Abstract
Til tross for bedre resultater i de siste 30 årene, mindre enn halvparten av alle kvinner diagnostisert med ovarialcancer live-fem år utover deres diagnose . Selv om det vanligvis behandlet som en enkelt sykdom, omfatter ovarialcancer flere forskjellige histologiske undertyper, slik som papillær serøse og endometrioid karsinomer. For å møte om de morfologiske forskjellene sett i disse karsinom representerer forskjellige egenskaper på molekylært nivå vi analysert DNA-metylering mønstre i 11 papillær serøs svulster, 9 endometrioid ovarietumorer, 4 normale egglederen prøver og 6 normale endometrial vev, pluss 8 normal eggleder og 4 serøs prøver fra TCGA. Til sammenligning innenfor endometrioid subtype vi lagt 6 primære livmor endometrioid svulster og 5 endometrioid metastaser fra livmoren til eggstokken. Data ble erholdt fra 27,578 CpG-dinukleotider som opptrer i eller i nærheten av promoter-regioner av 14,495 gener. Vi identifiserte 36 steder med betydelige økninger eller reduksjoner i metylering i sammenligninger av serøs svulster og normal egglederen prøver. Videre unsupervised clustering teknikker som brukes på alle prøvene viste tre store profiler som omfatter det meste normale prøver, serøs svulster, og endometrioid tumorer inkludert eggstokk-, livmor- og metastatisk opprinnelse. Den clustering analysen identifiserte 60 differensielt denaturert områder mellom serøs gruppen og normalgruppen. En uavhengig sett av 25 serøse svulster validert reproduserbarheten av metylering mønstre. I kontrast 1000 gener ble ulikt denaturert mellom endometrioid svulster og normale prøver. Dette funnet er konsistent med en generalisert regulatorisk avbrudd forårsaket av en methylator fenotype. Gjennom DNA-metylering analyser vi har identifisert gener med kjente roller i ovarialcancer etiologi, mens veien analyser gitt biologisk innsikt til rollen av nye gener. Våre funn av forskjeller mellom serøse og endometrioid ovarietumorer indikerer at intervensjonsstrategier kunne utvikles spesielt for å møte undergrupper av ovarialcancer
Citation. Kolbe DL, DeLoia JA, Porter-Gill P, Stange M, Petrykowska HM , Guirguis A, et al. (2012) Differential Analyse av ovarial og livmorkreft Identifiserer en Methylator Phenotype. PLoS ONE 7 (3): e32941. doi: 10,1371 /journal.pone.0032941
Redaktør: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, USA
mottatt: 29 september 2011; Godkjent: 02.02.2012; Publisert: 05.03.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Finansiering er levert av egenutført Research Program for National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health (LE og LB), DoD GOC # 04-124 og Magee Womens Research Institute /Scaife Grant (TCK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft har en insidens på 21.500 tilfeller per år i USA og 204 000 på verdensbasis, med en estimert årlig dødelighet av 125.000 kvinner. Tilstanden er rangert som 5
th ledende årsak til kreft dødsfall for kvinner i USA; den høye dødelighet er en konsekvens av den asymptomatisk natur av tidlig stadium sykdom og fraværet av en pålitelig screening test. Flertallet av tilfellene (75%) er diagnostisert på et avansert stadium (III eller IV), hvor 5-års overlevelse er mindre enn 30% [1].
Av de fire store histopatologiske undergrupper, er serøs den vanligste, fulgt av endometrioid, mucinous og tydelige celletyper. Disse undertyper har særegne genuttrykk profiler [2] og er klassifisert i kraft av deres morfologiske likhet med normal egglederen, endometrium, livmorhalsen og livmor klare celler, henholdsvis [3]. Likheten mellom tumor subtyper og fjerne vev, er i samsvar med modeller som foreslår migrering av forstadier fra ulike opprinnelse, slik som i egglederen [4] eller den mesothelial tildekking av bukhulen [5]. Av denne grunn kan ovarian serøse tumorer (som ligner Mullerian epitel) legitimt i forhold til normal eggleder (som er avledet fra Mullerian epitel). Likevel eggstokkene overflaten epithelial (OSE) lag [6] deler sin opprinnelse med epitel av endometriet (kjent som celomic epitel [7]) og forblir en plausibel alternativ forklaring for «de novo» tumorigenesis.
