Abstract
Stathmin er en prognostisk markør i mange kreftformer, inkludert livmorkreft. Prekliniske studier, hovedsakelig i brystkreft, har antydet at stathmin kan i tillegg være en prediktiv markør for respons til paclitaxel. Vi først evaluert responsen til paclitaxel i livmorkreft cellelinjer før og etter stathmin knock-down. Deretter vi undersøkt klinisk respons på paclitaxel kjemoterapi i metastatisk livmorkreft i forhold til stathmin protein nivå i svulster. Stathmin nivå ble også bestemt i metastatiske lesjoner, analysere endringer i biomarkør status på sykdomsprogresjon. Knock-down av stathmin forbedret følsomhet for paclitaxel i endometrial carcinoma cellelinjer med både naturlig høyere og lavere følsomhet for paclitaxel. I kliniske prøver, ble høyt stathmin nivå vist å være assosiert med dårlig respons på paclitaxel kjemoterapi og redusert sykdomsspesifikk overlevelse bare hos pasienter behandlet med en slik kombinasjon. Stathmin nivå økt betydelig fra grunnskole til metastatiske lesjoner. Denne studien antyder, støttes av både prekliniske og kliniske data, som kan stathmin være en prediktiv biomarkør for respons til paclitaxel behandling i livmorkreft. Revurdering av stathmin nivå i metastatiske lesjoner før behandlingen starter kan være aktuelt. Dessuten vil validering i en randomisert klinisk studie være viktig
Citation. Werner HMJ, Trovik J, Halle MK, Wik E, Akslen LA, Birkeland E et al. (2014) Stathmin Protein nivå, en potensiell Predictive Merke for taxan Behandling Response i livmorkreft. PLoS ONE 9 (2): e90141. doi: 10,1371 /journal.pone.0090141
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 11 oktober 2013; Godkjent: 21 januar 2014; Publisert: 25 februar 2014
Copyright: © 2014 Werner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Helse Vest , Forskningsrådet Norge (803100, 805797) og Den norske Kreftforening (Harald Andersens legat) støttet denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne rapporterer følgende konflikter: Universitetet i Bergen /Haukeland universitetssykehus /Dana Farber Cancer Institute /Harvard gjennom BTO (Bergen Teknologioverføring AS): Noen aspekter knyttet til STMN1 som prognostisk og prediktiv markør for livmorkreft er underlagt i påvente av immaterielle rettigheter (US 12/962 946). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Stathmin1 (STMN1 heretter angitt som «stathmin «) er en 18 kD cytosolic phosphoprotein, kjent å spille en viktig rolle i cellesyklusen. Stathmin er uttrykt i alle vev. Det er en viktig regulator av mikrotubulidynamikk gjennom sine mikrotubul destabiliserende egenskaper, inkludert både forebygging av polymeriseringen og aktiv fremme mikrotubuli-depolymerisering [1] – [4]. Fosforylering av stathmin på fire serinrester i begynnelsen av den mitotiske fase demper dens destabiliserende virksomhet, slik at celler til å danne en mitotisk spindel; defosforylering finner nå sted før utgangen av mitose [1], [4]. Stathmin er også involvert i intracellulær transport, celle motilitet, polaritet, opprettholdelse av celleformen og regulering av apoptose [1].
A biomarkør er definert som en «egenskap som er objektivt målt og evaluert som en indikator på normal biologiske prosesser, sykdomsfremkallende prosesser eller farmakologisk respons på en bestemt terapeutisk intervensjon [5]. Biomarkører kan deles inn i ulike typer, som for eksempel prognostisk; knyttet til prognosen for en pasient uavhengig av behandling, og prediktive biomarkører; at identifisere pasientpopulasjoner mest sannsynlig til å (ikke) svare på en behandling [5]. Således pålitelige prediktiv biomarkører er av avgjørende viktighet for forbedret og individualisert behandling
Stathmin er oppregulert i mange faste cancere, inkludert endometrial cancer [1], [6] -. [14], og dens oppregulering har vært forbundet med clinicopathological variabler av aggressiv sykdom som økt risiko for lymfeknutemetastase [9], [15] og dårlig overlevelse [6], [9], [10], [12], [13], [16], som bekrefter stathmins rollen som en prognostisk biomarkør.
