Abstract
Høye nivåer av intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS) i cellene er anerkjent som en av de viktigste årsakene til kreftcelle apoptose og har blitt utviklet til et lovende terapeutisk strategi for behandling av kreft. Men om apoptose forbundet biofysiske egenskapene til kreftceller er relatert til intracellulære ROS-funksjoner er fortsatt uklart. Her, for første gang, bestemt vi endringer av biofysiske egenskapene som er knyttet til ROS-mediert spiserørskreft KYSE-150 celle apoptose ved hjelp av høyoppløselig atomkraftmikroskopi (AFM). Oridonin ble vist seg å indusere ROS-mediert KYSE-150 celle apoptose i en doseavhengig måte, som kan bli reversert med N-acetylcystein (NAC) forbehandling. Basert på AFM imaging, ble den morfologiske skader og ultra endringer av KYSE-150 celler funnet å være nært knyttet til ROS-mediert oridonin-indusert KYSE-150 celle apoptose. Endringene av celle stivhet bestemmes av AFM dynamometer også vist ROS-avhengige endringer i oridonin indusert KYSE-150 celle-apoptose. Våre funn ikke bare gitt ny innsikt i de kreft effekter av oridonin, men også fremhevet bruk av AFM som en kvalitativ og kvantitativ nanotool å oppdage ROS-mediert kreftcelle apoptose basert på celle biofysiske egenskaper, som gir romanen informasjon om rollene til ROS i kreftcelle apoptose på nanonivå
Citation. Pi J, Cai H, Jin H, Yang F, Jiang J, Wu A, et al. (2015) kvalitativ og kvantitativ analyse av ROS-mediert oridonin-indusert kreft i spiserøret KYSE-150 Cell Apoptose av Atomic Force Microscopy. PLoS ONE 10 (10): e0140935. doi: 10,1371 /journal.pone.0140935
Redaktør: Etienne Dague, Laas-CNRS, FRANCE
mottatt: May 25, 2015; Godkjent: 30 september 2015; Publisert: 23 oktober 2015
Copyright: © 2015 Pi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Macao Science and Technology Development Fund (nr 028/2014 /A1), https://www.fdct.gov. mo /
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
reaktive oksygenforbindelser (ROS) i cellene, slik som hydrogen peroxide, superoxide anioner og hydroksyl radikaler, fungere som andre budbringere i reguleringen av mange viktige cellulære hendelser, inkludert transkripsjonsfaktor aktivering, genekspresjon og cellulær proliferasjon, differensiering og senescence [1]. ROS har også vært innblandet i den metabolske omprogrammering av kreftceller, som spiller viktige roller i startfasen, progresjon, og metastase [2]. Og basert på forskjellige redoks-status fra normale celler og kreftceller, en lovende terapeutisk strategi basert på legemidler som øker ROS generasjon og induserer apoptose i kreftceller kommer ut for kreftterapi [3]. Høye nivåer av ROS kan direkte forårsake oksidativ skade på lipider, proteiner og nukleinsyrer, derfor drepe kreftceller ved å forstyrre stoffskiftet og signaltransduksjon. Økt ROS produksjon er alltid involvert i anticancer mekanisme av potensielle kreft narkotika, og også involvert i noen kliniske brukte kreft narkotika, for eksempel paclitaxel, 5-fluorouracil og doxorubicin [4-6].
Rabdosia rubescens, en slags urtemedisin, har tradisjonelt blitt brukt i Kina for behandling av faryngitt og spiserørskreft. Oridonin, hoved farmakologisk aktive substansen i rabdosia rubescens med ulike farmakologiske og fysiologiske effekter, har trukket en stigende oppmerksomhet for kreft biologer på grunn av sin bemerkelsesverdige anti-tumor aktivitet [7, 8]. Det har blitt rapportert at oridonin kan indusere apoptose eller autophagy i ulike typer av kreftceller, slik som multiple myelomceller [9], kolorektal kreftceller [10], hepatoma karsinomcellelinjer [11], prostatakreftceller [12], cervikal karsinom celler [13] and.oesophageal kreftceller [14]. Og meget interessant, eksponering av disse kreftceller til å oridonin resulterer i en betydelig økning i ROS generasjon og ROS-scavenger, slik som N-acetylcystein (NAC), fullstendig beskytter disse kreftceller fra oridonin indusert celledød [9-13]. Derfor oridonin kan bli servert som en ideell kreft agent for studiet av ROS-mediert apoptose i kreftceller.
