Abstract
Innledning
Nyere bevis tyder på at mikroskopiske lymfeknute metastaser og sirkulerende tumorceller kan ha klinisk betydning i lungekreft. Hensikten med denne studien var å identifisere nye molekylære markører for kreftceller i regionale lymfeknuter (LNS) og perifert blod (PB) fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Metoder
Kandidat markører ble valgt basert på digital transkripsjon profilering og tidligere litteratur.
KRT19
,
CEACAM5
,
EpCAM, DSG3, SFTPA, SFTPC Hotell og
SFTPB
mRNA nivåer ble først godkjent av real-time revers transkripsjon PCR basert kvantifisering i 16 NSCLC tumorer og 22 LNS og 12 PB prøver fra individer uten kjent kreft. Fem av kandidat markører ble valgt for sekundær validering av kvantifisering i parallelle tumor biopsier, regionale LNS og PB prøver fra 55 pasienter som gjennomgår kirurgi for NSCLC. LN og PB markør status ble sammenlignet med clinicopathological pasientdata.
Resultater
Alle valgte markører unntatt DSG3 var til stede på et høyt nivå i de primære svulster og ved svært lave eller ikke-detekterbare nivåer i normal LNS og PB i den første runden av validering, som indikerer et potensial for å påvise kreftceller i NSCLC pasienter. Uttrykket profiler av
KRT19
,
CEACAM5, DSG3, SFTPA Hotell og
SFTPC
mRNA ble bekreftet i større gruppe under den sekundære validering. Bruke den høyeste normal LN nivå av hver markør som terskel, 39 (71%) av de 55 pasientene hadde forhøyede nivåer av minst en markør i regionale LNS. Tilsvarende, 26 (47%) av pasientene hadde forhøyede nivåer av minst en markør i PB. En signifikant høyere antall pasienter med adenokarsinomer hadde positiv LN status for disse markørene, sammenlignet med andre histologiske typer (P = 0.004).
Konklusjoner
Flere lovende molekylære tumorcellemarkører i regionale LNS og PB ble identifisert, inkludert den nye
SFTPA
og
SFTPC
mRNA. Klinisk oppfølging i en større kohort er nødvendig for å belyse deres prognostisk verdi
Citation. Nordgård O, Singh G, Solberg S, Jørgensen L, Halvorsen AR, Smaaland R, et al. (2013) Novel Molecular Tumor Cell Markers i regionale lymfeknuter og blodprøver fra pasienter som gjennomgår kirurgi for ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (5): e62153. doi: 10,1371 /journal.pone.0062153
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 03.12.2012; Godkjent: 18 mars 2013; Publisert: 03.05.2013
Copyright: © 2013 Nordgård et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en) Sør-Øst Norge RHF og 2) Folke Hermansen Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød på verdensbasis [1]. Prognosen er best for pasienter med små svulster og ingen mediastinum eller fjernmetastaser. Pasienter med ipsilaterale hilar lymfeknutemetastaser kan motta kirurgi hvis ellers passer. TNM-systemet er allment akseptert for presurgical klassifisering [2], og guider videre behandling.
Mange pasienter med små svulster og ingen åpen lymfe-metastaser vil fortsatt gi etter for sykdommen. De fem års overlevelse hos pasienter med lokalisert sykdom er 50% hos kvinner og 41% hos menn [3]. Dette indikerer at en undergruppe av pasienter med små svulster hadde metastatisk spredning før operasjonen, og at tilgjengelige metoder for å identifisere en slik spredning har mislyktes. Ved å identifisere gjenværende cancerceller, kan utvalgte pasienter motta adjuvant behandling for å fjerne kreftceller ikke er fjernet ved operasjon.
