Abstract
Rollen peroksisomproliferatoraktiverende – aktivert reseptor δ (PPAR δ) genet i kolon kreftutvikling er fortsatt svært kontroversielle. Her har vi etablert nakne mus xenograft modell ved hjelp av en menneskelig tykktarmskreft cellelinje KM12C enten med PPAR δ forstummet eller normal. De xenotransplantater i PPAR δ-stilnet gruppen vokste betydelig større og tyngre med mindre differensiering fremmet celleproliferasjon, økt ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og lignende apoptose indeks sammenlignet med de av PPAR δ-normal gruppe. Etter behandles med den spesifikke VEGF hemmer bevacizumab, ble kapasiteten til vekst og spredning av xenografter redusert i begge gruppene, mens fortsatt betydelig høyere i PPAR δ-forstummet gruppen enn i PPAR δ-normal gruppe. Administrasjon av PPAR agonist δ betydelig redusert VEGF-ekspresjon i PPAR-δ normale KM12C celler, men ikke i PPAR δ-dempede celler. Disse funnene viser at, knockdown av PPAR δ fremmer veksten av tykktarmskreft ved å fremkalle mindre differensiering, akselererende spredning og VEGF uttrykk for tumorceller in vivo, og reduserer svulst følsomhet for bevacizumab. Denne studien indikerer at PPAR δ demper tykktarmskreft
Citation. Yang L, Zhou J, Ma Q, Wang C, Chen K, Meng W, et al. (2013) knockdown av PPAR δ Gene fremmer veksten av tykktarmskreft og reduserer følsomheten for Bevacizumab i Nude Mice Model. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10,1371 /journal.pone.0060715
Redaktør: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, USA
mottatt: 24 april 2012; Godkjent: 02.03.2013; Publisert: 08.04.2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenner stipend støtte fra Stiftelsen Natural Science of China (nr 30801332, https://www.nsfc.gov.cn/), Ph.D. Foundation programmer av Ministry of Education of China (nr 200 806 100 058, https://www.chinapostdoctor.org.cn/), og den svenske Cancer Foundation (https://www.cancerfonden.se/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
peroxisome proliferator – aktivert reseptor-δ (PPAR δ), et medlem av den ligand-aktiverte PPAR nukleær reseptor familie [1], er allestedsnærværende uttrykt i de fleste vev og høyt uttrykt i epitel, spesielt hud og tarm [2], [3]. I likhet med andre atomhormonreseptorer, PPAR δ heterodimerizes med retinoid X reseptor og utøver sin effekt via regulering av gentranskripsjon ved binding av ligand [4]. Det mest karakterisert rolle for PPAR δ hittil er å regulere lipidmetabolisme og energihomeostase, for eksempel å indusere revers kolesteroltransport, og hever high-density lipoprotein, øker fettsyreoksidasjon og energi frakobling [5], [6]. I tillegg er PPAR δ også implisert i embryoimplantasjonen, sårheling, inflammatorisk respons, endotelial celleproliferasjon, angiogenese, hudkreft og tykktarmskreft [7], [8].