Som medlem av scanning tunneling mikroskop (STM) teknikker, atomic force mikroskopi (AFM) er svært nyttig i topografi bildebehandling, mekanisk besluttsomhet og enkelt molekyl kraft etterforskning stole på påvisning av cantilever nedbøyning indusert av kreftene mellom AFM spissen og prøven. Basert på disse fordelene, har AFM blitt en av de mektigste nanoteknologi for
in situ
enkelt molekyl avbildning av celler, spesielt for cellemembran påvisninger [15]. Nylig, AFM har blitt introdusert for studiet av cancercelledød indusert av medikamentbehandling, noe som ikke bare gir den høye oppløsningen økes, men også fremhever de biomekaniske endres under celledød [16-18]. Disse arbeidene viser at AFM er svært nyttig for studiet av kreft effekter av legemidler basert på mobilnettet biofysiske egenskapene. Tidligere AFM-studier har vist at kreftcelle apoptose er nært knyttet til det intracellulære ROS-nivå [19-21]. Men det er fortsatt ingen systematisk AFM undersøkelse eller analyse om endringer av biofysiske egenskapene i ROS-mediert kreft apoptose.
I denne studien, med høy oppløsning AFM, vi systematisk undersøkt biofysiske egenskapene til menneskespiserørskreft KYSE -150 celler, som ble funnet å være nært knyttet til ROS-mediert apoptose indusert av oridonin. Oridonin ble funnet å inhibere proliferasjon, forstyrre mitokondriemembranpotensialet og indusere apoptose av KYSE-150 celler gjennom hele produksjonen av ROS i KYSE-150 celler. Alle disse effektene av oridonin på KYSE-150 celler kan bli reversert av ROS-åtseldyr NAC, indikerer ROS-medierte kreft effekter av oridonin på KYSE-150 celler. Deretter ble høy oppløsning AFM benyttet for analyse av anticancer virkningene av oridonin på KYSE-150-celler basert på de biofysiske egenskapene til cellene. Og spesielt, har vi funnet at, for første gang, AFM detektert morfologisk skade, membranultra endringer og biomekaniske forandringer av apoptotiske KYSE-150-celler indusert ved oridonin ble også nært relatert til den intracellulære ROS nivået av KYSE-150-celler, noe som viser bruken av AFM som en kraftig nanotool for studiet av ROS-mediert kreftcelle apoptose.
Materialer og metoder
Material
oridonin (≥98%, HPLC) er hentet fra Mingwang biotechology (Kina). Føtalt kalveserum (FCS), penicillin /streptomycin, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), og trypsin sett er oppnådd fra Gibco (USA). Paraformaldehyd er kjøpt fra Sigma (USA). 3- (4, 5) -dimethylthiazo (-z-y1) -3,5-diphenyt- etrazoliumromide (MTT), N-acetyl-L-cystein (NAC), Annexin V-FITC /PI (Annexin V-fluoresceinisotiocyanat /propidium jodid) apoptose deteksjon kit, DCFH-DA (2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat) reaktive oksygenarter assay kit, rhodamin 123, actin-tracker grønn (phalloidin- fluoresceinisotiocyanat), 2- (4-amidinofenyl) -6 -indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) og cellesyklus analysesett (propidiumjodid-) er kjøpt fra Beyotime institutt for bioteknologi, Kina.
Cell kultur
Menneskelig spiserørskreft KYSE-150 cellelinje er kjøpt fra svulst celle bibliotek av Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina), som er dyrket med DMEM medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, og 100 g /ml streptomycin i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
celleviabilitet måling
MTT-analysen ble anvendt for å teste cellens levedyktighet av KYSE-150-celler utsatt for oridonin. Cellene ble sådd på 96 brønners plater med en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn i 24 timer og ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av oridonin i 24 timer. For å absorbere den ROS produsert av oridonin ble cellene forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og deretter behandlet med oridonin i 24 timer. Etter oridonin behandling, MTT-reagens (10 ul, 5 mg /ml) ble deretter tilsatt til hver brønn i 4 timer inkubasjon ble mediet fjernet, og cellene ble suspendert i 150 ul DMSO for å inkubere i 10 min. Et spektrofotometer (TECAN, Switzer-land) ble brukt til å teste absorbans ved 490 nm.