En rekke prosjekter har som mål å finne markører for å identifisere mikrometastaser samt restkreftceller, enten som tumorceller i blod , lymfeknuter (LN) eller benmarg, eller som RNA eller proteiner avledet fra kreftceller i blod, LNS eller benmargs [4], [5]. Felles teknologi for å påvise metastaser omfatter revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR), immunocytokjemi og immunhistokjemi. Tumor celle identifikasjon av CellSearch system (basert på immunomagnetisk anrikning og immunofluorescense) eller filtreringsprosedyrene, er blitt utført både i en generell lungekreft-populasjonen [5], [6], og i pasienter som gjennomgår spesifikk behandling i en klinisk studie [7] . Kvantitativ RT-PCR-analyse av lymfeknutelysatene er antatt å være en mer følsom teknikk sammenlignet med immunhistokjemi, og denne fremgangsmåte gjør det mulig for undersøkelse av hele LNS snarere enn bare utvalgte deler. Blodprøver kan også vurderes ved RT-PCR for å påvise metastatisk sykdom, og vil være den minst invasive av metodene for å identifisere metastatiske celler.
Flere forskjellige proteiner og transkripsjoner har blitt undersøkt som tumorcellemarkører i blod og LNS. De mRNA for epitel spesifikke cytokeratin (CK) 19 og 7 har blitt foreslått som markører for mikroskopisk lymfatisk spredning [8]. Uttrykk for
SFTPB, TACSTD1
, og
PVA
har vist lovende sammenfall med lymfeknutemetastaser [9], og
CEACAM5 Hotell og
PLUNC
uttrykk i lymfeknuter ble evaluert ved hjelp av RT-PCR, avslører en sammenheng med overlevelse [10].
CEACAM5
mRNA nivåer i lymfeknuter viste en sammenheng med overlevelse i en kinesisk studie av NSCLC pasienter [11]. Resultatene har skilt, både når det gjelder deteksjon priser og klinisk effekt, muligens på grunn av forskjeller i metodikk og utvalgsstørrelser.
I denne studien har vi analysert flere putatively interessante markører i LNS og i perifert blod (PB) fra pasienter med tidlig stadium lungekreft under operasjonen. Vi sammenlignet uttrykk for de ulike markører i svulster, LNS og PB prøver i forhold til pasientens kliniske kjennetegn.
Materialer og Metoder
Pasient
Pasienter innlagt på Oslo universitetssykehus – Rikshospitalet for kirurgisk behandling av histologisk bekreftet ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble rekruttert prospektivt til studiet i perioden 2009 til 2010. Svulster fra pasienter ble inkludert i biobanken avhengig av studien sykepleier tilgjengelighet, og omtrent 53% av det totale antall lungekreftpasienter kirurgisk behandlet i løpet av denne perioden ble inkludert. Grunnlinjen klassifisering i henhold til alder, kjønn, røykestatus, scene (TNM-7-klassifisering) og histologi er presentert i tabell 1. Median alder var 66,5 år.
Etikk erklæringen
prosjektet ble godkjent av det norske Radiumhospital Institutional Review Board og Regional etisk komité South East (tillatelse nummer~~POS=HEADCOMP: S-05307). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker.
Prøver
Alle tumor biopsier ble tatt fra antagelig avgjørende svulstvev. I mindre svulster uten tegn på nekrose, ble prøvene tatt fra den sentrale delen av svulsten. I større svulster med tegn på sentral nekrose, ble prøvene tatt fra flere perifere deler av tumoren. Arbeidet ble gjort for å ta ren svulstvev, uten omgir lungevevet.
LN prøvetaking i de fleste tilfeller ble gjort i henhold til European Society of Thoracic Surgeons (interesser) retningslinjer [12]. Prøvene ble hovedsakelig tatt fra den forventede dreneringsområdet av tumoren. Noen få unntak skjedde i situasjoner når kirurgen mistenkt patologi i andre LN-stasjoner.
En til fire hilar LNS ble dissekert fra kirurgiske prøver av alle pasienter, slik at halvparten av node for rutinemessig patologisk gjennomgang og en halv for molekylær analyser. Både tumorvevet og lymfeknuter ble hurtigfrosset i flytende nitrogen i operasjonsrommet, og lagret ved -80 ° C til RNA-isolering. Tumorcelleinnholdet i tumorprøver var mer enn 70% i de fleste prøver.
