målrettet terapi og økt forståelse for de molekylære sjåfører innen eggstokkreft har gytt en rekke nye metoder for deteksjon og behandling overvåking; disse tilnærminger inkluderer primært blodprøver for sirkulerende tumorceller, tumoravledet exosomes, stilk /stamceller, oppløselige tumor markører, så vel som bruk av genomisk eller proteomikk Informasjon [4-8]. Likevel er det fortsatt ingen pålitelige biomarkører som kan identifisere eggstokkreft behandlingssvikt før radiografisk eller biokjemiske tegn på progresjon.
Angiogenese er en prosess med produksjon av nye blodårer og er et kjennetegn på kreft relatert til tumor overlevelse og induksjon av tumormetastase [9]. Den utgjør en dynamisk prosess der både pro-angiogene og anti-angiogene proteiner er involvert i reguleringen av angiogenese. Angiogenese spiller en stor rolle i tumordannelse, svulstvekst og ascites formasjon i eggstokkreft. Den senere representerer en lett tilgjengelig biologisk fluid sammenlignet med tumorprøver, mens det kan være mer representativ for den biologiske oppførsel av ovarialcancer, sammenlignet med blod [10]. Vi har tidligere vist at VEGF-nivået er signifikant høyere i ascites av kvinner med fremskreden kreft i eggstokkene forhold til de i serum hos de samme pasientene [11], som tyder på at den angiogene aktiviteten er mest intens i bukhulen, den anatomisk område av høyest sykdomsbyrde. Dessuten har de høye nivåer VEGF blitt vist å være en negativ uavhengig prognostisk faktor i pasienter med fremskreden kreft i eggstokkene som det også er assosiert med resistens overfor terapi [11]. Derfor er inhibering av angiogenese representerer et viktig mål i kampen mot kreft i eggstokkene. Foreløpig har anti-VEGF monoklonalt antistoff bevacizumab blitt godkjent for primær behandling så vel som behandling av tilbakefall av kreft i eggstokkene, mens andre anti-VEGF-reseptor-tyrosinkinase-inhibitorer og anti-Angiopoietin midler har vist effekt i denne sykdommen [12]. Likevel, ikke alle pasienter har nytte av disse terapi, som også har betydelige toksisitet.
For de ovennevnte grunner, vi en hypotese om at en «angiogen signatur», som består av et panel av angiogene faktorer som kan være til stede hos pasientene «ascitisk væske, kan være en nøyaktig prognostisk verktøy, så vel som et middel for valg av ovarialcancer pasienter som sannsynligvis for å dra nytte av anti-angiogene terapier. Vi rapporterer herved utviklingen av en slik «signatur» basert på ekspresjon av 55 antatte eggstokkreft markører for angiogenese i ascites. For å utvikle vår modell, vi brukte motstand mot kjemoterapi som diskriminerende faktor for å identifisere en gunstig kontra en ugunstig angiogen protein profil. Foreningen av økt angiogenese med chemoresistance støttes av en betydelig mengde bevis fra prekliniske studier. Antydning, forbehandling av kreftceller med cisplatin induserer en pro-angiogen ekspresjon skift og fører til øket angiogen aktivitet når cellene ble behandlet med forskjellige kjemoterapeutiske midler, inkludert cisplatin, [13]. I tillegg er krysstale mellom VEGF og anti-apoptotiske bcl-2-protein blitt beskrevet [14], mens nedregulering av bcl-2 fører både til redusert angiogenese og følsomhet overfor kjemoterapi og radioterapi [15,16].
Vi fant ut at et redusert markør sett kan danne et lovende verktøy, som er sterkt assosiert med prognosen etter cytoreduserende kirurgi og standard cytotoksisk kjemoterapi. Etter passende validering, kan denne tilnærmingen brukes til molekylært styrt antiangiogen terapi i eggstokkreft.