i dag er det få prediktive markører kjent i kreft hos mennesker, og enda mindre er klinisk anvendt. I livmorkreft ingen klinisk validerte prediktive markører er tilgjengelig ennå [17]. Både målrettet terapi og konvensjonelle kjemoterapeutika er effektive bare i en undergruppe av pasienter [18], [19], er det derfor et sterkt behov for å identifisere klinisk anvendelige prediktive markører. Eksempler innlemmet i klinikken inkluderer
KRAS
mutasjonsstatus indikerer respons på cetuximab og panitumumab i tykk- og endetarmskreft [18], [20], [21], ALK re-arrangement i ikke-småcellet lungekreft forutsi respons på crizotinib [18], [20], [22] og HER2 /Neu forsterkning eller overekspresjon i brystkreft for valgbarhet for trastuzumab behandling [18], [20], [23].
Taxaner er en gruppe kjemoterapeutiske midler ofte benyttes i behandlingen av endometrial karsinom. Prekliniske studier på brystkreft og prostatakreft og retinoblastom [24] – [28] gir prekliniske indikasjoner på at stathmin kan være en prediktiv markør for respons til taxaner i disse krefttypene. Høye nivåer av stathmin redusert følsomhet for brystkreft cellelinjer til paclitaxel og vinkristin [24] og banke ned av stathmin av siRNA økt følsomhet for paclitaxel i begge bryst [25] og prostata celler [27]. Denne effekten av stathmin protein nivå på behandlingsrespons ble begrenset til anti-mikrotubulidynamikk midler. Dessverre er ingen av disse studiene har tatt denne kunnskapen til et nytt nivå, integrere resultatene med kliniske data. I livmorkreft til vår kunnskap ingen studier, prekliniske eller kliniske, har utforsket en sammenheng mellom stathmin nivå og respons til paclitaxel kjemoterapi. I denne rapporten viser vi i livmorkreft cellelinjer, som reduksjon av stathmin nivåer av stathmin knock-down resulterer i bedre respons til paclitaxel. Vi viser også for første gang til vår beste overbevisning, er at stathmin protein nivå forbundet med respons til paclitaxel inneholder terapi i kliniske prøver fra pasienter med metastatisk livmorkreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
to endometrial cancer cellelinjer ble valgt på grunn av forskjellen i deres følsomhetsprofilen til paclitaxel; Ishikawa (Sigma, følsom) og Hec1B (American Type Culture Collection, redusert sensitive). Kreftcellelinje Encyclopedia (CCLE) data bekrefter forskjellen i følsomhet [29]. Linjene ble oppnådd i 2009 og autentisitet verifisering av kort tandem repeat (STR) profilering ble gjennomført i 2012 [30], [31]. Cellelinjene ble opprettholdt på de vilkår som er anbefalt av leverandørene.
Cell transfeksjon
Celler ble dyrket til 50-70% samløpet før transfeksjon ved lentiviral transduksjon (Åpne Biosystems, GIPZ lentiviral shRNAmir) . En GIPZ lentiviral shRNA målet genet sett med 3 (V3LHS_411977, V2LHS_62940; V3LHS_383505) på MOI 2.5 ble brukt. En ikke-tie GIPZ lentiviral shRNAmir kontroll (BV17110_2.80 x 10 8) ble anvendt som kontroll. Celler ble valgt med puromycin (1 mg /ml) etter transfeksjon.
Narkotika
Paclitaxel og carboplatin ble kjøpt fra Sigma.