Seksten kreftfrie LNS fra 8 pasienter som gjennomgår kirurgi for benigne kolon sykdommer og 6 LNS fra 6 pasienter som gjennomgår kirurgi for benigne lungesykdommer var samlet som vanlig LN referansemateriale.
for alle pasientene 2,5 ml blod ble samlet inn i PAX-rør før operasjonen for RNA bevaring. Blodprøvene ble trukket fra en veneport, og prøvene trukket for forskning var ikke den første; dermed epitelcelledifferensiering forurensning var usannsynlig. Perifere blodprøver ble også innhentet fra 12 friske kontroller.
RNA Utvinning
LNS og svulstvev ble homogenisert og lysert og RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol (Invitrogen).
for blodprøver, ble PAXgene blod RNA rørene tint ved romtemperatur over natten. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av PAXgene Blood miRNA Isolation Kit, i henhold til produsentens instruksjoner. RNA mengde og renhet ble vurdert ved hjelp av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoFisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA). RNA kvalitet ble kontrollert av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).
DNase-behandling og revers transkripsjon
RNA ble DNAse behandlet ved inkubasjon 500 ng total RNA fra hver prøve med en enhet RQ1 RNAse-fri DNAse (Promega) i et totalvolum på 10 l 1 x First Strand Synthesis buffer (Invitrogen) inneholdende 10 enheter RNAseOUT RNAse inhibitor (Invitrogen). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter og den DNAse inaktiveres ved tilsetning av en l RQ1 stopp-løsning og inkubere i 10 minutter ved 65 ° C. Komplementært DNA ble syntetisert fra DNase-behandlede RNA av M-MLV revers transkriptase i et totalvolum på 20 l henhold til produsentens protokoll (Invitrogen).
PCR-primere
Minst en av PCR-primerne i hvert primer-par ble utformet for å strekke seg over exon /exon grenser eller de var utformet for å bindes til forskjellige eksoner. Identiteten til de evaluerte markør utskrifter og primersekvensene er oppført i tabell 2.
Kvantitativ PCR
PCR presiseringer ble utført med qPCR SYBR Green Core kit (Eurogentec) i henhold til produsentens anbefalinger. Revers transkribert RNA (20 ng) ble amplifisert i et totalvolum på 25 l inneholdende 1 x reaksjonsbuffer, 0.2 mM dNTP, 0,75 l 1:200 SYBR grønn I fortynnet i DMSO og MgCl, forover og revers primer konsentrasjoner som vist i Tabell 2. termocykling og sanntids fluorescens-målinger ble utført i et Mx3000P real-time PCR instrument (Stratagene), med et aktiveringstrinn i 10 min ved 95 ° C etterfulgt av 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C og 60 sekunder ved 60 ° C. Deretter ble PCR-produktene analysert ved smeltekurver. Alle smeltekurver avslørte veldefinerte topper med de forventede smeltetemperaturer, noe som bekrefter spesifisiteten av primerne under reaksjonsbetingelsene. Amplicon identiteter ble også bekreftet ved sekvensering. Reaksjons oppsett, mal tilsetning og termocykling ble utført i tre separate, dedikerte rom. Kontroller som inneholder ingen mal ble inkludert i hvert løp for å overvåke potensielle forurensning.
relative nivåer av hver markør mRNA ble bestemt ved normalisering mot BCR referansen transkripsjon og en kalibrator prøve som inngår i hvert løp, ved hjelp av modellen [13] , [14]. Kalibratoren Prøven ble fremstilt ved å blande RNA fra NCI-H441 (European Collection of Cell Cultures) cellelinje (50%) og to NSCLC-tumorer (25% hver), valgt på grunn av høye nivåer av alle mulige markører. Reproduserbarheten av analysene ble bestemt ved å måle de samme referanseprøven i fem på hverandre følgende forsøk. Koeffisientene i strid bestemt var 7,5%, 9,6%, 6,1%, 7,3% og 8,1% for
CK19
,
CEACAM5, DSG-3, SFTPA
, og
SFTPC
analyser, henholdsvis. Terskelnivåer for positivitet til hver markør i blod og lymfe ble satt til det høyeste nivået i normale LNS og PB prøver.