Pasienter og metoder
Pasienter
Seksti-ni pasienter som lider av ovarian kreft og oppfylle følgende kriterier deltok i denne observasjons, single-institusjon studie: Stage III-IV (i henhold til FIGO retningslinjer); pasienter bør være planlagt å motta carboplatin-basert en
st kjemoterapi; pasientene hadde ascites på presentasjon; no anti-kreft-behandling hadde fått før ascites samling. Ascites ble prospektivt samlet men retrospektivt analysert. Alle pasientene ble behandlet på en
st Dept of Obstetrics og gynekologi (University of Athens, Alexandra General Hospital, Aten, Hellas) og Dept of Clinical Therapeutics (University of Athens, Alexandra General Hospital, Aten, Hellas). Studieprotokollen hadde passende Institutional Review Board godkjenning (Alexandra General Hospital, Aten, Hellas) og skriftlig informert samtykke ble gitt av alle fag for innsamling og studie av ascitesvæske. Studien ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i erklæringen av Helsinki.
ascitesvæske ble samlet før administreringen av systemisk behandling (enten under primær cytoreduserende kirurgi eller paracentesis hvis laparotomi ble ikke utført). Det ble blandet i sterile betingelser med heparin (2u /ml) (fra Leo Pharmaceuticals, Danmark), sentrifugert ved 4 ° C ved 1600 rpm, pellet ble kastet, og supernatanten ble lagret og avkjølt suksessivt til -20 ° C i 1-2 timer og deretter overført til fra -80 ° C, der den forble frem brukt.
Etter behandling, fikk alle pasienter følge opp sjekker med CT scan hver 6. måned og CA-125 måling hver 3. måned i henhold til institusjonelle protokollen. Pasienter som enten fikk tilbakefall under eller innen seks måneder etter fullført førstelinje kjemoterapi ble klassifisert som platina motstandsdyktig, mens pasienter over 6 måneder uten tilbakefall ble klassifisert som platina sensitiv ifølge GCIG klassifisering [17]. Tilbakefall ble bestemt ved bruk av radiologiske eller CA-125 progresjon (avhengig av hva som var først) [17].
Array basert deteksjon av angiogene faktorer
Array påvisning ble utført i 69 prøver av ascitesvæske. For å utvikle en prognostisk «signatur», ble platinamotstands brukt som et surrogat for prognose. 35 prøver fra platina sensitive pasienter og 34 prøver fra platina resistente pasienter ble analysert
Proteome Profiler
TM Menneskelig angiogenese Array Kit, (R D Systems, USA, katalognummer: Arry 007) [18] ble ansatt for å screene for tilstedeværelsen av 55 løselige angiogenese relaterte faktorer (Tabell 1) i pasientenes ascitesvæske i henhold til produsentens instruksjoner . I korthet, blir 1 ml av supernatanten fra ascitesvæske inkubert med 500 ul av en relevant buffer og 15 ul av en blanding av biotinylerte antistoff (spesifikt for hver av de 55 faktorer) i 1 time. Blandingen av ascitisk fluid supernatant-antistoff-buffer inkuberes i 16 timer ved 4 ° C med en cellulosemembran belagt med de samme antistoffer. Ikke-spesifikk binding av antistoffer mot proteiner av interesse unngås ved pre-inkubering av membranen med en blokkeringsbuffer i 1 time. Membranen ble deretter inkubert med streptavidin-HRP i 30 minutter. Lys utvikling er oppnådd ved inkubasjon med et ECL kjemisk reagens (R 0 ble beholdt. Anvendelsen av funksjonen valget til det opprinnelige datasettet ført til en undergruppe av 25 faktorer uttrykket nivåer som kan best skiller de to gruppene av pasienter (se resultater).
Evaluering av klassifikasjonsapparater «prediktive forestillinger gjennom kryssvalidering
for valg av det beste klassifikator å trene med den reduserte datasettet på 25 faktorer (se resultater), nett scan i parameterrommet av ulike klassifiseringsalgoritmer (Support Vector Machines, tilfeldige Skoger, Naive Bayes og lineær diskriminant analyse) kombinert med 4-fold kryssvalidering ble utført (se resultater avsnitt), for å optimalisere klassifiseringsparametre, bruke som et kriterium arealet under kurven (AUC) maksimering. Dette trinnet bekreftet at den beste klassifisering algoritme for dette datasettet var sammendragsverdimetrikken klassifikator (lineær kjerne, C 0,001, gamma 0,001). For ytterligere å evaluere ytelsen til alle classifiers forutsi riktig klasse (positive /resistent) av en «usett» pasient (som ikke har blitt inkludert i trening) når opplært i alle tilgjengelige merkede prøver, brukte vi en La-One utsjekking Cross Validation (LOOCV) tilnærming. I LOOCV klassifiseringsordningen, er en klassifikator trent med alle pasientprøver, bortsett fra en, som fortløpende sendes til klassen prediksjon bruker trent klassifikator (trent modell). Prosessen gjentas for hver pasientprøve og gir en estimering av resultatene for klassifisering i forhold til ukjente pasientprøver.