I motsetning til den velkarakterisert roller PPAR δ i metabolske og energisk homeostase, fortsatt usikkert hvilken rolle PPAR δ i kolorektal kreftutvikling. Noen studier gir bevis på at PPAR δ fremmer tumorigenesis mens andre gir motstridende resultater, som vi tidligere anmeldt [9]. Disse inkonsekvente resultater tilsier et behov for å ytterligere undersøke funksjonen av PPAR δ i patogenesen av tykktarmskreft. Nylig har vi lykkes etablerte PPAR δ-knockdown modeller av tykktarmskreft cellelinjer (KM12C etc.) av lentivirus-mediert RNA forstyrre (RNAi) [10]. Vi fant at PPAR δ knockdown betydelig mindre indusert differensiering og fremmet proliferasjon av disse cellene [9], [10]. Disse funnene indikerer at PPAR δ kan spille en tumor suppressor rolle ved å legge til rette for differensiering og hemme spredning av kreft i tykktarmen. Men det fortsatt mangler av in vivo eksperiment for å vitne disse in vitro funnene. Til mer grundig definere PPAR δ rolle i kolorektal kreftutvikling, undersøkte vi effekten av PPAR δ knockdown på det nakne mus xenografter etablert med KM12C celler i denne studien.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje KM12C (fra professor IJ Fidler, Anderson Cancer Center, Texas), ubehandlet eller behandlet av lentivirus-mediert RNA forstyrre (RNAi) mot PPAR δ genet fra vår tidligere studie [10], ble brukt. Celler ble holdt i Eagles minimale essensielle medium (MEM) med Earle s salter, L-glutamin og ikke-essensielle aminosyrer (Sigma-Aldrich), supplert med 1,5% NaHCO3, 1 mm Na-pyruvat (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), en x MEM Vitamin Solution (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), 1 ug /ml puromycin (bare for de behandlede celler for å opprettholde renhet) og 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Uttrykket av PPAR Æ har vært stabilt forstummet i cellene behandlet av lentivirus-mediert RNAi som undersøkes i vår tidligere studie [10].
Etablering av tumorxenotransplantater i hårløse mus
Førti-åtte kvinnelig naken mus seks ukers alder ble kjøpt fra Sichuan University Laboratory Animal senter (Chengdu, Kina). Musene ble holdt i 7 dager i en konvensjonell dyr care unit før starten av studien.
Mus ble bedøvd med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (65 mg /kg, Catalogue No.p3636, Sigma-Aldrich, Sverige). De KM12C celler enten med stabilt stilnet PPAR δ eller ubehandlet ble deretter injisert subkutant (2 x 10
6 celler /mus i 100 pl PBS) i den høyre flanken av hver mus (24 mus pr gruppe). Tjuefire timer etter vaksinasjonen, ble tolv tilfeldig utvalgte mus i hver gruppe injisert med bevacizumab (Avastin ™, Genentech, CA) via halevenen på 5 mg /kg kroppsvekt. Tumorvekst ble overvåket med jevne mellomrom ved å måle to Tumordiametere bruker elektronisk calipers. Tumorvolumet ble beregnet med den følgende formelen: (lengde x bredde
2) /2. Musene ble avlivet 25 dager etter inokulering, og tumorer ble fiksert i 10% nøytral formalin. Prosedyrene ble operert på en blindet måte av en etterforsker (L. Yang) uten kjennskap til å gruppere informasjon
Etikk uttalelse. Dyret håndtering ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av godkjent av Animal Experimental Ethics Committee of Sichuan University. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Hematoxylin og eosin (HE) Farging
De xenograft fra mus ble regelmessig innebygd i Paraffinum og deretter delt på en tykkelse på 5 mikrometer. Seksjonene ble deparaffinized i xylen, rehydrert i etanol, skylt i destillert vann, og deretter fiksert med 4% formaldehyd, farget med Hematoxylin Ehrlich og eosin (Sigma-Aldrich) fulgt av dehydratisering i gradert alkohol. Lysbilder ble montert og analysert under lysmikroskop.
Immunhistokjemisk analyse (IHC)
immunostaings ble utført på 5 mikrometer parafininnstøpte seksjoner som tidligere rapportert [9]. De primære antistoffer var kanin polyklonale anti-PPAR δ IgG (ARP37889, Aviva Systems Biology, CA), anti-Ki67 Ig G (ab15580, Abcam, MA) og mus monoklonalt anti-VEGF IgG (ab68334, Abcam, MA). Envision System Labelled Polymer-HRP-anti-kanin (Dakocytomation, CA) ble anvendt som et sekundært antistoff. Seksjoner som er kjent for å vise en positiv farging for PPAR δ, Ki67 eller VEGF ble inkludert i hvert forsøk, som fikk enten det primære antistoff eller PBS, som positive eller negative kontroller. I alle flekker prosedyrer, de positive kontrollene viste klart flekker, mens det ikke var noen flekker på de negative kontrollene.
