Abstract
Her er vi rapportere at 3′-hydroxypterostilbene (HPSB), en naturlig pterostilbene analog, var mer potent enn pterostilbene mot veksten av humane kreftceller (COLO 205, HCT-116, og HT- 29) med målte IC
50-verdier på 9,0, 40,2 og 70,9 uM, respektivt. Vi fant at HPSB effektivt hemmet veksten av humane tarmkreftceller ved å indusere apoptose og autophagy. Autophagy forekom på et tidlig stadium og ble observert ved dannelse av sure vesikulær organeller og mikrotubulus-assosiert protein ett lettkjede-3 II-produksjon. På molekylært nivå er resultatene fra western blot-analyse viste at HPSB signifikant nedregulert fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) signalings inkludert redusert fosforylering av pattedyr målet for rapamycin (mTOR). Vesentlige terapeutiske effekter ble påvist
in vivo
av behandling av nakne mus med COLO 205 tumorxenotransplantater med HPSB (10 mg /kg
i.p..
). Disse hemmende effekter ble ledsaget av mekanistisk nedregulering av protein nivåene av cyklooksygenase-2 (COX-2), matrise metallopeptidase-9 (MMP-9), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og cyklin D1, samt av induksjon av apoptose i tykktarmskreft. Våre funn tyder på at HPSB kan tjene som en roman lovende agent for tykktarmskreft behandling
Citation. Cheng T-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam N, Majeed M, Ho C-T, et al. (2014) potent anti-kreft effekt av 3′-Hydroxypterostilbene i Human Colon xenografttumorer. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10,1371 /journal.pone.0111814
Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, Taiwan
mottatt: 08.08.2014; Godkjent: 08.10.2014; Publisert: 12.11.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Science Council NSC 101-2628-B-022-001-MY4, 102-2628-B-002-053-My3, og NTU-103R7777 (for Dr. Pan) og av helse og velferd avgift på tobakksvarer MOHW103-TD-B-111-01 (for Dr. Ho). Sabinsa Corporation gitt støtte i form av lønn for forfattere NK MM, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser. NK og MM er ansatte i Sabinsa Corporation. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Epidemiologiske studier gir overbevisende bevis for at kostholdsfaktorer kan endre prosessene i kreftutvikling, herunder initiering , forfremmelse, og progresjon av flere typer kreft hos mennesker [1]. Kreft chemoprevention er bruken av farmakologiske eller naturlige midler for å hemme utvikling av invasiv kreft eller reversere prosessen med kreftutvikling. Det kan være den mest direkte prosess for å redusere sykelighet og dødelighet av kreft sykdom [2] – [4]. Et stort antall chemopreventive og kjemoterapeutika, fra naturlige produkter, har blitt brukt som en lovende strategi for å bekjempe kreft ved å indusere apoptose i ondartede celler [5], [6].
pterostilbene (
trans
-3,5-dimetoksy-4′-hydroxystilbene), en dimetyleter analog resveratrol, er funnet å være like effektivt som resveratrol for å hindre carcinogen-indusert preneoplastiske lesjoner hos en mus brystkulturmodell og hemmer metastatisk vekst av melanomceller på leveren [7], [8]. Vi og andre har vist at pterostilbene oppviser pleiotropiske farmakologiske effekter inkludert anti-inflammatorisk, antioksidant, anti-proliferative, anti-kreft, og smertestillende aktivitet i cellekultur og dyrestudier [9] – [14]. Nylig, 3′-hydroxypterostilbene (fig. 1), en ny naturlig pterostilbene analog er blitt isolert fra
Sphaerophysa salsula
, er markert mer aktiv enn pterostilbene til å indusere apoptose i sensitive og resistente leukemiceller [15], [ ,,,0],16]. Men
in vivo
antitumor effekt av HPSB fortsatt uklart.