Cell linje eksperimenter
celle~~POS=TRUNC linjene~~POS=HEADCOMP ble behandlet med paklitaxel i økende konsentrasjoner (område 1-500 nM) i 24 timer. Som klinisk taxaner er ofte kombinert med platinaderivater i livmorkreft, vi behandlet også celler med en kombinasjon av paclitaxel (i økende konsentrasjoner (range 1-500 nM) og karboplatin (fast konsentrasjon, 200 mM) i 24 timer for å observere noen synergistisk behandling . effekter Celler ble deretter enten fiksert i 2% formaldehyd for mikroskopisk vurdering av apoptose, anvendes i en proliferasjonsanalyse (MTS) eller behandlet for immunblotting eksperimenter ble i det minste utført in triplo
for vurdering av apoptose, i.. minst 150 celler ble tellet i tre forskjellige områder i 96-brønners plater. For proliferasjonsanalyser, ble eksperimenter utført i tre paralleller i 96-brønners plater. analyser ble utført med CellTiter 96® AQ
ueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) følge instruksjonene fra produsenten. absorbansen ble målt ved 490 nm ved hjelp av en ELISA plateleser (TECAN Magellan Sunrise).
immunoblotter ble utført i henhold til en standard protokoll. Kort sagt ble cellene dyrket og behandlet i 6-brønns plater og høstet i lysisbuffer etter 24 timer paclitaxel-behandling. Proteiner (25 ug) ble separert ved SDS /PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Biorad, Norge). Stathmin og /eller (spaltet) PARP ble oppdaget ved hjelp av kløyvde PARP (Asp214) (D64E10) (# 5625Cell Signa), fortynnet 1:1000 og stathmin (# 3352, Cell Signaling), fortynnet 1:1000; β-actin fungert som en lasting kontroll (anti β-actin antistoff (AC-15) (ab6276) Abcam), fortynnet 1:10000. Alkalisk fosfatase konjugert sekundære antistoffer ble brukt (Anti-kanin IgG (Sigma Aldrich A3687): Anti-mus IgG (Sigma Aldrich A3562)). Og chemoluminiscence substrat (lumiphos 34150 WB, Thermo Scientific) for påvisning
Pasient serie
Pasienter diagnostisert med og behandlet for livmorkreft ved Haukeland universitetssykehus, Bergen, Norge, er etter å ha signert informert samtykke, prospektivt og fortløpende inkludert i en database (populasjonsbasert innstilling) fra 2001 og utover, forebygge utvalg skjevhet og sikre optimal datainnsamling for alle pasienter, som tidligere rapportert [14]. Pasienter har imidlertid blitt behandlet etter rutinemessige retningslinjer og de kliniske prøvene undersøkt derfor bestå av prospektivt samlet arkiv vev. Clinicopathological innsamlede dataene inkluderer blant annet FIGO 2009 stadium, histologisk subtype, klasse, grunnskolen og adjuvant behandling, og oppfølging inkludert behandling for metastatisk sykdom. For hensikten med denne studien, pasienter som fikk paklitaxel kjemoterapi (som en rutine i vårt sykehus en kombinasjon av paclitaxel og carboplatin) etter kirurgisk behandling for enten restsykdom eller metastaser før april 2011 ble det undersøkt for behandlingsrespons i henhold til RECIST kriterier [ ,,,0],32], med siste oppfølging entry juli 2013. av totalt 607 pasienter i databasen, hvorav 121 hadde systemisk dvs. tilbakevendende eller restsykdom, 57 hadde svardataene i henhold til RECIST kriterier tilgjengelig; 33 av disse ble behandlet med paklitaxel inneholdende kjemoterapi. Vi definerte god respons som fullstendig eller partiell respons (RECIST kriterier), og dårlig respons som statisk sykdom eller sykdomsprogresjon (RECIST kriterier). I tillegg har vi sett på sykdomsspesifikk overlevelse i forhold til stathmin nivå for alle pasienter med livmorkreft og spesielt for pasienter behandlet for metastatisk sykdom. Gjennomsnittlig oppfølging i vår kohort var 34 måneder (variasjon 0-105 måneder).