The real-time PCR quantifications ble utført av to personer (GS og ON), som ble blindet til egenskapene til pasientene og primærsvulster.
bioinformatiske Marker Searches
Uttrykt sekvens tag bibliotek (EST) og serie analyse av genuttrykk (SAGE) bibliotekene ble søkt etter søker markører av cDNA og SAGE digital genuttrykk displayer (DGED) verktøy ved Kreft Gene Anatomy Project (CGAP) nettside (www.ncbi.nih.gov/cgap). I detalj, ble alle tilgjengelige EST biblioteker fra normal voksen lungevev og lunge kreft (pool A) sammenlignet med biblioteker fra normale LNS og normale perifere mononukleære blodceller (basseng B). Den DGED verktøy produsert en scoringslisten av gener bestilt i henhold til uttrykk nivåforskjeller mellom de to bibliotek bassenger, beregnet for hver transkripsjon som forholdet mellom sekvenser i bassenget A versus basseng B. SAGE DGED søk ble gjort på samme måte. Transkripsjoner bosatt i toppen av både høy score-listen (EST og SAGE DGED) ble valgt for ytterligere karakterisering. Høye nivåer i mange av bassenget et bibliotek ble foretrukket til ekstremt høye nivåer i et begrenset antall av dem.
Statistical Analysis
mRNA nivåer ble vanligvis ikke distribuert og ble sammenlignet med Mann-Whitney U-test. Kategoriske data ble sammenliknet med Fishers eksakte test. Prinsipal komponent analyse [15] ble gjort av
prcomp
funksjon i R [16], skalering variablene å ha varians enhet før analysen. To-sidige statistiske tester ble utført og p-verdier P0.05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle beregningene som ble gjort med R programvarepakken (www.r-project.org) versjon 2.13.1.
Resultater
Utvalg og validering av søker Markers
Vi systematisk søkte uttrykte sekvens tag (EST) og serie analyse av genuttrykk (SAGE) biblioteker for mRNA som var potensielle markører for kreftceller i lymfeknuter (LNS) og perifert blod (PB) fra NSCLC pasienter. Kandidat markører ble scoret i henhold til uttrykket nivåforskjell mellom lungekreft og normal LNS /PB. Fra listene av vitnemål med høyest score, valgte vi keratin 19 (
KRT19
), carcinoembryonic antigen relaterte celleadhesjonsmolekyl (
CEACAM5
), epitelceller adhesjonsmolekyl (
EpCAM
), overflateproteiner A (
SFTPA
) og C (
SFTPC
) for videre validering som kandidat markører.
KRT19, CEACAM5 Hotell og
EpCAM
mRNA hadde blitt rapportert tidligere så lovende tumorcellemarkører i LNS fra NSCLC pasienter [17], mens
SFTPA Hotell og
SFTPC
var nye gener i denne sammenheng. Basert på tidligere litteratur, har vi også valgt desmoglein 3
DSG3 Hotell og overflateaktivt protein B (
SFTPB
) mRNA for ytterligere validering [17]. Overflateaktive proteiner er viktige komponenter i lungeoverflateaktivt middel fluidet, noe som er viktig for funksjonen og homeostasis av lunge alveoles. SFTPA er primært involvert i forsvaret mot respiratoriske patogener [18], mens SFTPB og SFTPC opprettholde nøyaktige tilstanden til lipid surfaktant film [19].
Som et første validering av de 7 kandidat markører, vi målte deres nivåer i 16 NSCLC tumorbiopsi, 22 kreftfrie LNS og 12 normale kontroll PB prøver med kvantitativ RT-PCR (figur 1). Med unntak av
DSG3
, nivåene av alle merkene var mye høyere i svulstene sammenlignet med kontroll LNS og PB (P0.001).