Autophagy, også kjent som type II programmert celledød, er preget av dannelsen av en dobbel-membran eller isolasjon membranen som er avledet fra en del av det endoplasmatiske retikulum (ER) [17] eller fra cytolplasmic lipid bassenget [18]. Den dobbeltmembran former autophagosome ved Sequester partier av cytoplasma og intracellulære organeller [11], [12], [19], [20].
Autophagy er en reaksjon av eukaryote celler til ulike mikro påkjenninger, blant annet sult, patogen angrep og kjemoterapi. Dessuten er det også flere rapporter har vist at autofagi induksjon synes å lette vellykket terapi-fremkalt dreping av tumorceller [21], og pro-autophagic legemidler, slik som temozolomid er lovende kandidater for selektiv dreping av apoptose-resistente glioblastom [22].
den initierende signal for autofagi formasjonen er dårlig forstått, mens det har blitt etablert at flere molekyler og signalveier er involvert i regulering av autofagi, slik som PI3K-AKT-mTOR (fosfatidylinositol 3-kinase /protein kinase B /mammalian target of rapamycin), MAPKs, Raf-1-MEK1 /2-ERK1 /2 og PTEN (fosfatase og tensin homolog) trasé [10], [23]. PTEN og AKT er oppstrøms regulatorer av mTOR sti som fungerer som induserer eller hemmer av selvdestruerende, henholdsvis. AKT hemmer selvdestruerende ved å regulere nedstrøms molekylær 4E-BP1 (4 forlengelse-bind protein 1), p70S6K som resulterer i å fremme mRNA oversettelse.
I denne studien, må vi først undersøkte antiproliferative virkningene av pterostilbene og sin naturlige tre «hydroksyderivatet på menneskelige tykktarmskreftceller. Våre resultater viste tydelig at HPSB var mer potent enn pterostilbene til å indusere apoptose i en doseavhengig måte i COLO 205-celler.
Vi evaluerte ytterligere de molekylære mekanismer for apoptotiske og autophagic effekter indusert av HPSB. Å belyse anticancer mekanisme HPSB undersøkte vi de signalveier knyttet til HPSB-indusert autofagi i menneskelige COLO 205 tykktarmskreftceller.
In vivo
terapeutisk effekt ble ytterligere undersøkt ved behandling av nakne mus med COLO 205 tumorxenotransplantater med 10 mg /kg
ip
HPSB. Denne studien gir romanen bevis for at hydroksyl derivat av pterostilbene kan tjene som en ny og lovende middel mot mennesketykktarmskreft.
Materialer og metoder
2.1 Reagenser
propidiumjodid ( PI), acridinoransje (AO) og klorokin (CQ) ble kjøpt fra Sigma Chemical (St. Louis, Missouri, USA). 2 «, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) og 3,3»-dihexyloxacarbocyanine jodid (DiOC6) ble kjøpt fra Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). PARP, DFF-45, LC-3 I /II, p-mTOR (Ser
2448), mTOR, p-P70S6K (Thr
398), p-P70S6K (Ser
371), p -Akt (Ser473), Akt, PI3K, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, p-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 og MMP-9 antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Den p-PI3K p85α (Tyr508), ERK1 /2, ble VEGF og cyclin D1 antistoffer kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Caspase 3, 8 og 9 antistoffer ble kjøpt fra IMGENEX (San Diego, California, USA). COX-2 antistoff ble kjøpt fra Transduksjon Laboratories (BD Biosciences, Lexington, KY). Den β-actin antistoff ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Pterostilbene og HPSB ble hentet fra Sabinsa Corp (East Windsor, NJ). Renheten av pterostilbene og HPSB ble bestemt ved HPLC som høyere enn 99,2%.
2.2 Cellekultur
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer Colo 205, HCT-116 og HT-29 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Cellelinjer ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (GIBCO BRL, Grand Island, New York), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin), 2 mM L-glutamin (GIBCO BRL, Grand Island, NY), og ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Pterostilbene og HPSB ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO, som sluttkonsentrasjon på 0,05%). Celler ble behandlet med 0,05% DMSO som vehikkelkontroll.
