Abstract
Hensikt
glycin N-metyltransferase (GNMT) påvirker genetisk stabilitet ved å regulere forholdet av S-adenosylmetionin til S-adenosylhomocystein, ved binding til folat, og ved å samhandle med miljø kreftfremkallende. I taiwanske menn, ble GNMT funnet å være en svulst mottakelighet genet for prostatakreft. Imidlertid har foreningen av GNMT med prostatakreft risiko i andre etniske grupper ikke undersøkt. Det ble nylig rapportert at sarkosin, som reguleres av GNMT, økte markant i metastatisk prostatakreft. Vi utforsket herved sammenslutning av GNMT polymorfismer med prostatakreft risiko individer av europeisk avstamming fra helsepersonell oppfølgingsstudie (HPFS).
Metoder
Det er totalt 661 hendelsen prostata krefttilfeller og 656 kontroller ble identifisert fra HPFS. Den GNMT kort tandem repeat polymorfisme 1 (STRP1), 4-bp innsetting /sletting polymorfismer (INS /DEL) og enkeltnukleotidpolymorfi rs10948059 ble genotypet for å teste for deres tilknytning til prostata kreftrisiko.
Resultater
rs10948059 T /T genotype ble assosiert med en 1,62 ganger økning i prostatakreft risiko (95% konfidensintervall (CI): 1,18, 2,22) sammenlignet med C /C genotype. Den STRP1 ≥16GAs /≥16GAs genotype var assosiert med redusert risiko for prostatakreft sammenlignet med 16GAs / 16GAs genotype (odds ratio (OR) = 0,68; 95% KI: 0,46, 1,01). INS /DEL ikke forbundet med prostata kreftrisiko. Haplotyper inneholder rs10948059 T-allelet var signifikant assosiert med økt prostata kreftrisiko.
Konklusjon
I menn av europeisk avstamning, ble det GNMT rs10948059 og STRP1 forbundet med prostata kreftrisiko. Sammenlignet med studie utført i taiwanske menn, mottakelighet GNMT alleler for prostatakreft hadde en omvendt forhold. Denne studien fremhever forskjellene i allele frekvenser og prostatakreft mottakelighet i ulike etnisiteter
Citation. Chen M, Huang Y-L, Huang Y-C, Shui IM, Giovannucci E, Chen Y-C, et al. (2014) genetisk polymorfisme av Glycine N-metyltransferase og Prostate Cancer Risk i Health Professionals Follow-Up Study. PLoS ONE 9 (5): e94683. doi: 10,1371 /journal.pone.0094683
Redaktør: Qing-Yi Wei, Duke Cancer Institute, USA
mottatt: 05.01.2014; Godkjent: 18 mars 2014; Publisert: 06.05.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Science Council of republikken Kina (National Research Program for Biopharmaceuticals [NRPB], gi NSC102-2325-B-037-009), Kunnskapsdepartementet i republikken Kina (Aim for Top Universitetet Plan), Mackay Memorial Hospital (gi MMH-10185), og National Institutes of Health (P01CA055075). Irene Shui er støttet av NCI NRSA T32 CA09001 (PI: Stampfer) og US Army prostatakreft Post-doc. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glysin N-metyltransferase (GNMT, EC2.1.1.20) er et protein med flere funksjoner. Det påvirker genetisk stabilitet ved å regulere forholdet av S-adenosylmethionin (SAM) til S-adenosylhomocystein (SAH), ved å binde seg til folat [1], [2], og ved å samhandle med karsinogener som benzo (a) pyren og aflatoksin B1 . Vi har tidligere vist at disse interaksjonene forandret leveren avgiftning reaksjonsveien og hindret DNA-addukt-dannelse og påfølgende cytotoksisitet [3] – [5]. I tillegg regulerer GNMT gener relatert til avrusning og antioxidation trasé [6]. Vi har tidligere gitt en Gnmt – /- mus modell og viste at Gnmt – /- mus utviklet kronisk hepatitt og glykogen lagring sykdom i leveren [7]. Den Gnmt – /- mus ble fulgt til 24 måneder gammel, og all den kvinnelige og halvparten av den mannlige mus utviklet leverkreft (HCC) spontant [8]. Disse funnene tyder på at GNMT mangel fører til redusert evne i å utrydde endogene frie radikaler og xenobiotiske forbindelser både på cellenivå og i en dyremodell; og derfor er meget viktig for cellulær beskyttelse mot både endogene og eksogene spenning homeostase av GNMT uttrykk.