Som serøs tumorer, er kontroversielt opprinnelsen til endometrioid tumorer [8], og progenitorceller er blitt foreslått å stamme fra ikke-ovarie kilder, slik som endometriose [9]. Svulster med endometrioid histopatologi er diagnostisert i både livmor og eggstokk. De ofte co-skje, som synkrone primære svulster eller metastaser fra livmoren til eggstokken [10]. Mens molekylære forskjeller er rapportert for to primære svulster, metastatiske svulster er clonally identisk [11].
genuttrykk studier av ovarietumorer ment å oppdage kreft-spesifikke profiler har gitt beskjeden suksess og begrenset reproduserbarhet [12], [13], [14], [15]. Imidlertid har mutasjons profilering studier gitt mer konsistente resultater, som viser at både serøs og endometrioid svulster har aggressive, høy grad av subtyper [16], [17], [18] med mutasjoner i
TP53
genet [19 ], [20], [21] til tross for sine åpenbare histologiske forskjeller [16], [17], [18]. Lavgradig subtyper er mest vanlig i endometrioid svulster med mutasjoner hovedsakelig forekommer i
WNT Kjøpe og
PIK3CA
trasé [2].
I konsert med genekspresjon og mutasjonsprofiler, opptegning av epigenome av tumorceller skal avdekke sammenhenger mellom prøvene som gjenspeiler vanlige embryologiske opprinnelse, tilsvarende histopatologiske utfall, eller delte mutasjons hendelser. I ovarietumorer, demper DNA metylering uttrykk for kritiske gener [22], [23], og skaper genetisk haploinsufficiency [24], mens hypometylering på andre områder lar uttrykk for normalt forstummet gener. Som bevis på prinsippet ble stedsspesifikke mønstre av DNA metylering nylig brukt til å skille fire undergrupper av epiteliale eggstokkreft, ved hjelp av et totalt 1505 mål CpG loci [25], [26].
Vi antok at DNA metylering mønstre i ovarietumorer ville ligne celler fra deres antatte vev av opprinnelse, med et lite antall endringer som representerer hendelser assosiert med malignitet, som unikt representerer hver svulst subtype. Videre har vi også en hypotese om at livmor og eggstokk endometrioid svulster ble fortalt av sykdomsfremkallende mekanismer, som ville bli observert i DNA metylering mønstre. For å møte disse ideene, undersøkte vi metylering profiler av 27 578 mål CpG nettsider som representerer 14,495 gener i det menneskelige genom, ved hjelp av DNA stammer fra serøse og endometrioid ovarietumorer, normal eggleder og normal endometrium, og primære og metastatiske endometrioid endometrial svulster. Denne store datasett ble analysert ved hjelp av en veiledet analyse etterfulgt av
de novo
klassifisering hjelp uten tilsyn beregnings clustering. For å forbedre styrken på epigenetisk profilering teknikk, vi inkludert rå metylering data fra serøs svulster og normal eggleder generert gjennom Kreft Genome Atlas (TCGA). Disse prøvene ble analysert ved hjelp av samme metylering plattform, og utført av uavhengige forskningslaboratorier ved hjelp av uavhengige vevsprøver.
Resultater
Eksperimentell analyse og design
Vi har analysert DNA metylering status av genomiske prøver ved hjelp av Illumina infinium plattformen. DNA ble behandlet med bisulfit å konvertere unmethylated cytosines til uracil, forlater denaturert cytosines uendret. Hybridiseringsreaksjonen på HumanMethylation27 Illumina BeadChip gitt signal som er spesifikke for de metylerte og unmethylated tilstander, ved hjelp av Illumina enkelt base forlengelse analyseprotokollen [27]. Differensial hybridisering av prober til denaturert og unmethylated målse ble tabulert som fraksjonen av det totale signal som samsvarer med denaturert tilstand. Den første prøvesett representert ulike vev og krefttyper, inkludert normal egglederen, normal endometriet, eggstokk papillær serøs karsinom, eggstokk endometrioid karsinom, og primære og metastatisk livmor endometrioid kreft fra 42 pasienter (tabell 1). Tekniske gjentak indikerte svært reproduserbare resultater for analysen (Figur S1). I tillegg inkluderte vi data fra samme Illumina metylering plattform for ytterligere 12 prøver fra den offentlige databasen for Kreft Genome Atlas-prosjektet (TCGA). Settet består 8 kontrollprøver (normal eggleder) og 4 tumorprøver (eggstokkene serøs), bidro i et enkelt parti prøver undersøkt under konsistente eksperimentelle forhold fra en dataleverandør.