IHC lysbilder ble undersøkt uavhengig blindt av to etterforskere (LY og JZ) uten kjennskap til gruppering informasjon. Undersøkerne mottok hver del av fargeintensitet av tumorceller som følger: 0 (negativ farging), 1 (svak farging stilt som lys gul), 2 (moderat farving stilt som gul brun), og 3 (sterk farging stilt som brun) . For å unngå kunstig effekt, ble cellene på randen av seksjonene og i områder med dårlig morfologi ikke telles. I de tilfeller der flekker poengsum hadde avvikende resultater, ble en enighet poengsum nådd etter re-evaluering
Cell apoptose Detection
Nivået av apoptose ble bestemt av terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT). – mediert dUTP nick end-merking (TUNEL) assay med In Situ celledød Detection Kit (Katalog nr 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) etter produksjon protokoll. Kort fortalt ble seksjonene de-paraffinized, rehydrert, permeabilized og likevekt. Etter merkingsreaksjonen, ble resultatene evaluert ved hjelp av Leica DM IL HC fluorescerende mikroskop. Totalt celler ble visualisert ved 330-380 nm for DAPI farging, og apoptotiske celler ble visualisert ved 465-495 nm for FITC farging. Seksjoner uten å legge TdT eller mottar DNase ble inkludert i hver kjøring henholdsvis som negative eller positive kontroller. For hver prøve ble fem kraftige felt (× 200) tilfeldig valgt, og antall apoptotiske celler ble regnet for hvert felt. Apoptose indeks (AI) = antall positive celler /totalt antall celler.
Sanntids omvendt transkripsjon (RT) PCR
Total RNA ble ekstrahert fra svulster ved hjelp TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Tyskland), etterfulgt av revers transkripsjon med High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA). MRNAene som koder for VEGF, Ki67, adipocyttdifferensiering-relatert protein (ADRP), leverfettsyrebindende protein (FABP-L), og tarm alkalisk fosfatase (ALPI) ble kvantifisert ved anvendelse av sanntids-RT-PCR-analyse av SYBR grønn deteksjon. PCR-reaksjonen ble utført på de Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System, ved hjelp av sammenlignende terskelsyklus (Ct) -metoden (△△ Ct) som tidligere beskrevet [11]. Primerne benyttet for å kvantifisere mRNA var oppført i tabell 1. Ekspresjon ble normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), og 1 x blanding av GAPDH-primere (Pre-utviklet TaqMan analysereagensene, Applied Biosystems) ble benyttet for påvisning . Hver prøve ble analysert i triplikat.
Måling av VEGF Produksjonen fra KM12C Celler
VEGF-produksjon fra KM12C-celler ble målt med en human VEGF kolorimetrisk ELISA-sett (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). I korthet KM12C-celler (1 x 10
6) med PPAR δ slås av eller ubehandlet, ble dyrket i serumfritt medium i 18 timer. Deretter ble cellene behandlet med bærer eller angitt konsentrasjon av GW501516, den spesifikke agonist av PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 uM) i 24 timer. Supernatantene ble underkastet ELISA i henhold til produsentens instruksjoner. Fargeintensiteten hver brønn ble bestemt på en mikroplateleser (Anthos htIII, Østerrike) på 450 nm. Kalibreringskurver ble konstruert for hver analyse ved å plotte absorbansen verdi i forhold til konsentrasjonen for hver kalibrator. VEGF konsentrasjoner av prøvene ble deretter lest fra kalibreringskurven og normalisert til nanogram per 10
6 celler.
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av enten en t-test, eller eventuelt rank sum test, variansanalyse (ANOVA) eller Chi-kvadrat test i SPSS 13.0 programvare. Den relative ekspresjon av mRNA ble analysert ved anvendelse av programvaren REST-XL
© (tilgjengelig ved https://www.wzw.tum.de/gene-quantification/) basert på ΔΔCt metode [11].
P
0,05 ble tatt som signifikansnivået. Viste data representerer minst tre gjentak av hvert eksperiment utført i tre eksemplarer.