GNMT er uttrykt i lever, bukspyttkjertel, prostata, nyre og [9]. I studier utført i taiwanske menn, ble GNMT funnet å være en svulst mottakelighet genet for HCC [9], [10] og prostata kreft [11]. Men foreningen av GNMT med prostatakreft i andre raser eller etniske grupper er fortsatt uklart. En fersk studie av Sreekumar et al. rapportert at sarkosin (N-metylglycin) – en differensial metabolitt regulert av GNMT – økte markert i vev og serum av metastatisk prostatakreft og ble funnet i urinen etter digital rektal undersøkelse i organ-begrenset sykdom [12]. De viste en trinnvis økning av sarcosine vev konsentrasjon under prostatakreft progresjon fra godartet prostata til klinisk lokalisert prostatakreft til metastatisk sykdom. GNMT er enzymet som er ansvarlig for konvertering av glycin til sarkosin, og de viste at knockdown av GNMT attenuert prostatakreft invasjon. Men senere studier på rollen sarcosine som en potensiell biomarkør for tidlig å oppdage prostatakreft klarte ikke å se noen sammenheng mellom sarcosine konsentrasjon i urinen og enten svulst klasse eller tumor stadium [13], [14], og studier om sammenhengen mellom serum Sarcosine nivåer og prostatakreft rapportert motstridende resultater [15] – [17]
den menneskelige GNMT genet ligger på kromosom 6p12 og vi rapporterte tidligere at det har 3 polymorfe steder i promotorområdet som kan påvirke transkripsjonen. aktivitet: kort tandem repeat 1 (STRP1), en (GA) n dinucleotide gjenta polymorfisme, INS /DEL med innsetting eller sletting av en GAGT tetranukleotid, og rs10948059 [9], [11], [18]. En fersk studie i italienerne etter Ianni et al. viste at GNMT rs9462856 T-allel, som også ligger i den promoter-regionen oppstrøms for rs10948059, var assosiert med øket risiko for prostatakreft [19]. Bruk av offentlig tilgjengelig HapMap versjon 3, slipper R2 database, sterk koblingsulikevekt ble funnet mellom Ianni et al. Rs9462856 og rs10948059 (D «= 1,000 og r
2 = 0,760 i Utah innbyggere med Nord- og Vest-europeisk opphav fra den CEPH innsamling og D «= 0,946 og r
2 = 0,737 i Han-kinesere i Beijing, Kina). I denne studien, vi prøvde å bestemme sammenslutning av de GNMT polymorfismer STRP1, INS /DEL og rs10948059 og prostatakreft risiko i amerikanere av europeisk herkomst.
Metoder
Study befolkningen
i denne nested case-control studie, ble hendelsen prostata kreft tilfeller identifisert fra de pågående Health Professionals Follow-up Study (HPFS) i USA. I 1986 ble 51,529 menn i helse yrker (f.eks, tannleger, farmasøyter, optikere, osteopat leger, Fotpleie og veterinærer) innrullert i HPFS. Ved baseline deltakere fullførte et spørreskjema om demografi, sykdommer og helserelaterte temaer. Disse spørreskjemaene ble gjentatt hvert annet år. Informasjon om dødsfall ble hentet fra familiemedlemmer, oppfølging spørreskjemaer, eller et søk i National Death Index og ble gjennomført mars 2011 [20].
Mellom 1993 og 1995, blodprøver ble innhentet fra 18,018 deltakere , samlet i EDTA-rør, sendt med kurér, og sentrifugert. Aliquoter, inkludert plasma, erytrocytter, og buffy coat, ble lagret i flytende nitrogen, og DNA ble ekstrahert ved anvendelse av en QIAamp blod ekstraksjon kit (Qiagen, Inc., Valencia, California).