2,3 Cytotoksisitet assay
Cellenes levedyktighet ble analysert ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid (MTT). Kort sagt ble COLO 205, HCT-116 og HT-29-celler sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5-celler /ml i 96-brønners plater. Etter vekst over natten, ble cellene behandlet med en serie av konsentrasjoner av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. Sluttkonsentrasjonene av DMSO i kulturmediet var 0,05%. Ved slutten av behandlingen ble 0,2% MTT tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer. Celleviabilitet ble bestemt ved å skanne med en ELISA-leser med en 570-nm filter.
2,4 Flowcytometri analyse av sub-G1 cellepopulasjon, mitokondriemembranen potensial og ROS produksjon
For sub-G1 celle populasjonsanalyse, COLO 205-celler (2 x 10
5 celler /ml) ble dyrket i 12 brønnen og behandling med forskjellige konsentrasjoner av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. Cellene ble deretter høstet, vasket med PBS, resuspendert i 200 ul PBS, og løst i 800 pl 100% etanol avkjølt ved -20 ° C. Etter at den fikk stå over natten, ble cellepelletene samlet ved sentrifugering, resuspendert i 1 ml hypotonisk buffer (0,5% Triton X-100 i PBS og 0,5 mikrogram /ml RNase) med PI (50 ug /ml) og inkubert ved 37 ° C i mørket i 30 min. Fluorescens avgitt fra PI-DNA-kompleks ble kvantifisert etter eksitasjon av den fluorescerende fargestoff ved FACScan-cytometri (Becton Dickinson, San Jose, CA). I autophagy inhibitoren studien ble cellene forbehandlet 25 uM CQ i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med pterostilbene eller HPSB.
For mitokondriemembranpotensialet og ROS-produksjon, celle ble behandlet som beskrevet ovenfor i 15 min, og deretter DiOC6 (40 nM) eller DCFH-dA (20 uM) ble tilsatt til mediet for en ytterligere 30 min ved 37 ° C. Etter vask med PBS ble fluorescens intensitet bestemmes av FACScan cytometri.
2,5 Påvisning av autofagi
Autophagy induksjon ble oppdaget av AO farging. Etter 24 timers behandling ble COLO205 cellene vasket med PBS, suspendert i PBS og farget med 1 pg /ml AO på 20 min. Fotografier ble oppnådd med en fluorescens mikroskop (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, New York) er utstyrt med en kvikksølv 100 W lampe, 490 nm-band-pass blå eksitasjon filtre, en 500 nm dichroic speil og en 515-nm lang pasning barriere filter. For kvantifisering av avos ved flow-cytometri ble cellene behandlet som beskrevet, og farget med AO i 15 min og ble analysert ved FACScan strømningscytometer laser og Cellquest-programvare.
2,6 Western blotting
De samlede proteiner av COLO 205-celler ble ekstrahert via tilsetning av gull lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid, 1% NP-40, og 10 ug /mL leupeptin) til cellepelletene på is i 30 min, etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Den totale proteiner ble målt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Munchen, Tyskland). Prøvene (50 ug protein) ble blandet med 5 x prøvebuffer inneholdende 0,3 M Tris-HCl (pH 6,8), 25% 2-merkaptoetanol, 12% natriumdodecylsulfat (SDS), 25 mM EDTA, 20% glycerol, og 0,1% bromfenolblått. Blandingene ble kokt ved 100 ° C i 5 minutter og ble utsatt for 10% SDS-polyakrylamid-Minigeler ved en konstant strøm på 20 mA. Elektroforese ble deretter utført på SDS-polyakrylamidgeler. Proteiner på gelen ble elektrooverført på en ubevegelig membran (PVDF, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) med overføringsbuffer bestående av 25 mM Tris-HCl (pH8.9), 192 mM glycin og 20% metanol. Membranene ble blokkert med blokkeringsløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl, og deretter immunoblottet med forskjellige primære antistoffer og β-aktin. Blottene ble vasket tre ganger med PBST-buffer (0,2% Tween 20 i 1 x PBS-buffer) i 10 minutter hver. Deretter blot ble inkubert med 1:5000 fortynning av pepperrot (HRP) konjugert sekundært antistoff (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) og deretter vasket igjen tre ganger med PBST buffer. De overførte proteiner ble visualisert med en forbedret chemiluminescence deteksjon kit (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Tettheten av båndene ble kvantifisert med en datamaskin densitometer (AlphaImagerTM 2200 System Alpha densitometer. Innotech Corporation, San Leandro, CA).