Tissue microarray (TMA) bygging
TMA-tallet var generert som tidligere beskrevet og validert i flere studier [33 ]. Arealet av høyeste tumor aggressivitet ble identifisert på alle hematoxylin /eosin lysbilder for å sikre tumor representativitet og tre (primær tumor) eller vevs sylindre en (metastaser) (0,6 mm diameter hver) ble montert i en mottakerblokk ved hjelp av en spesiallaget presisjonsinstrument ( Beecher instrumenter, Silver spring, MD, USA). Formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) primær svulstvev var tilgjengelig i TMA fra 603 pasienter for vurdering av stathmin nivå. Fra 77 pasienter med metastaser, ekstra metastatisk vev var tilgjengelig i TMA for undersøkelse av stathmin nivå sammenlignet med tilsvarende primærtumor. For få tilfeller hadde flere evaluerbare metastatiske lesjoner, innhentet før paclitaxel kjemoterapi, for stathmin nivå evaluering, med svardata tilgjengelig i henhold til RECIST kriterier og en tilsvarende tidligere behandling profil (n = 3) for å tillate meningsfulle statistiske analyser av respons i forhold til biomarkør status i metastatiske lesjoner.
Immunohistochemistry
5 mikrometer tykke TMA snitt ble avvokset med xylen /etanol. Antigen henting ble gjort av mikrobølgeovn i TRS pH 6 (S1699 Dako Target Retrieval Solution) i 20 minutter. Slides ble blokkert for peroksidase (Dako S2023) i 8 minutter og inkubert i 60 minutter med stathmin (Cell signale # 3352), fortynnet 1:50. EnVision + systemet, ble HRP sekundært antistoff (Dako K4011) som brukes, etterfulgt av DAB + kromogen (DAKO K4011) som detection system. Lysbilder ble kontra med hematoksylin (Dako, S2020).
Farging evaluering
Blindet for pasientkarakteristika og utfall, ble lysbilder scoret av to forfattere (HMJW og JT) ved hjelp av standard lysmikroskopi som tidligere beskrevet [34], [35]. Kappaverdien, som er et mål på reproduserbarhet, ble 0,73 i et separat sett av 68 objektglass skåret individuelt av HMJW og JT. Høyt proteinnivå ble definert som den øvre kvartil, score ni, i tråd med tidligere publikasjoner [15]. I tilfelle av flere metastaser med variasjon i stathmin nivå, lesjonen med høyeste nivået som er definert sluttresultatet for metastatiske lesjoner.
statistikker
statistiske analysene ble utført ved hjelp PASW18 Statistics (Predictive analyse programvare, SPSS inc. Chicago, USA). Kategoriske variabler ble evaluert ved bruk av Pearson χ2-test eller Fisher eksakt der det er aktuelt. Tosidige P-verdier for 0,05 ble betraktet som signifikant. Univariatanalyser av tid fra primærbehandlingen til død på grunn av endometrialt karsinom (sykdomsspesifikk overlevelse) ble utført ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden. Den Cox metoden ble brukt for en multivariat overlevelsesanalyse (proporsjonalitet antakelse sjekket av log minus log plott).
Etikk uttalelse
Alle pasienter har signert informert samtykke før inkludering i studien. Studien er godkjent av norske Datatilsynet (961478-2), Norsk samfunnsvitenskapelig datatjeneste (15501) og den lokale Institutional Review Board (Regionale komiteer for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk, REKIII nr 052,01)
Resultater
Response til paclitaxel i livmorkreftcellelinjer
Response til paclitaxel varierer mellom livmorkreft cellelinjer [29], [36], [37]. Vi viser Ishikawa-celler er sensitive overfor paclitaxel behandling med en høy andel av apoptotiske celler etter 24 timers behandling (mikroskopisk telling og proliferasjonsanalyse) i motsetning til Hec1B celler (fig. 1a og 1b). Kombinasjons behandling av karboplatin og paklitaxel ikke resulterte i synergistisk behandlingseffekt (ikke vist)
A.: Mikroskopisk vurdering av apoptose i Ishikawa og Hec1B villtype-celler etter behandling med paclitaxel i de følgende doser: 0 nM 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. Resultatene er representative for 5 uavhengige eksperimenter. Standardfeil av middelverdien er indikert. B: Cell metabolsk aktivitet vurderes med spredning analyse (MTS, Promega) i Ishikawa og Hec1B villtype celler etter behandling med paclitaxel i følgende dosering: 0 nm, 1 NM, 10 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm og 500 nM. Resultatene er representative for tre (Ishikawa) og 2 (Hec1B) uavhengige eksperimenter.