Bulk metylering
for å vurdere brutto endringer i grad av metylering, undersøkte vi samlet metylering nivåer av alle prøvene. Analyseverdiene er angitt som andel av fluorescens som stammer fra sonden for det metylerte tilstand, fra 0 (alle DNA unmethylated) til 1 (alle DNA metylert). Sammenligning av alle prøvene, viste de aller fleste konsistente metylering profiler. På tvers av genomet, de analyserte områdene hadde metylering nivåer mellom 0 og 0,2, et lite antall områder hadde nivåer mellom 0,2 og 0,8, og et noe større antall hadde nivåer av 0,8 til 1 (figur 1).
Hyppighet metylering i det hele tatt loci for et gitt nivå av metylering (0 til 1). Hver biologisk prøve er representert som en enkelt linje; alle ikke-metastaserende prøvene ble plottet. Henholdsvis paneler fra venstre til høyre inneholde alle loci (N = 27 561), X-kromosomet bare (N = 1038), eller kromosom 10 bare (N = 1044).
I kontrast, bare vurderer X-kromosom, enkelt-kopi stanse ved tilfeldig X-inaktivering ble ventet å gi et metylering nivå på 0,5. Det observerte mønsteret viste en bred topp sentrert ved 0,5 for de fleste prøver, selv om tumorprøver hadde mer omfattende heterogenitet. Fem serøs tumorprøver viste en tydelig profil, med mange loci være unmethylated (dvs. metylering nivå 0,2), noe som indikerer enten en unnlatelse av å opprettholde X-inaktivering eller kopiere antall endringer med relativ overkant av det aktive X [28]. For å vurdere om denne observerte variasjonen var rett og slett på grunn av lite antall loci på X-kromosomet, vi også vurderes metylering nivåer på kromosom 10, som hadde en tilsvarende antall sonder. Mønsteret for kromosom 10 lignet mønsteret på tvers av alle autosomal loci, med høye nivåer av likheten fra prøve til prøve.
Veiledet analyse
Vi vurderte først om kreft undergrupper (definert av histopatologi) samsvarer til spesifikke metylering profiler. Med inkludering av TCGA prøvene, 12 normale egglederen prøver og 16 eggstokkene serøs svulster gitt tilstrekkelig statistisk styrke for en direkte sammenligning. Prober med dårlig kvalitetskontroll, høy variabilitet i kontrollene, eller ligger på X eller Y-kromosomer ble ikke vurdert (se Methods). Ved hjelp av en Wilcoxon summert-rank test for å identifisere områder som konsekvent assosiert med tidligere klassifisering, 36 var signifikant ved p 0,05 etter flere tester korreksjon (14 på p 0,01; tabell 2). Tre gener ble identifisert som medlemmer av den kanoniske vei for eggstokkreft i en Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) (tabell 2; [29] [30] [31] [32]). Overvåket analyse av eggstokkene endometrioid svulster mot egglederen eller endometrial kontrollene ble ikke utført på grunn av et lite antall prøver.
Unsupervised clustering
For å ta om andre prøve divisjoner med felles molekylær fenotyper eksistert og for å få et bredere bilde av relasjonene mellom prøvetyper, flyttet vi til uten tilsyn clustering. Utnytte komplett sett av 31 primærtumorprøver og 18 normalt vev (og uten de 5 metastatiske prøvene brukes til sekundær analyse), begrenset vi denne analysen til sonder som var i topp 500 når rangert etter varians, som rapportert av Houseman et al. [33] for å redusere dimensjonalitet av dataene. Resultater av flere clustering algoritmer konvergerte på samme tolkning av ulike fenotypiske grupper (figur S2). K-means og partisjonering ved hjelp av et β-blanding modell beregnet for dataene fra denne plattformen [33] både sterkt støttet eksistensen av 3 hovedgrupper, omtrent tilsvarende kontroll-type prøver, serøs tumor-type prøver, og endometrioid prøver. Ytterligere analyse med hierarkisk clustering (på tvers av flere avstandsberegninger og koblingsmetoder) sterkt støttet kontroll-type og livmor typen klynger, og den angitte serøs tumor-type prøvene var en outgroup fra kontrollprøvene, men var inkonsekvent med hensyn til om disse prøvene dannet en distinkt undergruppe (fig S2).