I alt 661 innfallende prostata krefttilfeller og 656 kontroller ble identifisert fra HPFS for vår studie fra 1993 (tidspunktet for blod retur) og 31. januar 2000. Matching var en-til-en. Hvert tilfelle ble matchet med en kontroll som var i live, ikke hadde blitt diagnostisert med kreft ved dato for saken diagnose, og hadde en prostataspesifikt antigen (PSA) test utført. Vi begrenset analysen til personer av europeisk avstamming for å redusere potensialet for befolkningen lagdeling.
Demografiske data registrert fra alle fag inkludert alder, kroppsmasseindeks (BMI), og familiehistorie med prostatakreft. I prostatakreft tilfeller clinicopathological data inkludert PSA-nivå, Gleason score og sykdom scenen ble spilt inn. Pasientene ble klassifisert med aggressiv prostatakreft hvis de hadde PSA 20 ng /ml, tumor stadium ≥III eller N1 eller M1, eller Gleason scorer ≥8. Dødelige prostata kreft tilfeller var de som hadde metastaser ved diagnose eller som utviklet seg til metastaser eller prostatakreft bestemt død. Denne studien ble godkjent av bilder av mennesker utvalget ved Harvard School of Public Health and Human Emner Utvalget ved Brigham and Women Hospital. Skriftlig samtykke ble gitt av pasientene for deres informasjon skal lagres på sykehuset database og brukes til forskning
Genotyping av GNMT genetisk polymorfisme
Tre polymorfismer av GNMT ble analysert i denne studien.: STRP1, INS /DEL og rs10948059. En TaqMan 5′-nuklease-analyse ble brukt for genotyping av rs10948059, og automatisert fragmentanalyse (Genescan) ble anvendt for genotyping av STRP1 og INS /DEL. Detaljer om metoder og primere som brukes er beskrevet tidligere [18].
Statistisk analyse
genotypefrekvensene ble testet for Hardy-Weinberg likevekt mellom kontroller av chi-kvadrat test. Odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (KI) ble beregnet for assosiasjoner mellom hver genotype med prostatakreft ved logis regresjonsmodeller justert for alder ved blodprøvetaking. Analyser begrenset til prostata kreft undergrupper (f.eks aggressive og dødelige) brukte alle kontroller. Vi brukte polytomous logistisk regresjon for å vurdere om de assosiasjoner var annerledes med aggressive og ikke-aggressive kreftformer. Den GENECOUNTING programvaren (versjon 2.0), som implementerer en estimering-maksimering algoritme, ble brukt til å estimere haplotype frekvenser og for å beregne koblingsulikevekt mellom markører [21], [22]. Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av SAS v9.2 statistisk programvare (SAS Institute, Cary NC), og 2-sidig p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Kjennetegn på studien. deltakerne ble beskrevet i en tidligere studie [23] og utvalgte kjennetegn er presentert i tabell 1. i sammendraget, gjennomsnittsalderen på blodprøvetaking i saker og kontroller var ca 66 år og gjennomsnittsalderen ved diagnose i tilfeller var ca 69 år. . Fjorten prosent av prostata kreft tilfeller og 11 prosent av kontrollene hadde en familie historie av prostatakreft
I prostatakreft tilfeller median PSA-nivå var 7,0 (interkvartilt område: 5,2, 10,8), med fleste pasientene (n = 445, 67,3%) har et begynnende PSA-nivå 10 ng /ml eller mindre. Kun 67 (10,1%) tilfeller hadde en Gleason poengsum mellom 8 og 10, og de fleste (n = 546, 82,6%) av tilfellene hadde T1 eller T2 sykdom. Tjuefire prosent (161) av tilfellene ble klassifisert som aggressiv og 11,8% (78) hadde fjernmetastaser ved diagnose eller kommet til død eller metastaser.