Stathmin knock-down av viral transfeksjon
Fluorescensmikroskopi viste en transfeksjon rate på 70-80% ved starten av eksperimentene, med en markert reduksjon av stathmin nivåer i stathmin knock-down cellelinjer sammenlignet med kontroll knock-down og villtype-cellelinjer (figur 2a og 3a.)
A.: Immunoblot etter transfeksjon celler med en stathmin lentiviral shRNAmir ( «stmn kd») eller et ikke-tie kontroll ( «non sil «) samt den parentale cellelinje (vill-type;» WT «). Blotter ble farget for stathmin, og β-aktin for lasting kontroll. B: Ishikawa vill-type cellelinje, ikke-taushet stathmin knock-down etter behandling med paclitaxel i 24 timer i følgende dosering: 0 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. Nivået av fragmentering av cellene er angitt i en innsats, som en proxy for progresjon i den apoptotiske prosess. Diamonds; vill-type, trekanter; non-taushet kors; stathmin knock-down celler. C: Immunoblot av Ishikawa vill-type, kontroll (ikke-demping) og stathmin knock-down cellelinjer etter behandling med paklitaxel i 24 timer i de følgende doser: 0 nM, 100 nM og 250 nM. Blottet ble farget for kløyvde PARP og stathmin, med β-actin fungerer som lasting kontroll. D: Venstre: Ishikawa villtype ( «WT») cellelinje og Høyre: Ishikawa stathmin knock-down ( «Stmn kd») cellelinje. Mikroskopiske bilder av celler etter behandling i 24 timer med 0 nM (øverste rad) eller 500 nM (nederste rad) paclitaxel også demonstrere økt fragmentering sats for stathmin knock-down Ishikawa celler (høyre nedre panel) sammenlignet med villtype (venstre nedre panel)
A:. Immunoblot etter transfeksjon celler med en stathmin lentiviral shRNAmir ( «stmn kd») eller et ikke-tie-kontroll ( «non sil») samt foreldrenes cellelinje (wild -type; «WT). Blotter ble farget for stathmin, og β-aktin for lasting kontroll. B: Hec1B vill-type cellelinje, ikke-taushet stathmin knock-ned linjer, etter behandling med paclitaxel i 24 timer i følgende dosering: 0 NM, fem NM, 10 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm og 500 nM. C: Venstre: Hec1B villtype ( «WT») cellelinje og Høyre: Hec1B stathmin knock-down ( «Stmn kd») cellelinje. Viser mikroskopiske bilder av celler etter behandling i 24 timer med 0 nM (øverste rad) eller 500 nM (nederste rad) paclitaxel demonstrere økt celledød for stathmin knock-down Hec1B celler (høyre nedre panel) sammenlignet med Hec1B villtype (venstre nedre panel).
i begge stathmin knock-down cellelinjer (Ishikawa og Hec1B), ble det observert økt respons til paclitaxel behandling (fig. 2b og 3b). Hec1B celler viser en statistisk signifikant økt apoptotisk sats etter stathmin knock-down. Muligens på grunn av den iboende høyere følsomhet for paclitaxel i Ishikawa-celler, knock-down ikke resultere i en tilsvarende stor økning i celledød. Men vi har påpekt en klart økt fragmentering satsen i behandlet stathmin knock-down Ishikawa celler i motsetning til kontrollcellene, som kan betraktes som et tegn på ytterligere aktivering av apoptotiske sti (sett inn figur 2b.). Ved hjelp av immunoblot, prøvde vi å ytterligere validere denne forbedrede apoptotiske sti aktivering demonstrere PARP spalting ved en lavere paklitaxelkonsentrasjonen for Ishikawa etter stathmin knock-ned i forhold til kontroller (Fig. 2c). Mikroskopiske bilder av Ishikawa og Hec1B villtype og stathmin knock-down celler etter 24 timers behandling med paclitaxel 0 nM (kontroll) og 500 nm er vist i figurene 2d og 3c. Vi testet effekten av stathmin knock-ned på følsomhet for karboplatin monoterapi og paclitaxel-carboplatin kombinatoriske behandling uten å observere økt følsomhet eller synergieffekter (ikke vist).