konsensus grupperinger, slik som vist i figur 2, er markert med en farget bar for å indikere normal-type, serøs-type eller endometrioid-type. Spesielt, inneholdt kontrollgruppen normal egglederen og normal endometrium, noe som indikerer en konsistent fenotype på tvers av begge vev i settet med kjennetegnet prober. De TCGA Prøvene gruppert med sine identifiserte prøvetyper, bekrefter reproduserbarhet og robusthet av resultatene som disse svulstene ble innhentet og klassifisert på ulike institusjoner. Utelukkelse av TCGA prøver fra analysen hadde relativt liten innvirkning på resultatene, der en markert divisjon forble mellom endometrioid og serøs eller kontrollprøver; forble imidlertid bare svak støtte for en underavdeling av serøs-type svulster fra kontrollprøvene
Heatmap av metylering nivåer.; blå = 0,0, svart = 0,5, gul = 1,0. På venstre, et representativt utvalg av hierarkisk clustering og fargeblokker gi konsensusgruppene. Seks kolonner på høyre gi eksempler på kjennetegn: nummer, tumor (T) eller normal (N); plassering i eggstokk (O), eggleder (F), eller endometrium (E); histologi av serøs (S) eller endometrioid (O); Karakter (1-3; hvor symboler som brukes er «-« for normaler og «NA» for informasjon som ikke er tilgjengelig.) og helt til høyre, prikker for offentlige TCGA data. Fem prøver på bunnen er eggstokkene metastaser fra endometrial endometrioid svulster, utelukket fra innledende analyse og clustering.
klynge av endometrioid prøver, inkludert svulster fra begge eggstokkene og livmor områder, viser en bemerkelsesverdig endret profil, med metylering på en rekke nettsteder som er normalt unmethylated CpG øyer, og et tap av metylering på steder som normalt metylert. Omfanget og reproduserbarhet av disse endringene er sterkt minner om methylator fenotyper nevnt i andre kreftformer [34] [35]. En methylator fenotype er tidligere blitt foreslått for endometrial carcinoma endometrioid, basert på metylering av promotorer på noen få målgener [36], men har ikke til vår kunnskap blitt beskrevet i et genom-nivå undersøkelse eller i ovarian cancer.
Disse data bekrefter hypotesen om at endometroid typen svulster, enten det er på eggstokkene eller livmor nettsider, dele likheter på molekylnivå. For ytterligere å løse dette funnet, analyserte vi fem eggstokkene metastaser avledet fra primære endometrial svulster ved hjelp av en nestet log-sannsynlighet-ratio test. Denne testen adressert konsistens clustering med primær endometrioid prøvene versus de kombin serøs svulster og kontroller, og sekundært aktivert klassifikasjon innen serøs eller kontrollgruppene når det er nødvendig. Fire av de fem prøver ble identifisert som sterkt endometrioid-type, mens den femte var mer lik den for kontrollprøvene (eksempel 54, figur 2). Den femte prøven synes ikke grovt endret fra den metylering av normal endometrievev, noe som indikerer at de fleste tumor-fenotypen er ikke universell. Dette uteliggeren kan representere en uvanlig inndeling av endometrioid svulster, som følge av annen underliggende patologi, men det representerer ikke en lavgradig tumor (figur 2).
Vurdering av primære svulster i alle histopathologies også identifisert sjeldne uteliggere. Eksempler inkludert endometrial endometrioid prøvene 47 og 49, som klynger med normalt vev og bidro til 15% av prøvene som viste uharmoniske plassering i forhold til sine tildelte histopatologi (klasse 1 og klasse ikke er tilgjengelig, henholdsvis; figur 2). Fire eggstokkene serøs svulster også gruppert med normalt vev, og viser svært begrensede endringer i metylering i forhold til kontroller (karakterene 2 og 3). Gitt den fenotypiske likheten av disse prøvene til normale kontroller, den biologiske understøttelsen av denne svulsten undergruppe krever videre undersøkelser. I tillegg en eggstokk endometrioid prøve gruppert med serøs svulster (eksempel 36, klasse 2), noe som tyder på en sjelden endometrioid subtype med en mer aggressiv, serøs-lignende profil, eller tastefeil fra en dårlig differensiert prøve.