CEACAM5 Hotell og
SFTPC
mRNA var umulig å oppdage i vanlige blodprøver. Interessant, nivået av
SFTPA
mRNA i de 6 kontroll LNS fra lungene var betydelig høyere enn i kontroll LNS fra tykktarmen mesentery (P = 0,002). En tilsvarende tendens, men ikke statistisk signifikant, ble også observert for
SFTPB Hotell og
SFTPC
, men ikke for de gjenværende kandidat markører.
Medianverdier er angitt med kort horisontal linjer, mens prøver med nivåer under påvisningsgrensen (LOD) er angitt nedenfor den stiplede horisontale linjen. Nivåene av de ulike markørene står i forhold til en kalibrator prøve og ikke direkte sammenlignbare.
Vi beregnet spesifisitet indekser for hver markør ved å dividere median svulst nivået til hver markør ved det høyeste nivået i normale kontroll LNS og PB prøver (data ikke vist) [20]. De tre høyeste spesifisitet indekser ble oppnådd for
SFTPB
,
CEACAM5
, og
SFTPA plakater (synkende rekkefølge) i LNS og for
SFTPA
,
KRT19
, og
SFTPB
i PB. Spesifisitet indekser for
CEACAM5 Hotell og
SFTPC
i blodet kan ikke beregnes på grunn av ikke målbare markør nivåer i normal blod. Vi konkluderte med at alle vurderes kandidater unntatt
DSG3
syntes å ha godt potensial som tumorcellemarkører i pasient LNS og PB prøver, ifølge uttrykk nivåforskjeller mellom svulster og prøven type interesse.
spesifikke epiteliale mRNA kan nedregulert i undergrupper av svulster, redusere deres nytte som metastasemarkører i de tilsvarende pasienter. Følgelig utførte vi prinsipal komponent analyse av markør nivåer i 16 undersøkte NSCLC tumorer å identifisere covariations. De to første hovedkomponenter forklarte 62% av variansen i datasettet. En biplot av de opprinnelige variablene (relativ mRNA konsentrasjoner) og tumorprøver projiseres på de to første hovedkomponenter vist at
SFTPA
,
SFTPB Hotell og
SFTPC
mRNA nivåer ble korrelert med hverandre (piler som peker i samme retning), mens
EpCAM Hotell og
CEACAM5 Hotell og
KRT19
mRNA også covariated (figur 2). Slik velger du et sett av kandidat markører optimalt som dekker hele spekteret av NSCLC kreft, har vi valgt to markører fra hver av disse samvariasjon grupper for ytterligere validering i tillegg til
DSG3
, som syntes å ha en selvstendig primærtumor uttrykk mønster. Den resulterende markør Panelet besto av
KRT19
,
CEACAM5
,
DSG3
,
SFTPA
, og
SFTPC
mRNA.
de svarte sirklene viser eksempel data projiseres på første og andre hovedkomponenter. De røde pilene viser de gamle variable akser anslått til hovedkomponentene.
Marker Levels i tumorer, LNS, og blodprøver fra NSCLC pasienter
For ytterligere å validere 5 markører i raffinert panel, vi fast bestemt på deres relative nivåer i svulster (inkludert 16 fra den første validering), regionale LNS og PB prøver fra 55 NSCLC pasienter som gjennomgår kirurgisk behandling (figur 3). Totalt 84 LNS fra 55 pasienter ble undersøkt (gjennomsnittlig 1,5 LN /pasient, range 1-3). Noen av pasientenes LNS og PB prøvene hadde forhøyede nivåer sammenlignet med normale kontroller. Imidlertid markør nivåer i LNS hentes fra pasienter med positiv node status (pN +) i henhold til rutinemessig histologiske undersøkelser, var ikke signifikant forskjellig fra de andre LNS, selv om det var klare trender for noen av markørene (data ikke vist). Vi brukte den høyeste normale nivå av hver markør som en terskel for å definere patologien i LNS og PB prøver, siden forhøyede nivåer som mest sannsynlig var på grunn av tilstedeværelsen av tumorceller. Basert på disse tersklene, bestemt vi antallet pasienter positive for hver svulst celle markør i LNS og PB prøver (Tabell 3). I alt 39 (71%) av de 55 pasientene var positive for minst en markør i de undersøkte LNS, mens 26 (47%) av pasientene hadde positive PB prøver. For LNS, alle fem markører har bidratt vesentlig til å identifisere pasienter med molekylært bevis på LN metastaser. I PB prøver,
KRT19
mRNA spilt en dominerende rolle i å identifisere potensielle sirkulerende tumorceller. Betydelig overlapping mellom de forskjellige markørene ble observert. Det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom LN og PB markør status.