2,7 Aktivitet av caspases
caspase 3, 8 og 9 aktivitet i protein uttak av COLO 205-celler ble bestemt ved en fluorogen analyse (Promega største CaspACE analysesystem, Madison, WI). I korthet ble 50 ug av totalt protein, som bestemt ved Bio-Rad proteinanalysesett (Bio-Rad Laboratories), ble inkubert med 50 pM substrat Ac-Asp-Glu-Val-Asp-methylcoumaryl-7-amin (caspase-3- spesifikt substrat), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (kaspase-8 spesifikt substrat), eller Ac-Leu-Glu-His-Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( caspase-9 spesifikt substrat) ved 30 ° C i 1 time. Utgivelsen av methylcoumaryl-7-amin ble målt ved eksitasjon ved 360 nm og emisjon ved 460 nm ved hjelp av en fluorescens spektrofotometer (ECLIPSE, Varian, Palo Alto, California).
2,8 COLO 205 xenograft modell
Mann Balb /c nakne mus i 3-4 uker gamle (som veier 16-18 g) ble innhentet fra BioLASCO Experimental Animal senter (BioLASCO, Taipei, Taiwan). Alle dyr ble holdt i patogenfrie sterile isolatorer og i en kontrollert atmosfære (25 ± 1 ° C ved 50% relativ fuktighet) og med en 12 timers lys-mørke-syklus 12 t i henhold til institusjonens retningslinjer. Dyrene ble fôret med standard AIN-76 kosthold og all mat, vann, caging, og sengetøy ble sterilisert før bruk. Dyr hadde fri tilgang til mat og vann til alle tider. Mat kopper var etterfylles med fersk diett hver dag. Alle dyr eksperimentell protokoll som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i National Kaohsiung Marine University (IACUC, NKMU, # 099-AAA9-02, gyldigheten datoer: 08/01 /2009-07 /31/2012) . Etter en uke fra akklimatiserings, tykktarmskreft COLO 205-celler (5 x 10
6) i 0,2 ml PBS ble injisert subkutant mellom scapulae av hver naken mus. Etter transplantasjon ble tumorstørrelse målt ved hjelp av calipers, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til følgende formel: tumorvolum (mm
3) = L x W2 /2, hvor L er lengden og W er bredden. Når tumorer nådde en midlere størrelse på 100-200 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i tre grupper (6 dyr /gruppe). Mus var
i.p.
. injeksjon med pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, henholdsvis) i 15 dager, mens kontrolldyrene ble mottatt injeksjon av maisolje. Dietten inntak og kroppsvekt av hvert dyr ble overvåket hver dag. Svulsten volum ble vurdert og registrert hver 5 dager ved hjelp av caliper målinger. Etter 15 dager ble musene avlivet ved CO
2 kvelning og lever, nyrer, milt og solide tumorer ble skåret ut og veiet umiddelbart. Gjennomsnittlig tumorvolum, og tumorvekten i hver gruppe var representerer gjennomsnitt ± standard avvik (SD). De tumorvev ble kuttet i flere deler for vestlige bolt analyse eller lagret ved -80 ° C.