Høy stathmin nivå spår dårlig respons til paclitaxel i kliniske prøver
Vi undersøkte deretter pasienttumorprøver for å se om en tilsvarende sammenheng mellom stathmin nivå og behandlingsrespons kunne observeres. Stathmin fargingen var overveiende cytoplasmisk, som rapportert i litteraturen [15], [38]. Representative bilder fra immunhistokjemi med svak (normal) og sterk (høy) stathmin farging er vist i figur 4a. Eksklusive metastatiske pasienter som får anti-hormonbehandling bare pasienter med metastatisk sykdom som paclitaxel kjemoterapi hadde lignende clinicopathological egenskaper som pasienter behandlet annerledes. Inkludert de pasientene som ble behandlet med anti-hormonelle legemidler bare, hovedsakelig skrøpelige eldre pasienter, clinicopathological egenskaper fortsatt forble like, bortsett fra at denne undergruppen var signifikant eldre (tabell 1). Pasienter med normal stathmin nivå tydelig reagert mye bedre (RECIST kriterier) til behandling enn pasienter med høyt stathmin nivå (Fig. 4b). Stathmin nivå ikke forutsi respons på andre kjemoterapiregimer eller behandlingsmetoder
A:. Bilder representant for svak immunhistokjemisk stathmin farging (øverst) og sterk (høyt eller patologisk) stathmin farging (nederst) i livmorkreft. Bars (høyre nedre hjørne) måler 40 mikrometer. B: Klinisk respons til paclitaxel for alle endometrial carcinoma pasienter med evaluerbare sykdom i henhold til RECIST kriterier og skilt for normal versus høy stathmin nivå. Dårlig respons (RECIST: statisk sykdom eller sykdomsprogresjon) angitt i blått, god respons (RECIST: fullstendig eller delvis respons) angitt i rødt. C:. Sammenligning av høy (patologisk) stathmin proteinnivået i grunnskolen og metastatiske lesjoner
Nærmer seg fra en annen vinkel, generelt, pasienter med høyt stathmin nivå viste en redusert sykdomsspesifikk overlevelse, på linje med stathmins rolle som en prognostisk biomarkør (fig. 5a). Men innenfor undergruppen av pasienter med metastatisk sykdom behandles med paclitaxel kjemoterapi, sykdomsspesifikk overlevelse var signifikant dårligere hos pasienter med høy sammenlignet med normal stathmin (p = 0,03, fig. 5b). Hos pasienter som fikk annen behandling for metastatisk sykdom, prognose var relatert til stathmin nivå (p = 0,76, Fig. 5c. For å utelukke confounding av kjente viktige clinicopathological prognostiske variabler, utførte vi en multivariat overlevelsesanalyse for begge undergruppene å se på effekten av stathmin nivå på overlevelse etter behandling for metastatisk sykdom, korrigert for FIGO stadium og histologisk subtype. stathmin proteinnivå forble en selvstendig prediktor for sykdom spesifikk overlevelse i undergruppen av pasienter som fikk paklitaxel kjemoterapi (n = 38, HR 2.3, CI 1.1 -5,2), justert for FIGO stadium og histologisk subtype, men ikke i undergruppen mottar annen behandling (n = 43, HR 1,1, KI 0,4 til 2,7)
A:. Alle pasienter med komplette data (n = . 476) Antall sykdomsspesifikke hendelser mellom parentes B:. Alle pasienter med metastatisk sykdom som fikk paklitaksel behandling (n = 38) Antall sykdomsspesifikke hendelser mellom parentes C:.. Alle pasienter med metastatisk sykdom som fikk ulike behandlinger (n = 43). Antall sykdomsspesifikke hendelser i parentes.