rs10948059 genotypefrekvensene i kontrollene var i Hardy-Weinberg likevekt ( p = 0,55). Det var en økt risiko for total prostatakreft for de med T /T genotype sammenlignet med C /C-genotype (OR = 1,62; 95% CI: 1,18, 2,22) (tabell 2). Forholdet var suggestively sterkere i ikke-aggressive tilfeller (OR = 1,81; 95% CI: 1,30, 2,53) sammenlignet med aggressive tilfeller (SV = 1,21; 95% CI: 0,76, 1,92) selv om p-heterogenitet (0,09) var ikke statistisk signifikant (tabell 3)
STRP1 alleler ble kategorisert i to grupper:. 16GAs og ≥16GAs. Genotypiske frekvenser i kontrollene var: 32,8% 16GAs / 16GAs, 56,3% 16GAs /≥16GAs, og 11,0% ≥16GAs /≥16GAs. Individer med ≥16GAs /≥16GAs hadde redusert risiko for prostatakreft sammenlignet med de med 16GAs / 16GAs (OR = 0,68; 95% KI: 0,46, 1,01) (tabell 2). Denne beskyttende sammenslutning av ≥16GAs var konsekvent sett i ikke-aggressive, aggressive og dødelige prostatakreft (Tabell 3)
INS /DEL var ikke i Hardy-Weinberg likevekt i kontrollene (p 0,0001).. En sammenheng mellom INS /DEL og prostatakreft ble ikke sett (tabell 2).
koblingsulikevekt var ikke sterk blant de 3 markører. D «var 0,837 for STRP1-INS /DEL, 0,634 for INS /DEL-rs10948059, og 0,560 for STRP1-rs10948059. Haplotype-analyse av STRP1-rs10948059 viser at, sammenlignet med de andre haplotypene, haplotyper med rs10948059 T-allelet var signifikant assosiert med øket prostata kreftrisiko (OR = 1,19, 95% CI: 1,00, 1,42 for 10GAs-T; OR = 1,46 , 95% CI: 1,02, 2,10 for 16GAs-T), mens de med den rs10948059 C-allele tendens mot en beskyttende effekt mot prostatakreft (OR = 0,76, 95% CI: 0,63, 0,92 for 16GAs-C). (Tabell 4)
Diskusjoner
I vår studie av menn av europeisk avstamning, GNMT STRP1 og rs10948059 ble faktisk forbundet med prostata kreftrisiko. De med et økt antall tandem repetisjoner (≥16GAs /≥16GAs) hadde en 32% redusert risiko for prostatakreft sammenlignet med de med mindre repetisjoner ( 16GAs / 16GAs). I tillegg har de med rs10948059 T /T genotype hadde en 62% økning av risiko for prostatakreft sammenlignet med de med C /C genotype Denne forbindelsen viste seg å være sterkere i ikke-aggressive, sammenlignet med aggressive kreftformer. Disse funnene er i overensstemmelse med de av en fersk studie av Koutros et al., Som viste en sterkere sammenheng mellom serum sarcosine og ikke-aggressiv prostatakreft, men ingen sammenheng med aggressiv prostatakreft [17]. Det er derfor mulig at GNMT kan være en biomarkør for tidlig ikke-aggressiv prostatakreft.
Våre studieresultatene er også støttet av en studie på genotypisk og fenotypisk sammenslutning av GNMT, som viste at arrangører som inneholder enten STRP1 10 Gass ( 16 gass) eller rs10948059 T-allelet hadde signifikant høyere transkripsjonen aktivitet enn arrangører som inneholder STRP1 16 gass (≥16 gass) eller rs10948059 C-allelet [18]
Selv om GNMT fungerer som en tumor suppressor og var. funnet å være nedregulert i HCC, dens rolle i patogenesen av prostata cancer fortsatt ukjent. Gnmt – /- mus utviklet HCC men ikke prostatakreft, noe som tyder på at andre risikofaktorer bidro til tumorigenesis av prostatakreft foruten mangel eller forstyrrelse av uttrykket nivået av GNMT. Tidligere brukte vi en gjær to-hybrid system for å sile proteiner i samspill med GNMT og funnet ut at DEPTOR [24] og NPC2 [25] bundet direkte med GNMT. Vi postulerer at kanskje GNMT utøver sin funksjon ved å samhandle med andre effektorer inkludert DEPTOR og NPC2. DEPTOR er en mTOR-inhibitor rapportert å ha en viktig og mer direkte rolle i prostata karsinogenese [24]. Derfor blir videre studier på foreningen av DEPTOR og NPC2 med prostatakreft som trengs.