2.9 Statistisk analyse
Data ble presentert som betyr ± SE til angitt antall selvstendig utførte eksperimenter . Sammenligninger av statistisk signifikans mellom grupper ble gjort ved en vei t-test eller en-veis analyse av varians (ANOVA). En
P
-verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
3.1 Hemming av cellevekst i HPSB behandlet menneskelige kolon kreftceller
vi først sammenlignet effekten av pterostilbene og HPSB (figur 1) på veksten av humane tarmkreftceller ved hjelp av trypanblått-utelukkelse assay som tidligere beskrevet. Som vist i figur 2, redusert HPSB cellevekst i dyrkede humane tarmkreftceller (COLO 205, HCT-116 og HT-29) på en doseavhengig måte, med IC
50-verdier på 9,0, 40,2 og 70,9 uM, henholdsvis (tabell 1). Den celle-veksthemmende virkning på COLO 205 og HCT-116-celler (p53 vill-type) var følsom for HPSB sammenlignet med HT-29 (p53-mutant). Disse resultatene tyder på at p53 kan være en viktig regulator i COLO 205-celler. Sammenlignet med pterostilbene, HPSB var en sterkere inhibitor av COLO 205-cellevekst. Som et resultat, har vi undersøkt grundigere de cytotoksiske effektene av HPSB i COLO 205-celler.
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (5, 10, 25 og 50 uM) av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. (A) Bestemmelse av sub-G1-celler i COLO 205-celler ved flow cytometri etter PI farging som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (B, C) Efter behandling totale cellelysater ble fremstilt fra COLO 205-celler og spaltingen av PARP, DFF-45, pro-kaspase 8 og pro-kaspase 9 ble analysert ved Western blotting. (D) Kinetikk av kaspase-aktivering i COLO 205-celler. Celler ble behandlet med 25 og 50 uM av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. Caspase aktiviteter ble analysert som beskrevet i Materialer og metoder. (E) Celler ble behandlet med 50 pM av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 15 min. Mitokondriemembranpotensialet og ROS-produksjon ble farget med DiOC6 (40 nM) og DCFH-DA (20 uM) og målt ved strømningscytometri. Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE av triplikate prøver. *
P
. 0,05 indikerer statistisk signifikant forskjell fra pterostilbene-behandlede gruppen
3,2 HPSB indusert apoptose i humane kolorektal carcinoma celler
Flow cytometri ble brukt til å undersøke induksjon av en sub-G1 cellepopulasjon, et kjennetegn på apoptose. For å undersøke hvorvidt de cytotoksiske effektene av HPSB observert i COLO 205-celler var på grunn av apoptotisk celledød, ble cellene behandlet med pterostilbene og HPSB (5-100 uM) i 24 timer, og DNA-innhold av COLO 205-celler ble utført ved flowcytometri (figur 2A). Som vist i figur 2A, prosentandelene av apoptotiske COLO 205-celler var 6,2, 8,4, 10,2, 14,8 og 7,2 og 9,3, 20,1, og 36,3% etter inkubering med 5, 10, 25, og 50 uM pterostilbene og HPSB, respektivt. Figur 2B sammenlignet med pterostilbene, HPSB markert føre til degradering av 116 kDa PARP til 85 kDa-fragmentene og indusere DFF-45 proteinnedbrytingen. Disse proteinskillelinjer var assosiert med aktiveringen av caspase-3. Som vist i figur 2C, HPSB induserte en dramatisk økning av caspase-9 spaltning enn pterostilbene. Det er imidlertid bare mindre virkning på kaspase-8-aktivitet in HPSB behandlede celler. Å overvåke den enzymatiske aktivitet av kaspase-3, -8 og -9, ble kaspase-aktivitet målt etter behandling av COLO 205-celler med 10 og 50 uM HPSB. Som vist i figur 2D, HPSB induserte en dramatisk økning av caspase-3 aktivitet på omtrent 2,4 ganger etter 24 timers behandling. Det er nylig blitt klart at apoptose innebærer et avbrudd av mitokondriemembranintegritet som er avgjørende for celledødsprosessen. Vi vurderte derfor effektene av HPSB på mitokondrie trans-membranpotensiale (ΔΨ
m). Resultater av måling av fluorescens-intensitet i COLO 205-celler eksponert for pterostilbene og HPSB sammenlignet med ubehandlede kontrollceller er oppsummert i fig. 2E. Den DiOC6 (3) fluorescens intensitet forskjøvet til venstre 224-117 og 75 i pterostilbene og HPSB-indusert apoptotiske COLO 205cells hhv. Disse resultatene bekrefter at HPSB forårsaket en reduksjon i den mitokondrielle trans-membranpotensialet i COLO 205-celler. Rollen til ROS i induksjon av apoptose er vel anerkjent. Interessant, HPSB markert reduserte gjennomsnittlig DCFH-DA fluorescens intensitet 114-38, mens pterostilbene økt DCFH-DA fluorescens intensitet 114-141 på 15 min. Ubalansen av ROS-konsentrasjoner kunne spiller en viktig rolle som en tidlig megler i HPSB-indusert apoptose.