Medianverdier er angitt med korte horisontale linjer, mens prøver med nivåer under påvisningsgrensen (LOD) er angitt nedenfor den stiplede horisontale linjen. Nivåene av de ulike markørene står i forhold til en kalibrator prøven og er ikke direkte sammenlignbare.
Sammenligning med Clinicopathological data
molekylært bestemt LN og PB tumorcelle status og clinicopathological pasientdata (tabell 1) ble sammenlignet, men bare en statistisk signifikant sammenheng ble identifisert. En signifikant høyere antall LN-positive pasienter hadde adenokarsinomer sammenlignet med andre histologiske tumortyper (P = 0.004). Vi testet om dette funnet var knyttet til den primære svulsten nivåer av de individuelle markører, og funnet ut at
SFTPC
nivåene var signifikant høyere i adenokarsinomer enn i andre tumor undergrupper (P = 0,005). Men
SFTPA
,
CEACAM5 Hotell og
DSG3
utstilt lignende trender, med borderline betydning (P = 0,06, P = 0,07, og P = 0,09, henholdsvis).
for ytterligere å undersøke forholdet mellom primærtumor nivåer av hver markør og histologi subtype informasjon, ble prinsipal komponent analyse utført (figur 4). Den resulterende biplot viste at primær
SFTPA
og
SFTPC
nivåer ble korrelerte, samt
KRT19 Kjøpe og
DSG3
nivåer. Plateepitelkarsinom syntes å ha høye nivåer av begge disse markør grupper, men ikke for
CEACAM5
mRNA. Mann-Whitney U tester bekreftet betydelig lavere
CEACAM5
mRNA nivåer og høyere
DSG3
mRNA nivåer i squaumous cellekreft (P = 0,003 og p = 0,002, henholdsvis).
svarte tall indikerer histologi type (1 = adenokarsinom, 2 = adenosquamous karsinom, 3 = bronchioloalveolar karsinom, 4 = karsinoid, 5 = stor celle karsinom, 6 = småcellet karsinom, 7 = plateepitelkarsinom).
diskusjon
for å undersøke den kliniske betydningen av tumor celle spredning til regionale LNS og PB i NSCLC pasienter, er optimale deteksjonsmetoder nødvendig. I vår studie valgte vi en indirekte gjenkjenning tilnærming, ansette epitelceller spesifikke karakterutskrifter som surrogatmarkører for tumorceller. Følgelig ble flere lovende markører for kreftceller i regionale LNS og PB identifisert og evaluert i denne studien. Grundig validering i kliniske prøver viste at
KRT19
,
CEACAM5
,
SFTPA
,
SFTPC
og
DSG3
var lovende markører for tumorceller i LNS og PB fra NSCLC.
KRT19
,
CEACAM5 Hotell og
DSG3
markører har vært rapportert tidligere [9], mens
SFTPA Hotell og
SFTPC
var romanen i denne sammenheng.
Basert på resultatene fra våre valideringer og prinsipal komponent analyse av primærtumor nivåer vist i Figur 4, foreslår vi at du bruker en multimarker panel bestående av
KRT19
,
CEACAM5 Hotell og
SFTPA
. Disse tre markører representerer de tre gruppene i biplot analysen, noe som tyder på at alle 55 tumorer i vårt validering kullet hadde høye nivåer av minst en markør. Alle markører ble funnet på svært lave nivåer i normale LNS og PB, mens alle unntatt
DSG3
ble uttrykt ved høye nivåer i de fleste svulster.