Resultater
knockdown av PPAR δ Forfremmet tumorvekst og redusert følsomhet for Bevacizumab
For å undersøke effekten av PPAR δ knockdown på tumorvekst in vivo, inokulert vi KM12C celler enten med PPAR δ stilnet eller normale i nakne mus og målt tumorvolumer på opptil 25 dager. Som vist i figur 1A, helningen av xenograft vekstkurven var høyere alt sammen for PPAR δ-stilnet gruppe, og denne forskjell i vekstrater var statistisk signifikant (
P
0,05). Ved slutten av vekstperioden, det midlere tumorvolum var 2,1 ganger høyere for knockdown gruppe enn i kontrollgruppen (2,8 cm
3 vs 1,3 cm
3
P
= 0,015; figur 1A-C), med en snittvekt på 4,0 ± 1,4 g for knockdown-gruppen og 2,5 ± 0,6 g for kontroll (
P
= 0,021, figur 1D).
(A). Vekstkurven av xenotransplantater. Ved hvert tidspunkt, er xenotransplantater i PPAR δ-stilnet gruppe (n = 12) vokste betydelig større enn de i kontrollgruppen (n = 12) (*
P
0,05), selv når det behandles med bevacizumab (**
P
0,05) (gjennomsnitt ± SD, t-test). (B). Representative fotografi av mus i hver gruppe ble tatt 25 dager etter inokulering. (C). De transplantater når nakne mus ofret. (D) De xenografter i PPAR δ-forstummet gruppen var vesentlig tyngre enn de i kontrollgruppen når hårløse mus ofret (gjennomsnitt ± SD; *
P =
0,021; **
P =
0,02 ;. t-test)
for å vurdere relevansen av å kombinere PPAR δ knockdown med bevacizumab behandling, injisert vi bevacizumab til musene. Vi har funnet at administrering av bevacizumab signifikant reduserte tumorvekst i begge gruppene, mens tumorene hos PPAR δ-stilnet gruppen vokste vesentlig raskere enn PPAR δ-normal gruppe (
P
0,05; figur 1A). Den midlere sluttvolum på tumorer var 1,4 ganger større i knockdown gruppe enn i kontrollgruppen (0,9 ± 0,11 cm
3 vs. 0,6 ± 0,15 cm
3
P
= 0,033; fig 1A- C), med en snittvekt på 1,2 ± 0,5 g for knockdown-gruppen og 0,8 ± 0,2 g for kontroll (
P
= 0,02, figur 1D).
De xenografter med PPAR δ knockdown var mindre differensierte
Etter Unified Standard of National Colorectal Cancer Pathology forskning i Kina, differensiering av tumor ble gradert med prosentandelen av adenoid struktur komponenter som følger: godt differensiert ( 95%), moderat (50 % -95%), dårlig (5% -50%) og udifferensiert (mindre enn 5%). Ved HE flekker, fant vi betydelig mer mindre differensiert (dårlig + udifferensiert) xenografter i PPAR δ-forstummet gruppe enn de i kontrollgruppen (85% vs. 17%,
P
= 0,025) (figur 2A, B). Vi har videre kvantifisert genene forbundet med terminal differensiering, og fant at mRNAer som koder for ADRP, L-FABP eller ALPI var alle signifikant redusert i de PPAR-δ stilnet gruppe i forhold til kontrollgruppen (
P
0,05 Figur 2C)
(A).. Representative bilder av xenografter av HE flekker. De xenotransplantater i PPAR δ-stilnet gruppe (n = 12) var åpenbart mindre differensiert enn de i kontrollgruppen (n = 12). X 400 forstørrelse. (B). PPAR δ- forstummet gruppen hadde signifikant mer mindre differensierte xenografter enn kontrollgruppen (85% vs. 17%,
P
= 0,025, Chi-kvadrat test). (C). Vist av kvantitativ RT-PCR, de mRNA som koder ADRP, L-FABP eller ALPI ble betydelig redusert i PPAR δ-Silenced gruppen i forhold til kontrollgruppen (
P
0,05).