Alle nevnte funksjonen utvalg og klassifiserings prosedyrer ble implementert i Python scikit lære pakken.
HeatMap representasjon
for HeatMap representasjon de normaliserte uttrykk nivåer av de 25 angiogene faktorer ble først log2 transformert og de relative uttrykk ble beregnet i henhold til median uttrykk for hver faktor. En måte (kun uttrykk verdier) hierarkisk clustering ble utført i GeneARMADA (kobling metode: Gjennomsnittlig, avstand: Cosinus)
VEGF ascites nivåer
VEGF i ascites ble målt ved ELISA i henhold til produsentens. instruksjoner (R Pasienter som ikke døde eller uten tilbakefall ble sensurert på datoen for siste kontakt. Overlevelses fordelinger ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden; log-rank tester for likestilling av etterlatte funksjoner mellom behandlingsgruppene ble brukt. Cox regresjonsanalyse (univariat og multivariat) ble utført for å vurdere innvirkningen på OS og PFS av proteinprofilen ( «sensitive» vs «resistent») VEGF ( median vs. ≤ median), histologi (serøs vs. . ikke serøs), alder ( 60 vs. ≤60) og restsykdom etter primær cytoreduksjon (≤ 1 cm vs. 1 cm). Variabler med p 0,1 i univariat analyse ble inngått multivariate modellene
Resultater
Pasienter
Fra mars 2009 til januar 2013 prøver av ascites fra 69 pasienter (35 platina. sensitiv og 34 platina resistente) med ovariekreft ble oppnådd. Deres individuelle karakteristika er vist i tabell 2. I alle tilfeller ble ascites oppnådd ved innledende diagnose. I fire tilfeller ble histologi ikke bestemt fordi ingen tumorbiopsi ble oppnådd i løpet av laparoskopi og diagnostisering av adenokarsinom var basert på cytologi av peritoneal væske. Alle pasientene gjennomgikk hoved cytoreduserende kirurgi. Alle pasientene fikk førstelinje kjemoterapi etter cytoreduserende kirurgi. Seksti-fem pasienter fikk kombinasjonskjemoterapi med karboplatin /paclitaxel, mens fire fikk Carboplatin monoterapi.
Bekreftelse av Array funn med ELISA
Alle protein array-data for de 55 faktorene inngår i S1 Table. Ascites nivåer av 6 faktorer (Angiopoietin-1, TIMP-4, IL-1b, Endotelin-1, IGFBP-2 og MIP-1a) med betydelige forskjeller i rekken uttrykket mellom følsomme og resistente pasienter ble målt i 20 tilfeller (10 sensitive og 10 bestandig) med ELISA (Rådata i S2 tabell). Det ble observert en lignende trend mellom sonden og ELISA-resultatene i alle faktorer undersøkt (Tabell 3).
Resultater av funksjonsvalg og klassifikasjon
Til tross for den lave dimensjonalitet av den opprinnelige datasettet (69 prøver), en optimal kombinasjon av faktorer ble funnet, ble den diskriminerende potensialet som evaluert med anvendelse av fire forskjellige klassifiserings algoritmer. Feature valget ble utført for å finne den optimale faktor undergruppe for korrekt klassifisering, og resulterte i en undergruppe av 25 faktorer (tabell 4), som sammen maksimert til 4-fold kryssvalidering score (figur 2).
Feature utvalg kryssvaliderings score, plottet mot antall utvalgte faktorer. Den optimale undergruppe, maksimere kryssvalidering score, omfattet 25 angiogene faktorer (Tabell 3).