disharmonisk biomarkør status i grunnskolen og metastatiske lesjoner
Prosentandelen av pasienter med høyt stathmin nivå var betydelig høyere i metastaser i forhold til primære lesjoner med patologisk (høy) nivå bemerket i 18% av sistnevnte forbindelse (n = 84 477 primære lesjoner med stathmin farging tilgjengelig) sammenlignet med 37% i metastatiske prøver (n = 29 til 79) (fig. 4c).
i de sammenkoblede primær-metastaseprøver, 35% av metastatiske lesjoner viste høy stathmin nivå. En uoverensstemmelse på 26% mellom metastatiske lesjoner og deres primærvalg ble observert. I 16% var der en endring i høyt nivå i metastaser og i 10% til normalt nivå.
diskusjon
Stathmin proteinnivå har vist seg å være en prognostisk markør for aggressiv sykdom i mange kreftformer , inkludert endometrial cancer, hvor høyt stathmin nivå i primærtumor identifiserer pasienter med høy risiko for tilbakevendende sykdom og lymfeknutemetastaser [6], [9], [10], [12], [13], [15], [16 ]. Identifisering og utvikling av prediktive biomarkører er av avgjørende betydning for å øke behandlingseffekten og redusere unødvendige bivirkninger, ikke bare i målrettet terapi, men også i kjemoterapeutiske regimer, som for alle punkter som bare en undergruppe vil svare godt, spesielt i metastatisk setting, men med tiden svært begrensede verktøy for å forutsi disse pasientene [39], [40]. Ingen av de viktige clinicopathological faktorer, som FIGO stadium eller histologisk subtype, er i dag kjent for å skille potensielle respondere fra ikke-respondere til paclitaxel kjemoterapi i metastatisk setting. Studerer stor populasjonsbasert serie med høy kvalitet klinisk merknad som vår serie, kombinert med prekliniske forsøkene er en nyttig og tidsbesparende verktøy for å utforske potensielle prediktive biomarkører, som senere kan testes i kliniske studier.
I tråd med tidligere
in vitro
resultater i brystkreft, viser vi i livmorkreft cellelinjer som, uavhengig av den opprinnelige stathmin nivå, følsomhet for paclitaxel økt og dermed apoptose fremskyndet etter vellykket stathmin knock-down. Dette ble vist ved direkte mikroskopisk telling og i Ishikawa cellene også er underbygget av immunoblotting fokus på PARP cleavage. PARP-spaltning er en etablert indikator på apoptose, skiller den fra andre mekanismer for celledød, for eksempel nekrose. Den økte apoptotisk kroppen formasjon bemerket ved mikroskopi i stathmin knock-down cellelinjer passer med økt apoptose [41], [42].
I vår prospektivt samlet, retrospektivt analysert pasienten serien, har vi også vist en slående forskjell i respons til paclitaxel kjemoterapi sammenligne pasienter med normal til de med høyt stathmin nivå, også når man korrigerer for de viktigste clinicopathological prognostiske variabler. Selv når du utforsker en så stor klinisk serie med livmorkreftpasienter som vårt, samlet over mer enn 10 år, med tilstrekkelig oppfølging og RECIST [32] kompatibel dokumentasjon av respons, til slutt bare et mindre antall pasienter hadde blitt behandlet med behandling av interesse, understreker vanskelighetene med å samle serie med tilstrekkelig pasient tall for spesifikke markører studier; men samtidig viktigheten av å utnytte disse store prospektivt samlet befolkningsbasert serie for prediktiv biomarkører foreslått i prekliniske studier, og utforske potensialet klinisk validitet før klinisk utprøving scenen. Den statistisk signifikant sammenheng mellom høy stathmin nivå og dårlig paclitaxel respons i henhold til RECIST kriteriene i kliniske prøver, og det faktum at stathmin nivå har et selvstendig prognostisk verdi hos pasienter som får paclitaxel ved metastatisk sykdom, ikke til stede hos pasienter som ikke gjør det, i overlevelse analyser, støtter sannsynligheten for at nivået av stathmin nivå kan virke ikke bare som et prognostisk markør, men også som en prediktiv markør for respons til paclitaxel behandling i endometrial karsinom.