PPAR δ knockdown fremmes spredning av kreftceller
Vi har tidligere vist at PPAR δ-forstummet KM12C cellene hadde et fremmet vekst in vitro [9]. Å vitne det in vivo, undersøkte vi uttrykket av markøren spredning Ki67 i xenografter. Som vist av IHC analyse, den PPAR δ-forstummet gruppen hadde signifikant høyere uttrykk av Ki67 enn PPAR δ-normal gruppe (gjennomsnitt poengsum: 3,5 ± 0,4 vs. 2,0 ± 0,6,
P
= 0,026; figur 3A, B). Etter bevacizumab, ble uttrykket av Ki67 markert redusert i begge gruppene, mens fortsatt betydelig høyere i PPAR δ-forstummet gruppen enn i kontrollgruppen (gjennomsnittlig poengsum: 2,3 ± 0,5 vs. 1,2 ± 0,3,
P
= 0,031; Figur 3A, B). Den kvantitative RT-PCR ga konkordant resultat med IHC-analysen (
P
0,05; Figur 3C).
(A). Representative fotografier av Ki67 uttrykk i xenografter farget av IHC. × 400 forstørrelse. (B). PPAR δ- forstummet gruppe (n = 12) hadde signifikant høyere score på Ki67 flekker enn kontrollgruppen (n = 12) (*
P
= 0,026), selv etter behandlet av bevacizumab (**
P
= 0,031) (gjennomsnitt ± SD; t-test). (C). MRNA nivået av Ki67 var betydelig høyere i PPAR δ-forstummet gruppen enn i kontrollgruppen (*
P
= 0,018), selv etter behandlet av bevacizumab (**
P
= 0,025).
PPAR δ knockdown påvirket ikke apoptose av tumorceller
effekten av PPAR δ knockdown på celle apoptose ble undersøkt av TUNEL analysen. Som vist i figur 4, var signifikant forskjell fra AI ikke funnet mellom PPAR δ-taushet gruppe og en kontrollgruppe (6,2 ± 4,7% vs. 7,0 ± 3,6%,
P
= 0,81), selv etter bevacizumab ( 10,8 ± 4,1% vs.11.2 ± 2,9%,
P
= 0,75).
(A). Representative bilder av hver gruppe. Den totale celler ble identifisert ved DAPI flekken, og de positive apoptose-celler ble identifisert ved FITC flekk. X 200 forstørrelse. (B). Kvantitative data for apoptose indeks (AI). Det var ikke signifikant forskjell på AI mellom gruppene selv etter behandlet med bevacizumab (gjennomsnitt ± SD, *
P
= 0,81, **
P
= 0,75; t-test).
knockdown av PPAR δ indusert VEGF uttrykk i xenografter
for å analysere korrelasjonen av PPAR δ med VEGF, vi videre undersøkt uttrykk for VEGF i xenografter. Ved IHC, fant vi at PPAR δ-forstummet gruppen hadde signifikant flere tilfeller med høy uttrykt VEGF (poengsum ≥2.0) (77% vs. 33%,
P
= 0,03) og høyere intensitet score enn kontrollgruppen gruppen (3,1 ± 0,3 vs. 1,5 ± 0,2,
P
= 0,028; figur 5A, B). Kvantitativ RT-PCR-analyse viste at mRNA til VEGF var signifikant økt i PPAR δ-stilnet gruppe sammenlignet med kontrollen. (
P = 0,032
, figur 5C)
(A). Representative fotografier av VEGF uttrykk i xenografter farget av IHC × 400 forstørrelse.; (B). PPAR δ- forstummet gruppe (n = 12) hadde signifikant høyere score på VEGF farging enn kontrollgruppen (n = 12) (*
P
= 0,028; rank sum test). (C). Kvantitativ RT-PCR resultat (*
P =
0.032).
Aktivering av PPAR δ Redusert VEGF uttrykk i KM 12C Cells
For å bekrefte sammenhengen mellom PPAR δ og VEGF, behandlet vi KM12C celler med GW501516 (den spesifikke agonist av PPAR δ) eller bærer, og kvantifisert VEGF i den cellefrie supernatant ved hjelp av ELISA-analyse. Som vist i figur 6, utskillelsen av VEGF var mye høyere i PPAR δ-dempede celler enn i de med normal PPAR δ (kontrollceller) før GW501516 administrering (
P
= 0,035). Etter behandling med GW501516, ble VEGF redusert på en doseavhengig måte i kontrollcellene (
P
= 0,018) mens det ikke var signifikant endring i den PPAR δ-dempede celler langs (
P
= 0,83).