De forestillinger av ulike classifiers, trente med undergruppe, er vist i (figur 3) . Den SVM klassifikator hadde maksimal gjennomsnittlig AUC (0,85). De andre classifiers gitt lavere score, men bekreftet diskriminerende potensialet av faktorene undersettet, spesielt LDA med 0,84 gjennomsnittlig AUC
ROC kurver som viser forestillinger av fire ulike klasse algoritmer brukes til redusert undergruppe av fire faktorer.: a) Støtte Vector Machines b) LDA c) naive Bayes d) Tilfeldige Skoger. Den SVM klassifikator optimalt skilles de positive og negative prøver, med en gjennomsnittlig AUC på 0,85. De andre algoritmer viste lavere forestillinger, men fortsatt var i stand til å klassifisere prøvene over tilfeldig cut-off på 0,50 AUC, og dermed ytterligere bekreftet diskriminerende potensialet av de 25 faktorene.
forskjeller i uttrykket nivåer av disse 25 faktorer hos pasientene er vist i heatmap av (figur 4A). For hver pasient ble ekspresjonsnivået av hver enkelt faktor i forhold til median uttrykket hos alle 69 pasienter. Siden visualisering av separasjon av de to gruppene var ikke ideell, vi videre filtrert, og rangert de 25 faktorene ved å påføre et ekstra, entropi basert filtreringsmetode (informasjon gain), som måler betydningen av faktorene med hensyn til pasientklasser ved hjelp en entropi-basert kriterier. For den nye heatmap representasjon vi beholdt de 5 faktorene (FGF syrlig, FGF grunnleggende, HB-EGF, PDGF-AB /PDGF-BB, Thrombospondin-2), som er identifisert av både Feature Selection metoder og ble rangert høyere enn de andre i deres bidrag i den endelige signaturen. Derfor vil den nye heatmap med 5 faktorer viser et underrom av den endelige signaturen som viser en tendens til å over-uttrykk for disse faktorene i den sensitive klassen og var mer utsatt for visualisering (fig 4B).
Relativ uttrykk nivåer av de 25 angiogene faktorer, som resulterte i det høyeste 4-fold kryssvalidering stillingen (A) og den undergruppe av 5 forhold med den høyeste bidrag til signaturen (B). Expression verdier vises i henhold til fargeskalaen, der rød representerer over median uttrykk og grønt representerer under median uttrykk. Gitt kompleksiteten i uttrykket profiler blir de to pasient klassene ikke lett skilles ved clustering analyse, som rettferdiggjør bruk av mer sensitive klassifiseringsmetoder, som SVM.
LOOCV metoden ble brukt for å ytterligere evaluere prediktiv kraften av klassifiserere trenet med de 25 angiogene faktorenes optimale delsett samt undergruppe av 5 faktorene sammen med det mer tilfredsstillende heatmap visulaization, med hensyn til effektiv klassifisering av ukjente pasientprøver (se Materialer og Metoder). Med denne løsning den kliniske verdien i matrisen kit som et diagnostisk verktøy for sensitiv /motstandsdyktig pasient klassifiseringen vurderes mer nøyaktig, fordi LOOVC begrenser mer effektivt fenomenet «over-fitting» [21], karakterisert ved at klassifiseringsmodell er overdrevet montert til treningsdata og dermed ikke klarer å korrekt klassifisere helt usett prøver.
klassifikatorer prestasjoner er vist i tabell 5. med SVM klassifikator, ble 62 av de 69 pasientene klassifisert riktig ved å bruke undergruppe av 25 faktorer . Dette suksessrate (~ 90%) bekrefter at den angiogene faktoren matrisen Settet kan brukes for nøyaktig platina følsomhet prediksjon i kombinasjon med SVM algoritmen. Tvert imot, den undergruppe av 5 faktorer resulterte i lave prediksjon forestillinger.
Korrelasjon av angiogene «signatur» med PFS og OS
For disse analysene bare den optimale «signatur» som følge av undersett av 25 faktorene ble anvendt. Median oppfølgingstid på 71 måneder (95% KI 48-99). Under oppfølging, 59 pasienter tilbakefall og 46 døde av eggstokkreft. Median OS var 35 (95% CI: 24-41), mens median PFS var 12 måneder (95% KI: 9,5 til 15). Histologi, klasse og restsykdom etter debulking operasjonen var ikke forbundet med PFS eller OS. Det var en trend mot kortere PFS og OS for kvinner eldre enn 60 år (p = 0.0832 og p = 0.0834, henholdsvis).