i motsetning til tidligere studier som ser på stathmin som en potensiell logisk markør, hovedsakelig i
in vitro
brystkreftstudier, i denne studien var vi i stand til å teste og bekrefte foreningen i kliniske prøver fra pasienter behandlet med stoffet av interesse; ved hjelp av data fra en godt kommenterte prospektivt samlet pasient serien. Både preklinisk og klinisk testing støtte som stathmin nivå påvirker følsomheten til paclitaxel. Vi har utforsket og utelukket at denne effekten kan generaliseres til andre kjemoterapeutika som karboplatin, også ofte brukt i livmorkreft.
Reporting anbefalinger for svulst markør prognostiske studier (REMARK) retningslinjer er utviklet med sikte på å bedre metodisk kvalitet og rapportering åpenhet i slike studier [43]. Den aktuelle studien er utført i henhold til disse retningslinjene for å forbedre kvaliteten og generell gyldighet av resultatene.
Taxaner, opprinnelig isolert fra barken av barlind treet, tilhører familien av anti-mikrotubulidynamikk kjemoterapeutika med paclitaxel som sin prototype. Enkelt sagt, taxaner binde til p -tubulin, forårsaker mikrotubuli å motstå depolymerization, hemmer cellesyklusprogresjon og fremme mitotisk arrest og celledød [44]. Karboplatin, i kontrast, er en av de platinabaserte midler, i samspill med DNA og forstyrrer DNA reparasjon. Som stathmin er et viktig regulator av mikrotubul-dynamikk, tatt hensyn til virkningsmåte av medikamentene, den positive effekten av stathmin knock-down på paclitaxel respons og fraværet av det til karboplatin sensitivitet, er også biologisk plausibel.
Vi viser en høyere andel av høyt stathmin nivå i metastatisk (37%) sammenlignet med primære lesjoner (18%). Avvik i stathmin status ble notert i en fjerdedel av parede prøver, parallelt funn i f.eks brystkreft hvor avvik mellom primære og metastatiske lesjoner er vist i 14-55% og 0-40% for hormonreseptorer og HER2 henholdsvis [45] – [47]. I livmorkreft, få studier diskutere forskjeller i markør status mellom primære og metastatiske lesjoner [38], [48], [49]. Intratumoral heterogenitet er godt beskrevet i kreft og en mulig problemfaktor i mange studier, uten hensyn til ved bruk av full vev lysbilder eller TMA. Inter-observatør variasjon er usannsynlig å være den eneste forklaringen på disse beskrives forskjellene. Også en fersk undersøkelse vurdere mutasjonsstatus, en metode anses som mindre subjektive enn immunhistokjemiske score, i flere metastatiske lesjoner fra en pasient med nyrecellekarsinom, støtte som oppdaget biomarkør endringer fra grunnskole til metastatiske lesjoner er reelle og kan være relatert til og relevant for tumorprogresjon [39]. Endringene i biomarkør status fra primær til metastaselesjoner støtte behovet for gjentatte biopsier i metastatiske lesjoner, for bedre å forholde terapi svar på potensielle prediktive biomarkører, men også å bare tilby behandlinger med sannsynlig positiv effekt når prediktive biomarkører er tilgjengelig [47], [50 ], [51]. For brystkreft, American Society of Clinical Oncology (ASCO) informert i 2007 allerede at for hormonreseptor status, bør testing anses å bli gjentatt i metastatisk sykdom hvis resultatene skulle påvirke pasientbehandling [52].
Konklusjon
Disse resultatene, inkludert prekliniske data, og for første gang data fra kliniske prøver, støtter at stathmin kan være en prediktiv biomarkør for responsen til paclitaxel behandling i livmorkreft. Imidlertid er bekreftende studier, ideelt sett fra randomiserte kliniske studier trengs. Den biomarkør disharmoni på tumorprogresjon er i tråd med andre studier på tumor biomarkør heterogenitet og støtter behovet for gjentatt biopsi i metastatisk sykdom.
Takk
Britt Edvardsen, Ellen Valen, Gerd Lillian Hallseth,