KM12C cellene behandlet med serielle konsentrasjoner av GW501516 eller kjøretøy, og celle-frie supernatanter ble oppsamlet for VEGF kvantifisering ved hjelp av ELISA. Behandlet av GW501516, kontrollcellene viste en doseavhengig reduksjon av VEGF-sekresjon (*
P
= 0,018), mens PPAR-δ dempede celler hadde ingen signifikant endring langs (**
P
= 0,83;. ANOVA)
Diskusjoner
i denne studien fant vi at de xenografter i PPAR δ-forstummet gruppe vokste betydelig raskere med mindre differensiering, fremmet celleproliferasjon mens lignende apoptose indeks og øket VEGF sammenlignet med de av PPAR δ-normal gruppe, uavhengig av bevacizumab. Administrasjon av PPAR δ agonist betydelig redusert VEGF uttrykk i PPAR δ-normale KM12C celler, mens ikke påvirke det av PPAR δ-forstummet celler. Disse funnene viser at, knockdown av PPAR δ fremmer veksten av tykktarmskreft ved lesse differensiering og fremme spredning, så vel som VEGF-ekspresjon av tumorceller in vivo, og reduserer tumor følsomhet for bevacizumab. Disse resultatene støtter en suppressor rolle PPAR δ i patogenesen av tykktarmskreft.
I denne studien, våre funn at transplantater på mus vokste betydelig større og tyngre etter PPAR δ knockdown indikerer at PPAR δ kan dempe svulst vekst in vivo. I henhold til dette funnet, nyere studier viser at kolon polypper dannelsen var signifikant større i PPAR δ-manglende mus sammenlignet med vill-type dyr [12], [13]. I motsetning til disse observasjoner, Park et al. [14] rapporterte at PPAR δ-null HCT-116-celler hadde en redusert evne til å danne xenotransplantater i nakne mus. En annen studie konkluderte med at PPAR δ er unnværlig for polypp dannelse i tykktarmen av APC
min mus [15]. Men disse konklusjoner ble basert på analyse av mindre enn 6 mus, med begrenset statistisk styrke. Resultatet fra denne studien omfatter data fra til sammen 48 mus, og gir mer definitive bevis for en funksjonell rolle for PPAR δ i kolon kreftutvikling.
For å klargjøre mekanismen bak den fremmet veksten av svulster etter PPARd knockdown, vi videre analysert differensiering, celleproliferasjon, apoptose og VEGF uttrykk i xenografter. Vi fant at xenotransplantater viste signifikant mindre differensiert histologi etter PPAR δ knockdown, med økt uttrykk av differensiering relaterte gener ADRP, L-FABP og Alpi. Disse funnene gir in vivo bevis for at PPAR δ kan lette differensiering av tykktarmskreft. Dette funnet er i samsvar med nyere studier som implisere PPAR δ i reguleringen av epitelial differensiering: Aktivering av PPAR δ stimulerer terminal differensiering av keratinocytt [16] – [18]; PPAR δ fremmer differensiering av Paneth celler i tarm krypter [19]. Nylig, viser vi at PPAR δ knockdown induserer mindre differensiering av tykktarmskreft cellelinjer, og høy ekspresjon av PPAR δ er relatert til bedre differensiering av endetarmskreft [10]. Disse funnene er i tråd med in vivo observasjoner i denne studien. Forskrift om differensiering kan ligge til grunn for den fremme effekten av PPAR δ knockdown på tumorvekst, som vist i denne studien.