Differensial analyse av klynger
Gitt de tre primær grupperinger levert av unsupervised clustering analyse, ønsket vi å identifisere metylering loci mest forutsigbare av medlemskap i en bestemt klasse. Vi gjentok Wilcoxon summert-rank test som brukes i veiledet analyse, etter fjerning fra betraktning de 500 prober som brukes i clustering. Sammenligning av serøs-type klynge med kontroll-type klynge, 35 prober forble signifikant ved p 0,01 etter strenge Bonferroni korreksjon for flere tester og 60 holdt seg på p 0,05 (Tabell 3). Resultatene viste en blanding av hyper- og hypometylering i forhold til kontroller (figur S3). En IPA analyse identifisert kjente biomarkører for eggstokkreft blant denne listen (Tall S4 og S5). To gener med innspilt relevans til DNA metylering ble identifisert, inkludert
DNMT3A
, en DNA metyltransferase genet og
RB1
.
APC plakater (fra beta-catenin pathway),
RBAK1 plakater (en
RB1
samhandling partner),
MAPK15 Hotell og
MAP2K2
kinaser, og histondeacetylase
HDAC1
var også på listen (tabell 3). Selv om tilsyn og unsupervised analyser benyttes ulike sammenlignende sett, gense listene inneholdt 10 overlappende oppføringer (Tabell 3).
Med tanke på endometrioid-klyngen versus kontroll klyngen, fant vi ut at antall og grad av ulikt denaturert nettsteder økte med mer enn en størrelsesorden. For eksempel 954 prober var signifikant på p 0,01. Det store antallet av hypermethylated nettsider antyder en underliggende feil i DNA metylering trasé, og begrenser nytten av å vurdere endret metylering av enkeltgener.
Validering av differensial metylering
For å undersøke om vårt sett av 60 differensielt denaturert steder i serøs svulster var reproduserbar, vi vurderte metylering av 25 flere prøver som var uavhengig av den opprinnelige analysen sett. Alle ble skrevet som eggstokkreft serøs karsinom og analysert uavhengig (uavhengig i konstateringen og i tiden av analyse) fra originalene. For hvert område og for hver validering prøve vurderte vi om metylering mer lignet den normale prøven klynge eller serøs tumorprøve klynge. Av de 25 tumorprøver, 4 lignet metylering mønster av normale prøver, syv ble endret ved 21 eller mer av de 60 loci, og 14 prøver viste endrede mønster på 40 eller mer av de 60 loci (figur 3).
Metylering ved 60 loci ble anvendt for å evaluere et uavhengig sett av serøse tumorer. Hver rad representerer en enkelt prøve; hver kolonne tilsvarer en av de tidligere identifiserte differensielt metylert områder. En tom boks angir metylering mer lik kontrollsettet (ikke nødvendigvis unmethylated); en fylt svart boks indikerer metylering mer lik klyngen av eggstokkreft serøs svulster. Prøvene er sortert etter antall steder som har metylering ligner serøs svulst gruppen.
Evaluering av publiserte metylering hendelser
Vår analyse av differensial metylering fokusert på endringer som definerte egenskaper i hver gruppe og ble delt mellom alle eller nesten alle prøvene. Mange viktige endringer i metylering tilstand, tidligere rapportert i litteraturen, har lavere forekomst og er ikke direkte identifisert ved vår tilnærming. Når vi vurderte våre prøver etter mønstre av kjent metylering, våre data var i samsvar med publiserte resultater. For eksempel
BRCA1
ble hypermethylated i 2 av 16 (12,5%) av eggstokkene serøs prøver. Svulsten suppressor
RASSF1A
viste bevis på fullstendig metylering i 11 svulster, og løssalgs metylering i fire mer (31% av serøs, og 60% av endometrioid). Disse endringene, og andre, vil trolig bli viktige transformative hendelser, men er begrenset til mindre undergrupper av prøvene
Gene ontologi pathway analyserer
For å knytte disse resultatene til litteraturen på eggstokkreft, utførte vi et gen ontologi (GO) analyse og en IPA analyse av forskjellig denaturert genene fra cluster-basert sammenligning av serøse tumorer versus kontroller. Genene som tilsvarer det metylerte loci i listen viste en statistisk signifikant berikelse for GO betingelser som involverer regulering av cellesyklusen (tabell 4). De to øverste nettverk identifisert av IPA inkludert «Cellesyklus og Cell morfologi» og «Inflammatory Response» med nettverks score til 24 og 23, henholdsvis. Nettverket poengsum er basert på en hypergeometrisk fordeling og beregnes med riktig-tailed Fishers eksakte test, noe som tyder på at det er en 1 i 10
23 eller 10
24 sannsynlighet for enten nettverk oppstår fra en tilfeldig liste av gener (tabell 4, fig S4, S5). Spesielt differensielt denaturert gener hadde en stor tilstedeværelse i disse nettverkene, i samspill med viktige gener i eggstokkene tumor utvikling inkludert
AKT
,
PI3K
,
VEGF
, og østrogen reseptor.