DSG3
ble uttrykt ved høye nivåer i de fleste plateepitelkarsinom (figur 4 og [9]), men det samme gjaldt også for
KRT19
. Fordi
KRT19
var også utbredt i andre histologiske subtyper, og hadde en større uttrykk nivåforskjeller mellom svulster, LNS og PB, favoriserer vi denne markøren fra
KRT19 Twitter /
DSG3
gruppe. Den foreslåtte multimarker panel trenger å bli undersøkt for klinisk effekt i fremtidige studier.
Alle markører undersøkt i denne studien var knyttet til en epitelial fenotype, som en konsekvens av våre bør søkekriterier. Nyere data tyder på at noen CTCs gjennomgår en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), noe som kan lette deres migrering og evne til å invadere andre organer [21], [22]. Denne overgangen er til en viss grad forbundet med en nedregulering av epiteliale gener, noe som betyr at berørte CTCs vil være vanskeligere å oppdage med analyser avhengige av epitel transkripsjoner og proteiner. Til tross for dette, er de fleste nåværende tilgjengelige CTC berikelse og deteksjonsmetoder basert på epiteliale markører [23], [24]. For å redusere problemet, foreslår vi at du bruker en kombinasjon av flere epiteliale markører, som multimarker analysen antydet i dagens papir. Slike analyser vil være mindre sårbare for nedregulering av spesifikke epitel transkripsjoner enn enkelt markør analyser.
Vi forventet høyere positivitet priser av våre molekylære markører i LNS fra pasienter med LN metastaser identifisert ved rutinemessig undersøkelse av alle hentet noder (PN1 ), sammenlignet med node-negative pasienter (pN0). Denne forventningen var basert både på vår forrige molekylære analyser av sentinel LNS fra tykktarmskreftpasienter [25], [26] og på tidligere rapporter om tumor celle spredning i NSCLC [4], [27]. Vi har imidlertid ikke observere noen signifikant sammenheng mellom pN scene og vår molekylær LN-analyse i denne studien. En forklaring på dette kan være det lave antall noder som ble analysert fra hver pasient i vårt studium (gjennomsnittlig 1,5), noe som øker den relative sannsynlighet for tilstedeværelse av metastaser i noder ikke analysert. For å avklare dette spørsmålet ville det være interessant å sammenligne rutine histologisk analyse av enkelt LNS til våre molekylære analyser. Men histologisk bestemt metastasestatus for enkeltnoder var ikke tilgjengelig i denne studien. På den annen side, ni av de 12 node-positive pasienter hadde positive LNS av våre markører, som er akseptabelt med tanke på antall LNS analysert i betraktning. Den viktigste årsaken til mangelen på statistisk signifikans synes å være det høye antall positive funn i ellers node-negative pasienter, som kan være på grunn av okkult metastaser.
På samme måte ble det observert ingen signifikant sammenheng mellom klinisk stadium og sirkulerende tumorceller (CTC) status. Dette står i kontrast med studiet av Krebs et al, der betydelig flere CTC positiv stadium IV lungekreftpasienter ble funnet sammenlignet med de med stadium III kreft [6]. Vår studie inkluderte svært få stadium III og ingen stadium IV pasienter, noe som gjør en direkte sammenligning vanskelig. Antallet CTCs forventes å være lavere i tidlig fase kreft, som observert i brystkreft [23]. Videre Krebs et al. brukte CellSearch system for å oppdage CTCs, mens vi brukte real-time kvantitativ RT-PCR, også redusere sammenlignbarheten. Videre markøren nivåer i våre blodprøver var knapt over deteksjonsgrensene (figur 3), spesielt i tilfelle av
CEACAM5
og SFPTC. På grunn av potensielt lav reproduserbarhet nær deteksjonsgrensen, vi reanalysert alle
CEACAM5 Hotell og
SFTPC
positive blodprøver for bekreftelse (data ikke vist). De lave markør nivåene trolig samsvarer heller lave CTC tall. Dette stemmer overens med observasjoner i Pasienter med tidlig brystkreft [28]. I prinsippet, er deteksjon av 1-2 CTCs utsatt for lav reproduserbarhet. Den CellSearch Systemet er basert på 7,5 ml blodprøver. Blodprøven volum i vår studie var begrenset til 2,5 ml, noe som ytterligere reduserer sannsynligheten for å oppdage CTCs.