3,3 HPSB viste sterkere induserende effekter på autofagi enn pterostilbene i COLO 205 celler
Samler bevis indikerer klart at pterostilbene har anti-tumordannelse evne gjennom induksjon av apoptose og autophagy. Vi neste vurdert om pterostilbene og HPSB også indusert autofagi i COLO 205 celler. Som vist i figur 3A, HPSB behandlingen resulterte i markert utseende av AVO enn pterostilbene når cellene ble farget med acridin oransje etter 24 timers behandling. For å kvantifisere forekomsten av HPSB-indusert autophagy, celler med avos viste forbedret rød fluorescens analysert ved flow som vesentlig øket etter behandling med HPSB på en doseavhengig måte (figur 3B og 3C). For å bekrefte forekomsten av autophagy indusert av pterostilbene og HPSB, undersøkte vi prosessen med LC3I /II, kjennetegnene ved autofagi, ved hjelp av immunoblot å oppdage celle hentet lysatene fra COLO 205 celler. Som vist i figur 3D, HPSB mer sterkere økte mengder av LC3B I /II-proteiner enn pterostilbene.
Celler ble behandlet med 50 uM pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer og farget med acridin oransje. (A) Grønn og rød fluorescens i acridinoransje-farget celler ble observert etter fluorescens mikroskop. (B, C) Deteksjon og kvantifisering av autofagi i COLO 205 celler. Cellene ble behandlet med 25 og 50 mikrometer av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer og farget med acridinoransje. Målingen av grønn og rød fluorescens i akridinorange-fargede celler ble utført ved hjelp av strømningscytometri. (D) Cellelysater ble fremstilt etter 24 timers behandling og protein ekspresjon av LC3 I /II, ble analysert ved Western blotting. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikat eksperimenter. *
P
0,05 indikerer statistisk signifikant forskjell fra pterostilbene-behandlede gruppen
3,4 HPSB hemmet mTOR /p70S6K, PI3K /Akt og MAPK signalveier i COLO 205 celler.
for ytterligere å forstå de molekylære mekanismene for HPSB indusert autofagi i COLO 205 celler, undersøkte vi fosforylering av mTOR /p70S6K, PI3K /Akt, og MPAKs i HPSB behandlede celler. Resultatene viste at fosforylering av mTOR og p70S6K (Thr389) ble markert redusert i celler behandlet med HPSB (figur 4A). Samle bevis støtter at PI3K /Akt og MAPK trasé er involvert i regulering av autofagi, men er fortsatt den JNK1 /2 i denne veien må avklares. Derfor undersøkte vi hvordan disse signalveier fungert i indusere autofagi av HPSB i COLO 205 celler. Som vist i figur 4B og 4C, fosforyleringen av PI3K, Akt, og p38 MAPK ble redusert i celler behandlet med HPSB på en tidsavhengig måte. Tvert imot, behandling med HPSB øket fosforylert ERK1 /2 og JNK1 /2 effektivt i 1 time og deretter gradvis redusert fosforylering av ERK1 /2 og JNK1 /2 fra 3 timer til 9 timer, sammenlignet med total ERK1 /2 og JNK1 /2 protein i COLO 205-celler. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at HPSB hemmer PI3K /Akt /mTOR /p70S6K, og p38MAPK stier og aktiverer ERK1 /2, JNK1 /2 MAPK stier og antyder at disse endringene megle HPSB-indusert autofagi i COLO 205 celler.