Funn i denne studien er i motsetning til de av vår studie i taiwanske menn, som viste at rs10948059 T-allelet ikke var signifikant forbundet med ikke-aggressiv prostatakreft (OR = 0,68, 95% KI: 0,36, 1,27) og hadde en beskyttende forening mot aggressiv prostatakreft (OR = 0,67, 95% KI: 0,47, 0,96) [11]. Fordelinger av allele og genotypiske frekvenser var også signifikant forskjellig mellom etniske grupper (p 0,0001 for alle sammenligninger). (Tabell 5) I taiwanske menn, den ≥16 GA’er allel var mer vanlig (63,8%), mens hos menn av europeisk avstamning, 16 GA’er allel var mer vanlig (61,0%). 16 GA’er allele var ikke forbundet med prostata kreftrisiko i taiwanske menn, mens det var assosiert med en 23 prosent økning i prostata kreftrisiko hos menn av europeisk avstamning. I taiwanske menn, 16GAs / 16GAs genotype var til stede i 12% av prostata kreft tilfeller og 13% i kontrollgruppen, mens i HPFS, var til stede i 39% av prostata kreft tilfeller og 33% i kontrollgruppen. Disse funnene illustrerer tydelig forskjellig allel og genotypiske distribusjoner i taiwanske og europeiske amerikanske menn.
I taiwanske menn, den rs10948059 C-allelet var betydelig mer vanlig enn T-allelet (85% vs. 15%), mens menn av europeisk avstamning, C-allelet var litt mer vanlig enn T-allelet (54% vs. 46%). I taiwanske menn, den rs10948059 T allelet hadde en beskyttende forening mot prostatakreft (OR = 0,72). I motsetning til hos menn av europeisk avstamning, ble T-allelet assosiert med økt prostatakreft risiko (OR = 1,27). Derfor har rs10948059 T-allelet motsatte assosiasjoner i ulike etniske grupper. Denne forskjellen antyder videre at det er nødvendig å validere i en bestemt etnisitet noen foreninger sett i andre etnisiteter. Raser og etniske variasjoner i kreftrisiko kan gjenspeile forskjeller i miljøeksponering eller forskjeller i mottakelighet og biologisk respons [26]. Polymorf ekspresjon av gener kan påvirke, enten ved aktivering eller avgiftning, metabolismen av kreftfremkallende, for eksempel polysykliske aromatiske hydrokarboner, aromatiske aminer, heterocykliske aminer og andre faktorer. I sin tur, kan eksponering for ulike miljøfaktorer påvirker genene og velg mot spesifikke genetiske polymorfismer. Over tid kan disse gen-miljø interaksjoner resultere i de variable effekter sett i ulike raser og etnisiteter. Det er mulig at gener som er involvert i avgiftnings trasé kan være mer utsatt for slike påvirkninger. Kato et al. rapportert motsatte sammenslutninger av Cytokrom P450IIE1 polymorfismer med lungekreft i europeiske og afrikanske amerikanere [27]. Videre vår studie viste at polymorfismer av GNMT, som også deltar i avgiftning, har variabel foreninger i menn av europeisk avstamning og asiater.
Alle de prostatakreft tilfeller og kontroller i denne studien var av europeisk avstamning. Det er derfor usikkert om disse GNMT genetisk polymorfisme er forbundet med prostata kreftrisiko i andre etniske grupper som afro-amerikanere. En studie bestående av 50% Mexican American, 18% europeisk amerikansk, 18% African American, 12% asiatiske og 1% arabiske kvinner rapporterte en rs10948059 T allel frekvens på 36,4% [28], som er lavere enn 45,8% rapporterte i denne studere. Studier i andre etniske grupper, som alle kunne ha varierende allele frekvenser, er derfor nødvendig å avklare disse foreningene.