Tilgjengeligheten av hilar LNS fra pasienter uten kreft var lav. Derfor har vi også analysert 16 LNS fra colonic mesentery som normalt referansemateriale. Det kan argumenteres for at mesenteriets LNS er strengt tatt ikke sammenlignbare med LNS fra lungene. Følgelig vi faktisk observerer høyere nivåer av overflateaktivt protein mRNA i de seks mediastinum LNS. En enkel forklaring på dette kan være at mediastinum LNS ble forurenset av epitelceller fra lungene, enten gjennom kirurgisk behandling eller den normale fysiologiske aktiviteten til LNS. Men det faktum at andre markører hadde tilsvarende nivåer i begge LN-gruppene synes å motsette seg denne forklaringen. På den annen side, de overflate mRNAer var ikke til stede i kolonepitelet. Likevel, fordi vi brukte de høyeste markør nivåene i kontrollgruppen som en terskel for positivitet, de mediastinum LNS bestemmes terskelen for
SFTPA
,
SFTPB Hotell og
SFTPC
markører.
Vi fant ingen sammenheng mellom LN og PB prøve nivåer av våre markører. Dette kan skyldes forskjellige ruter av metastatisk spredning, som noen svulster spres gjennom lymfesystemet, mens andre spres gjennom blodet. Høye nivåer av LN epiteliale-spesifikt mRNA antas å representere tumorceller med metastatisk potensiale. Imidlertid kan slike nivåer representere celler som stammer fra svulsten, men det er i ferd med å bli utryddet av immunsystemet, eller cellerester. En slik forskjellsbehandling kan ikke fastslås i denne studien, og den kliniske effekten må vurderes i fremtidige studier.
Ingen signifikant forskjell ble identifisert i positivitet priser mellom ulike kreftstadier, eller mellom menn og kvinner. Flere pasienter med adenokarsinomer hadde høye kreft nivåer av noen av de undersøkte markører, sammenlignet med de med plateepitelkarsinom, men dette bør interpreteded forsiktig på grunn av den lille størrelsen på utvalget.
Leger trenger forbedringer i hvordan å stratifisere pasienter for adjuvant behandling. Våre gullstandarden, TNM-klassifisering system, ikke gir tilfredsstillende og nøyaktige beregninger av overlevelse. Dette indikerer at pasienter som kan ha nytte av adjuvant behandling ikke vil bli tilbudt en slik, mens noen pasienter kurert ved kirurgi alene motta unødvendig adjuvant behandling. Forbedret diskriminering mellom pasienter med resttumorceller, potensielt behov for tilleggsbehandling, og de uten dette behovet, ville nytte pasienter.
I konklusjonen, data som støtter den kliniske relevansen av okkulte lymfeknutemetastaser og sirkulerende tumorceller i lungekreftpasienter dukker [5], [29]. Prediksjon av utfallet og behandlingsrespons er blant de potensielle kliniske applikasjoner. I den foreliggende undersøkelse har vi identifisert et panel av lovende tumorcellemarkører i LNS og PB prøver fra pasienter med tidlig stadium lungekreft. Ytterligere karakterisering er nødvendig for å avklare den kliniske effekten av våre funn og å identifisere nye mål for økt risiko forebygging og skreddersøm av terapi.
Takk
Vi ønsker å takke Ingjerd Solvoll for praktisk bistand.