COLO 205-celler ble behandlet med 50 uM 3′-hydroxypterostilbene til forskjellige tider. Celle lyates ble fremstilt og proteinnivåer (A) p-mTOR, p-P70S6K, (B) p-PI3K, p-Akt og (C) p-ERK1 /2, p-JNK1 /2, p-p38 var analysert ved Western blotting-analyse. Alle analysene var representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Verdiene under hvert kjørefelt indikere relativ tetthet av båndet normalisert til p-aktin ved bruk av et densitometer.
I tillegg har vi brukt klorokin (CQ), en inhibitor av autophagy, for å bestemme hvorvidt inhibering av autophagy trykt HPSB-indusert cytotoksisitet. Som vist i figur 5, er resultatene indikerte at behandling med CQ viste signifikant økning cytotoksisitet (fig. 5A) med utvidet HPSB-utløst apoptose (Fig. 5B og 5C). Disse resultatene underbygge med den observasjon at HPSB behandling induserer autophagic celledød i COLO 205-celler.
Celler ble forbehandlet med 25 mM CQ i 1 time før behandling med 50 uM av pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. (A) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. (B, C) Sub-G1 cellepopulasjon (%) ble analysert og kvantifisering etter PI farging etterfulgt av strømningscytometri. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikat eksperimenter.
*
P
0,05 og
**
P
. 0,01 indikerer statistisk signifikant forskjell fra pterostilbene-behandlede gruppen
3,5 HPSB sterkt hemmet tumorvekst
in vivo
Vi videre undersøkt den terapeutiske effekten av HPSB
in vivo
av behandling av nakne mus med menneskelige tykktarmskreft COLO 205 tumorxenotransplantater, ved hjelp pterostilbene og HPSB ved en konsentrasjon på 10 mg /kg. Under eksperimentet ble alle musene overvåket for å undersøke hvorvidt pterostilbene og HPSB behandling forårsaket noen bivirkninger. Som vist i tabell 2, ble det av kropps- og organvekt i hver gruppe ikke viser noen skadelige symptomer under hele forløpet av studien. Disse resultatene antydet at ingen merkbare bivirkninger eller toksisitet ble forårsaket av
i.p..
Injeksjon av pterostilbene og HPSB. Videre er det i mus som mottok disse behandlingsregimer, ingen grove tegn på toksisitet ble observert i løpet av synlige kontroll med den generelle utseende og mikroskopiske undersøkelser av individuelle organer (data ikke vist). After15 dager, ble tumorvolumet i HPSB inhiberte signifikant i sammenligning med pterostilbene-behandlede mus (Fig. 6A og 6B). Den tumorvekt ble sterkt hemmet i HPSB-behandlede mus (Fig. 6C). Som vist i figur 6D, ble protein nivåer av COX-2, MMP-9, VEGF, cyklin D1, og pro-kaspase-3 markert redusert i COLO 205 xenografttumorer fra 10 mg /kg HPSB-behandlede gruppen sammenlignet med den pterostilbene gruppe. Våre resultater tyder på at HPSB kan tjene som en roman lovende agent for kreft kjemoterapeutiske formål.
Utprøvende behandling protokoll som beskrevet i materialer og metoder. Mus med COLO 205 xenografter var
i.p..
Injeksjon med pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 15 dager, hvor kontrollgruppen ble mottatt maisolje. (A) Fotografi av xenograft tumorer utviklet i hver gruppe er vist ved enden av day15. (B) Gjennomsnittlig tumorvolumer ble registrert i løpet av behandlingen, og (C) Gjennomsnittlig tumorvekt ble målt ved slutten av forsøket. Seks prøver ble analysert i hver gruppe, og verdiene representerer gjennomsnitt ± SD.