Median VEGF ascites nivå var 1777 pg /ml. Det var ingen assosiasjon av VEGF nivå (under eller over median) med PFS (p = 0,836) eller OS (p = 0,977). Dette resultatet ble ikke endret når andre avskåret nivåer mellom 1000 og 2500 pg /ml ble studert. Det var ingen signifikant forskjell av median VEGF nivå mellom «bestandig» og «følsom» proteinprofilen (1680 vs 1779 pg /ml, p = 0,831). Tvert imot, ble de «motstandsdyktig signatur» assosiert med signifikant dårligere median PFS (8 måneder [95% CI: 8-9] vs 20 måneder [95% CI: 15-28]; HR: 8.3, p 0,001) og OS (20,5 måneder [95% CI: 13.5-30] vs 74 måneder [95% KI: 36-NR], HR: 5.6 [95% CI: 02.08 til 11.02]; p 0,001) (fig 5). Multivariate analyser inkludert alder og protein profilen viste at bare protein profilen beholdt sin prognostisk betydning både for PFS (HR 7.9 [95% CI: 4 til 15,8], p 0,001) og OS (HR: 5.2 [95% CI: 02.06 til 10.05 ]; p. 0,001)
Progresjon-fri (A) og Total (B) overlevelse. Progresjonsfri (A) og Total (B) overlevelse av 69 pasienter med fremskreden kreft i eggstokkene i henhold til ascites angiogenese-relaterte protein profil.
Diskusjoner
I denne studien har vi utviklet og testet nattbords-kompatibel «angiogen signatur», som ble sterkt assosiert med PFS og OS hos kvinner som lider av fremskreden kreft i eggstokkene. Metodikken vi brukte har produsert lovende prognostiske verktøy i andre typer kreft [22-23], selv om ulike biologiske funksjoner ble utnyttet. I tråd med våre tidligere studier, brukte vi ascites snarere enn serum. Ascites er en praktisk kilde for biologisk materiale, som kan bli undersøkt for diagnostisk [23] og terapeutiske formål. I tillegg er visse proteiner i ascitesvæske mer nøyaktig utregning av biologi av tumoren enn de i serum. Inkludering av pro- og anti-angiogene faktorer er i konsert til de in vivo mekanismene for den angiogene aktivitet, noe som er et resultat av balansen mellom disse to gruppene i microenviroment av tumoren. Angiogenese er en gyldig surrogat for tumor oppførsel og paneler av angiogene faktorer som er tilstede i svulstvevet har nylig blitt valgt for protein profilering av eggstokk-kreft [24]. For å bestemme en «god» vs en «dårlig» angiogen profilen vi ikke bruke en vilkårlig tid til tilbakefall eller død, men platina motstand i stedet. Dette surrogat har vist prognostisk og prediktiv verdi [25] og gir en bestemt og validert tidspunkt for kategorisering av eggstokkreft kreftpasienter.
ANGIOGENE profilering var basert på uttrykk for 25 angiogene faktorer (tabell 4). Selv VEGF spiller en stor rolle i angiogene prosess, det var ikke blant dem, og VEGF nivåer i ascites ikke spå for PFS eller OS Sistnevnte kunne tilskrives den relativt lille størrelsen på utvalget, men det bør også understrekes at den prognostiske og prediktive verdien av denne faktoren i eggstokkreft har vært kontroversielt. Vi og andre har vist den prognostiske betydningen av VEGF i serum eller ascites i avansert eggstokkreft [11,26-28] men denne faktoren er ikke validert, mens motstridende resultater eksisterer [29,30]. Uavhengig av kontrovers rundt den prediktive og prognostiske verdi av VEGF i eggstokkreft, vår studie viste at den prognostiske verdi av panelet av 25 faktorer som var overlegen i forhold til VEGF alene, støtter den potensielle av vår metode. På tross av den manglende prognostisk verdi av VEGF, ble flere VEGF-familiemedlemmer eller faktorer som samvirker med VEGF som inngår i panelet. De er viktige signal proteiner involvert i både vaskulogenese og angiogenese, slik som PIGF (placental vekstfaktor), PD-ECGF (blodplateavledet endotelcelle-vekstfaktor, også kjent som tymidinfosforylase [TP]) og PDGF-AB /PDGF-BB. Nylige fremskritt i kunnskapen om neoangiogenic funksjon har vist at disse faktorene stimulere den fulle kaskade av hendelser som er nødvendig for angiogenese og markeds flere potensielt uavhengige handlinger på det vaskulære endotel som endotelial mitogenese, permeabilitet, vaskulær tone, produksjon av vasoaktive molekyler og stimuleringen av monocytter kjemotakse [31]. Viktigere, har disse faktorene også blitt assosiert med resistens mot kjemoterapi, høyere sykdom scenen samt prognose i eggstokkreft [32-34]. Angiopoietin-1 (Ang-1) og Angiopoietin-2 (Ang-2) også synes å interagere med VEGF for å fremme angiogenese. De fungerer via Tie-2 reseptoren sti og begge har viktige roller i de molekylære mekanismene for blodkardannelse. Ang-en og Ang-2 ser ut til å bli målrettet av paclitaxel kjemoterapi [35]. Nylig, rettet mot disse faktorene har vist signifikant forbedring av overlevelse i tilbakevendende eggstokkreft [36].