Balansen mellom spredning og apoptose spiller en viktig rolle i kontrollen av tumorvekst. Progresjonen av tumorvekst er karakterisert ved øket proliferasjon og /eller redusert apoptose, eller begge deler. I denne studien fant vi at uttrykket av Ki67 ble betydelig økt, mens apoptose av tumorceller ikke ble endret etter PPAR δ knockdown. Det viser at PPAR δ knockdown kan fremme spredning samtidig ikke ha noen effekt på apoptose av tykktarmskreftceller. Dette resultatet er i overensstemmelse med våre tidligere observasjoner in vitro, som viser at PPAR δ knockdown fremmer proliferasjon av HCT-116-celler uten virkning på apoptose [20]. Ubalansen av spredning og apoptose er ansvarlig for fremmet tumorvekst etter PPAR δ knockdown.
Angiogenese er en av de viktigste faktorer som bestemmer tumorvekst, som svulst må stimulere vert å skape sin egen blodkar til å fortsette å vokse når det blir større enn 1-2 mm
3 [21]. VEGF er en utløser av angiogenese og essensiell for utviklingen av blodkar [22], [23]. Sammen med VEGF, andre vekstrelaterte gener er involvert i angiogenese. En fersk studie viste at aktivering av PPAR δ oppregulert VEGF i tykktarm kreft celler [24], impliserer PPAR δ i angiogenese for tykktarmskreft. I denne studien, viser vi at VEGF ble betydelig økt i både KM12C celler og transplantater etter PPAR δ knockdown, og redusert i PPAR δ-normale KM12C celler mens uendret i PPAR δ-silenced celler etter behandling av GW501516. Det viser at aktivering av PPAR δ inhiberer ekspresjonen av VEGF og kan således svekke den angiogenese av tykktarmskreft. Dette resultatet er i overensstemmelse med den nylige studier som viser at PPAR δ kan hemme proliferasjon av vaskulære endotelceller [7], [25], [26]. Fremming av VEGF-mediert angiogenese kan være en annen faktor bak den fremmet tumorvekst etter PPAR δ knockdown.
For å undersøke påvirkning av PPAR δ knockdown på kjemoterapeutisk følsomhet, behandlet vi den hårløse mus med bevacizumab. Etter behandling ble tumorvekst, så vel som celleproliferasjon åpenbart bremset, og apoptose ble øket i begge grupper, mens PPAR-δ stilnet gruppe fremdeles viste høyere kapasiteter på tumorvekst og celledeling enn PPAR δ-normal gruppe. Dette funnet viser at PPAR δ knockdown reduserer følsomheten av tykktarmskreft overfor bevacizumab, underliggende som kan være den økte proliferasjon og differensiering minske av tumorer. Det innebærer også at VEGF-mediert reaksjonsvei er ikke den eneste mekanisme ved hvilken PPAR δ regulerer tumorvekst. Så vidt vi vet er dette første gang for å rapportere effekten av PPAR δ på kjemosensitivitet av tykktarmskreft. Det innebærer at den tykktarmskreft med normal eller høy uttrykk for PPAR δ kan ha bedre svar på bevacizumab enn de med lav uttrykk for PPAR δ. Derfor kan uttrykket nivået av PPAR δ være en potensiell effekt prediktor for bevacizumab, og utvikling og anvendelse av PPAR δ-agonist middel kan være en lovende måte å fremme effekten av bevacizumab for tykktarmskreft.
I som konklusjon, viser vi her at PPAR δ knockdown fremmer veksten av kreft i tykktarmen, indusere mindre differensiering og akselererende celleproliferasjon, så vel som VEGF-ekspresjon, mens ikke har noen virkning på apoptose, uavhengig av bevacizumab. Ligandaktivering av PPAR δ reduserer ekspresjon av VEGF i tykktarmskreftceller. Disse funnene indikerer at PPAR δ kan hemme tumorvekst ved å indusere differensiering, demping av celledeling og VEGF-mediert angiogenese i patogenesen av tykktarmskreft, og legge til rette svulsten følsomhet for bevacizumab. Disse resultatene støtter begrunnelsen for å utvikle PPAR δ agonister for forebygging og /eller behandling av tykktarmskreft.
Takk
Vi takker professor I.J. Fidler (Anderson Cancer Center, Houston, Texas) for å tilby KM12C cellelinje.