*
P
0,05 og
**
P
0,01, sammenlignet med kontrollgruppen.
#
P
0,05, sammenlignet med pterostilbene-behandlede gruppen. (D) Totale proteiner av xenograft tumorer i hver gruppe ble tatt ut for western blot-analyse. COX-2, MMP-9, VEGF, PCNA, cyklin D1 proteinekspresjon og spaltet caspase-3 ble påvist ved hjelp av spesifikke antistoffer. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I denne studien, for første gang, vi sammenligner med kreft celle vekst hemmende effekt av pterostilbene og HPSB (Figur 1) i humane tarmkreftceller. Resultatene fra denne studien viste at HPSB mer potente indusert apoptose og autofagi enn pterostilbene i COLO 205 celler. Denne studien indikerer at forskjellen i bioaktiviteten av HPSB sammenligne med pterostilbene er relatert til tilstedeværelsen og posisjonen av hydroksylgrupper på den grunnleggende pterostilbene kjemiske struktur. Humane kolorektale COLO 205-cancerceller gjennomgikk apoptose etter behandling med HPSB, noe som tyder på at apoptose er den viktigste årsaken for vekst-hemmende effekt av HPSB. Denne informasjonen bør gi legemidler kjemikere med ny informasjon for utforming av antitumormidler, og også informasjon for å understøtte ytterligere biologiske studier av disse modifiserte og ikke-modifiserte funksjonelle grupper i fremtiden. Som vist i figur 2, er HPSB en kraftig inhibitor av cellelevedyktighet og bevirker at potente og rask induksjon av apoptose i COLO 205-celler. Faktisk forårsaker behandlingen med HPSB reduksjon av mitokondriemembranpotensialet og induksjon av caspase-3 og caspage-9, som er forbundet med nedbrytningen av DFF-45 og PARP, forut for inntreden av apoptose. Rollen til ROS i induksjon av apoptose er vel anerkjent. Interessant er en økning i intracellulære nivåer hydrogenperoksyd i pterostilbene, mens markert redusere hydrogenperoksid nivåer i HPSB-behandlede COLO 205-celler (fig. 2E). Vi spekulert i at pterostilbene penetrerer cellemembranen i cytosol og påvirker mitokondriene sykling dioksygen gjennom elektrontransportenheten. Men HPSB kan direkte skatte ROS i celler og videre forstyrre intracellulære redoks balanse.
Kreft utvikling, en dynamisk og langsiktig prosess, involverer mange komplekse faktorer med trinnvis progresjon til slutt fører til en ukontrollert spredning og vekst av kreft celler i hele kroppen som kalles metastasering. Epidemiologiske studier har gitt overbevisende bevis for at kostholdsfaktorer kan endre denne prosessen [1]. Forholdet mellom apoptose og autofagi er kompleks og varierer mellom celletyper og forskjellige påkjenninger. Autophagy er også genetisk programmert, arrangører av autofagi har potensial for klinisk nytte i innstillingen for kreft forebygging [24]. Som autofagi er nødvendig for effektiv styring av metabolsk stress, fremme autofagi gjennom mTOR sti hemming kan forventes å begrense tumorprogresjon [25]. Dietary naturlige forbindelser gir et stort potensial i kampen mot kreft hos mennesker ved å hemme kreftutvikling prosessen gjennom celle defensiv og apoptotiske machineries [10]. Samle bevis viser tydelig at induksjon av apoptose og autofagi som en mekanisme for kreftforebygging ved diett naturlige forbindelser [24]. Vi viste at anti-kreft effekt av HPSB er regulert av apoptose og autofagi, og signalveier som medierer HPSB-indusert autofagi ble identifisert. Våre resultater viste at etter inkubasjon med HPSB, ble de LC3I /II uttrykk bemerkelsesverdig økt i COLO 205 celler (Fig. 3D).