Diskusjoner
Dette arbeidet representerer en av de største studier av metylering ved hjelp av flere normale og svulst undergrupper av gynekologiske kreftformer. Vi først undersøkte metylering status for 27,578 sider for 49 prøver inkludert normal egglederen og endometrium, serøs eggstokkreft, endometrioid eggstokkreft, primær endometrioid livmorkreft, og eggstokkreft metastasering av livmorkreft. Uavhengig av svulst eller normal status, alle prøvene viste lignende profiler i den totale fordelingen av denaturert nettsteder. Selv om vi ikke finne globale forskyves mot hyper- eller hypometylering tvers av prøvene analysert, en undergruppe av prøvene viste drastisk forandret metylering for X-kromosomet, i samsvar med tap av den inaktive X-kromosomet, forsterkning av den gjenværende aktive X, eller begge deler [28 ]. Eksempler på Aneuploidy, inkludert autosomer, er vanlig i høyverdig serøs eggstokkreft, og er ikke direkte konstatert ved denne analysen, men påvirke proporsjonale metylering nivåer på hvert locus. Derfor fjernet vi alle sonder på X-kromosomet fra våre datasett.
Våre data bekrefter at ulike histologiske subtyper har forskjellige mønstre av metylering. Videre eggstokkene serøs svulster er mer lik normale eggstokkreft og livmorvevet enn til eggstokkene eller endometrial endometrioid svulster, som er svært like hverandre og vise drastiske og konsistente endringer i deres metylering. Dette resultatet er i overensstemmelse med en methylator fenotype og i samsvar med en modell av ovarian endometrioid tumorer som oppstår fra endometriose, hvor cellene til syvende og sist være avledet fra en livmor avstamning. Endometrioid svulster fra eggstokken og livmoren aksje flere vanlige somatiske mutasjoner [6], og disse dataene støtter et lignende sykdomsfremkallende mekanisme. De merkede forskjeller i metylering profiler mellom histologiske subtyper understreke betydningen av å karakterisere svulster på molekylært nivå for å utvikle skreddersydde behandlingsstrategier.
For identifisering av forskjellig metylert loci, brukte vi kjent etiketter og blindet (data- rettet) undergrupper. Kjente merker identifisert et par dusin gener, noen med karakteriserte roller i eggstokkreft. Men gitt den strengeste bar for statistisk signifikans i å teste svært store tall nettsteder, fant vi ut at noen slengere innenfor en gruppe kan skjule viktige mønstre. Ved clustering data på en objektiv tilnærming, fant vi tilsvar metylering mønstre blant normale prøver og noen kreft utliggere, noe som indikerer at dagens histologiske subtyping strategier kan gå glipp av viktige molekylære forskjeller mellom svulster. Dette punktet ble også støttet i metastatisk endometrioid svulster, som også inneholdt en avvikende som så ut som en normal prøve i sine metylering mønstre. Vår clustering tilnærming klart identifisert et sett av 500 gener som kan skille de fleste serøse prøver fra endometrioid prøver og normale kontroller. Selv om clustering var karakteristisk for de tre hovedklasser av prøvene, bruken utelukket en statistisk vurdering av betydningen av gener i settet. Likevel, den økte kraften i clustering 49 prøvene identifisert ytterligere 60 loci som var uavhengig av clustering sett og segregerte prøver i normale eller serøs undergrupper med statistisk signifikans. Flere av disse genene tilsvarer nettverk implisert i utviklingen av kreft i eggstokkene (fig S4 og S5). Vi undersøkte overlapping mellom genet lister av statistisk signifikante gener identifisert i tilsyns og unsupervised tilnærminger og funnet 10 gener. Spesielt, kinase
PDPK1
er i PI3K signalveien involvert i serøs eggstokkreft [37].
PDPK1 Hotell og
PLEKHF1
dele en pleckstrin homologi domene, kan binde inositol polyfosfater.