Flere av de faktorene som inngår i vår «signatur» har blitt korrelert med svar på dagens cellegift for kreft i eggstokkene. Endotelin-1 (ET-1), er et kraftig mitogen peptid produsert av forskjellige tumorer inkludert kreft i eggstokkene. ET-1 ble funnet å være over uttrykt i pasienter som ikke reagerer på kjemoterapi. Dette er sannsynligvis knyttet til forstyrrelser av ET-1 på cellefunksjoner som spredning, medikamentindusert apoptose, invasivitet og epitelial-mesenchymale overgang [37-38]. Lignende resultater relatert til chemoresistance til paclitaxel har blitt beskrevet for den angiogene faktor HB-EGF (heparin-bindende epidermal vekstfaktor) [39]. To andre faktorer som korrelerer med resistens overfor paclitaxel gjennom hemming av paclitaxel-indusert apoptose er sur og basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-en og FGF-b) [40]. Begge spiller viktige roller i kreftutvikling og invasjon av eggstokkreft epitelial kreft.
Til slutt, to faktorer av epidermal vekstfaktor familie (EGF) ble også blant de 25 viktige faktorer. Tanaka et al [41] har vist at medlemmer av EGF-familien spiller en sentral rolle i den aggressive oppførsel av tumoren i eggstokkreft. Amfiregulin, er en godt studert protein, som er blitt funnet å være assosiert med den ovariefunksjonen og apoptose av epitelceller i eggstokkreft. Nyere studier støtter at denne faktoren har en meget signifikant korrelasjon til cisplatin motstand [42]. På den annen side, cytokin MIP-1α, opptrer via MAPK-reaksjonsveien. Den kommuniserer med VEGF via oppregulering av MAPK vei, spesielt ERK. Tran et al [43] har vist at MIP-1α induserte en T-cellerespons hos pasienter med eggstokkreft som var forbundet med et positivt resultat. Det er derfor mulig at, på tross av deres tilknytning til angiogenese, noen av de 25 faktorer kan utøve sin virkning prognostisk gjennom andre mekanismer, slik som forsterkning av immunrespons mot tumoren.
Tekniske problemer, for eksempel som tillegg av heparin i de innsamlede ascites, neppe har påvirket våre resultater. Selv om teoretisk nærvær av heparin kan interferere med HB-EGF eller VEGF-nivåer, er mengden av heparin vi anvendt er mye lavere enn den som brukes ved vanlige produsentene for effektiv koagulering, mens isoformene er tilstede, kan ikke binde ligand med høy affinitet, som vist i andre studier [44]. Våre matrise resultater viste tydelige forskjeller i ekspresjonen av denne faktor blant prøvene undersøkt (Fig 3), selv fra den samme kategori, dvs. kjemoresistent eller kjemosensitiv derfor ikke gjengi matrisen mot den ene eller den annen kategori spesifikt. Dette funnet i kombinasjon med det faktum at utviklingen av modellen var basert på forskjeller i ekspresjonen mellom resistente og sensitive tumorer og ikke på den absolutte verdi av hver faktor gjøre effekten av heparin på vår modell ubetydelig. I tillegg fant vi at heatmap representasjon, kombinert med hierarkisk clustering, ikke kan være hensiktsmessig for å visualisere en slik kompleks signatur. Ved å filtrere og rangering av de 25 faktorene, reduserte vi undergruppe til de 5 mest innflytelsesrike faktorene, og dermed produsere en mer tilfredsstillende visualisering. Ikke desto mindre ble denne undergruppen forbundet med dårligere prediktiv ytelse. Dette resultatet støtter nødvendigheten av utnyttelse av maskinlæringsmetoder for å bygge prediktive modeller, for eksempel SVMer, som er mer følsomme og i stand til å fange opp komplekse diskriminerende mønstre som bor i ikke-lineære kombinatoriske forskjeller i uttrykket nivåer mellom de to klassene.