I vår forrige undersøkelse i taiwanske menn bestående av 326 prostatakreft tilfeller og 327 kontroller [11], den alleliske frekvenser var sammenlignbare med de av en annen studie av vår gruppe [29]. Frekvensen av T-allelet holdt seg konstant på rundt 15% i kontrollene etter pooling emner fra begge studiene ( 600 kontroller), noe som tyder på at allel frekvenser som ikke ble påvirket av utvalgsstørrelsen
INS /DEL ble ekskludert. fra haplotype analysen fordi det ikke var i Hardy-Weinberg likevekt (p 0,0001). Haplotype analyse av STRP1-rs10948059 viste at den vanligste haplotype var 10GAs-T regnskap for 40% av kontrollene og 44% av tilfellene, etterfulgt av 16GAs-C, og 10GAs-C. (Tabell 4) haplotyper med den rs10948059 T-allelet hadde ORS er større enn en, noe som tyder på at nærværet av rs10948059 T-allelet per se økt mottakelighet for prostatakreft. I taiwanske menn, koblingsulikevekt mellom de 3 markørene var sterkere (D «var 0,988 for STRP1-INS /DEL, 0,948 for INS /DEL-rs10948059, og 0,945 for STRP1-rs10948059). Den 10GAs-Ins-T haplotype ble assosiert med redusert prostata kreftrisiko i taiwanske menn (OR = 0,68, 95% CI = 0,48 til 0,95).
Styrken med denne studien var at vi var i stand til å se variable sammenslutninger av GNMT med prostatakreft i ulike etnisiteter. En begrensning med denne studien var manglende data vedrørende GNMT uttrykk nivåer, så en sammenheng med genotyper kunne ikke gjøres. Immunhistokjemiske studier kan utføres for å ytterligere belyse foreningen av GNMT med prostatakreft i disse menn, av europeisk avstamning. Immunhistokjemisk farging bruker GNMT monoklonalt antistoff 14-1 på 1:25 fortynning ble tidligere utført i prostata vev hentet fra taiwanske menn og en rekke asiatiske menn [11] vev. GNMT uttrykk hadde en tendens til å være høyere i ikke-kreft enn i prostata kreft og tumor tilstøtende vev; og i kreftvev, farging var høyere i lav stadium enn høye scene kreft. Disse funnene er i motsetning til de fra Song et al. Studie i 148 japanske menn, som viste at høy cytoplasma GNMT uttrykk ble korrelert med høyere Gleason score, høyere patologisk stadium, og lavere sykdomsfri overlevelse [30]. Mens begge studiene ble utført i asiatiske menn, Song et al. brukt en polyklonale antistoff for immunhistokjemisk farging, så det kan være spesifisitet problemer, og resultater fra begge studiene kan ikke sammenlignes direkte. Langsgående oppfølgingsstudier kan bidra til å avklare forholdet mellom GNMT uttrykk og sykdomsutvikling og aggressivitet.
Til slutt er det verdt å merke seg at en høyere andel av pasientene i denne studien hadde lokalisert (stadium I eller II) sykdom ( 85%) i forhold til våre tidligere Taiwan undersøkelse (32%) [11]. Studien i taiwanske menn var sykehusbasert, mens HPFS er sammensatt av helsepersonell. Helsepersonell er mer helsebevisste og er mer sannsynlig å ha regelmessige fysiske undersøkelser enn den generelle befolkningen
. Bruken av PSA screening var høy i HPFS.
Konklusjoner
I menn av europeisk avstamning, ble GNMT rs10948059 og STRP1 forbundet med prostata kreftrisiko. Sammenlignet med studie utført i taiwanske menn, mottakelighet GNMT alleler for prostatakreft hadde en omvendt forhold. Denne studien viste viktigheten av å validere foreninger i ulike etnisiteter, som allele og genotypiske var forskjellig, og de resulterende assosiasjoner mellom markører og prostatakreft også forskjellig. Resultatene fra denne studien tyder på at GNMT spiller en rolle i prostata karsinogenese, men i lys av de motstridende resultatene av nyere studier på sarkosin, videre studier er nødvendig for å belyse hvilken rolle GNMT i prostatakreft aggressivitet.
Takk
Vi ønsker å takke Channing Division of Network Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women Hospital og Harvard Medical School. Vi ønsker å takke deltakerne og ansatte på HPFS for sine verdifulle bidrag samt følgende statlige kreftregistre for deres hjelp: AL, AZ, AR, CA, CO, CT, DE, FL, GA, ID, IL, IN, IA, KY, LA, ME, MD, MA, MI, NE, NH, NJ, NY, NC, ND, OH, OK, OR, PA, RI, SC, TN, TX, VA, WA, WY. Vi vil også gjerne takke Miss Yu-Tien Liu for hennes hjelp i genotyping.