PARP3
er involvert i DNA reparasjon og genomstabilitet. Gitt reproduserbare signalet fra disse genene, uavhengig av metode, konkluderer vi med at uncharacterized gener i denne listen er sterkt involvert i eggstokkene tumor utvikling og krever ekstra karakterisering.
En begrensning av vår analyse er at vi ikke skjermen svulsten DNA for genmutasjoner eller fastslå genuttrykk nivåer; Likevel fant vi at
RB1 Hotell og
RBAK
er forskjellig metylert mellom papillær serøs og normal eggleder prøver.
RB1
ble nylig rapportert av TCGA å være involvert i serøs svulst etiologi, gjennom mutasjon eller sletting i 67% av svulster [38]. Involvering av
RB1
veien er forenlig med samtidig Rb1 og TP53 mutasjon hos mus, som simulerer egenskapene til aggressive serøs eggstokkreft, inkludert dannelsen av ascites og metastasering [39]. Selv om vi ikke finner signifikant overlapp med listen over metylert gener i serøs svulster publisert av TCGA, kan dette disharmoni skyldes metodiske problemer. For eksempel har vi ikke begrense genet listen til kandidater som blir hypermethylated og fant mange som mister metylering. Videre kreves vi at score være konsekvent blant alle svulster. TCGA grenser omsatte i topp 10% av svulster. I tillegg har vi ikke begrense resultatene til gener som blir Silenced, som metylering har vist seg å forårsake både positive og negative regulatoriske utfall [40].
Vår analyse av metylering profiler i eggstokkene og endometrial svulster indikerer verdien i å karakterisere tumorer på molekylært nivå. Den methylator fenotypen angir et avvik i den molekylære funksjon av enzymer som regulerer DNA-metylering nivåer, og antyder at et molekyl som virker oppstrøms av kandidatgener er ansvarlig for den kaskade av hendelser som fører til tumorutvikling. Studier i leverkreft har identifisert mutasjoner i beta-catenin gen i forbindelse med en methylator fenotype. Mutasjoner i beta-catenin er også vanlig i endometrial svulster [1], og foreslå oppfølgings eksperimenter for å vurdere et direkte forhold til DNA metylering i endometrioid svulster. Videre bør terapeutiske strategier for å forebygge utstrakt metylering (så som 5-aza-2′-deoksycytidin) vurderes i sammenheng med tumorer med en methylator fenotype.
konsistensen av metylering profiler, til tross for uavhengig prøve forberedelse og datainnsamling for TCGA prøvene, ble brukt til å validere og utvide våre resultater. Disse dataene viser at prøve batch effekter er minimal og ikke forstyrre data konsistens. Våre data gir grunnlag for fremtidige genomisk og genetiske analyser av endometrial og serøs svulster for diagnostikk og behandling applikasjoner. Spesielt, viser våre resultater at metylering nivåer i serøs svulstene er mindre konsistent enn endometrioid svulster, men øke og minske i en target-avhengig måte. I motsetning endometrioid svulster viser omfattende endringer som er sannsynlig knyttet til en felles oppstrøms mekanisme gått galt.
Materialer og metoder
Prøvetaking
Ovarian, endometrial og egglederen vev var mottatt fra Magee-Womens Hospital Tissue Procurement Program (Pittsburgh, PA). Vevene ble hurtigfrosset etter kirurgi og lagret ved -80 ° C. Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av Puregene Blood Kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger. DNA Kvaliteten ble vurdert ved hjelp av en SmartSpec Plus spektrofotometer (BioRad, Hercules, CA).
Endometriebiopsier normale prøver
Vevsprøver ble levert av Cooperative menneskelig vev Network, som er finansiert av National Cancer Institutt. Prøvene er fra post-menopausale personer med atrofisk endometrium og ble hentet fra rutine hysterektomi eller bekken reseksjon for ikke-livmorkreft. DNA ble isolert etter protokollen Trizol reagens (Invitrogen).
Bruk av menneskelige fagstoff ble godkjent av University of Pittsburgh og Riks mennesker forskning på NIH.
TCGA data
TCGA data ble lastet ned på tidspunktet for denne analysen fra dataportal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). Data fra samme parti som finnes maken serøs svulster og normal egglederen prøver. Normaler: TCGA-01-0639-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0631-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0642-11A-02D-0383-05, TCGA-01-0628- 11A-01D-0383-05, TCGA-01-0637-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0633-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0630-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0636-11A-01D-0383-05.