Intracellulær ROS nivå besluttsomhet
Den intracellulære ROS nivå KYSE-150 celler ble bestemt av en DCFH-DA basert reaktive oksygenarter assay kit. Cellene ble podet inn i 6-brønners plater med en tetthet på 1 x 10
5 celler /brønn i 24 timer og ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av oridonin i 3 timer. For å absorbere den ROS produsert av oridonin ble cellene forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og deretter behandlet med oridonin i 3 timer. Etter oridonin behandling ble cellene høstet, vasket trippel med PBS og inkubert med DCFH-DA-løsning i 30 minutter i mørke ved 37 ° C. Flowcytometri (BD, USA) ble anvendt for å påvise intracellulære ROS nivå etter at cellene ble samlet opp og vasket to ganger med PBS.
celle apoptose deteksjon
Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit ble brukt til å detektere apoptose av oridonin behandlet KYSE-150 celler i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble podet inn i 6-brønners plater med en tetthet på 1 x 10
5 celler /brønn i 24 timer og ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av oridonin i 24 timer. For å absorbere den ROS produsert av oridonin ble cellene forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og deretter behandlet med oridonin i 24 timer. Etter å ha inkubert med oridonin, KYSE-150-celler ble høstet, vasket trippel med PBS, suspendert i Annexin V bindingsbuffer og inkubert med FITC-merket Annexin V og PI i 5 min ved romtemperatur i mørke. Deretter ble prøvene umiddelbart analysert ved flow-cytometri (BD, USA).
Mitokondriell membranpotensialet analyse
rhodamin 123-baserte strømningscytometri ble anvendt for å bestemme endringer av mitokondriemembranpotensialet (MMP ) av KYSE-150 celler ved oridonin behandling. Cellene ble podet inn i 6-brønners plater med en tetthet på 1 x 10
5 celler /brønn i 24 timer og ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av oridonin i 24 timer. For å absorbere den ROS produsert av oridonin ble cellene forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og deretter behandlet med oridonin i 24 timer. De høstede og vasket KYSE-150 celler ble inkubert med rhodamin 123 i 60 minutter i mørke ved 37 ° C. Flowcytometri (BD, USA) ble anvendt for å detektere fluorescens-signalet av rodamin 123 etter at cellene ble samlet opp og vasket to ganger med PBS.
AFM prøvepreparering
For AFM-målinger, KYSE-150 cellene ble høstet med 0,25% trypsin og dyrket ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn på dekkglass i et seks-brønners plate. Etter inkubering over natten, ble oridonin tilsatt i kulturmediet i 24 timer stimulering. For å absorbere den ROS produsert av oridonin ble cellene forbehandlet med 2,5 mM NAC i 1 time og deretter behandlet med oridonin i 24 timer. Etter dette ble cellene vasket tre med PBS, fiksert med 4% paraformaldehydløsning i 10 minutter, vasket tre med destillert vann og tørket i luft for morfologi avbildning i luft eller umiddelbart anvendt for kraftmålinger i PBS-løsning. For levende celle stivhetsmålinger, ble KYSE-150-celler ble behandlet med eller uten oridonin og NAC i 24 timer, og deretter vasket med PBS-buffer for å forkaste suspensjonsceller i medium. Cellene ble deretter brukt for Youngs modulus målinger i DMEM medium med AFM.
AFM morfologi bildebehandling og membran ultrastructure analyse
AFM ble brukt til å undersøke topografiske og ultra (Bruker, tysk) endringer KYSE-150 celler indusert av oridonin behandling. Organiske forurenser av silisiumnitrid tips som brukes i alle målinger ble fjernet ved ultrafiolett bestråling. Våren konstanter av AFM tips ble kalibrert ved hjelp av termisk støy metoden implementert i Nanoscope programvare på AFM. For det første ble kalibrering av nedbøyning følsomhet utført på glass dekkglass på en liten vertikal avbøyning (~ 0 V) i luften. Da den termiske melodi kurve ble montert ved enkel harmonisk oscillator passende å beregne fjærkonstant. Krumn radius av AFM tips (BudgetSensors, Bulgaria) brukes for morfologi bildebehandling var 10 nm, og fjærkonstanten av tips var 0,51 ± 0,02 N /m med en nedbøyning følsomhet på 52,94 ± 0,96 nm /V. De morfologiske og ultra bilder av KYSE-150-celler ble erholdt i luft ved romtemperatur i kontaktmodus. Den ultra av KYSE-150-celler ble erholdt i områdene rundt kjernene og det topografiske bildebehandling og dataanalyse ble utført ved anvendelse av instrumentet utstyrt Nanoscope Analysis programvare. Og for å gjøre målestokken, x-aksen etiketter og Y-aksen etikettene på AFM bilder mer lesbar, vi re-writed målestokken og etiketter for X- og Y-aksen i disse tallene. For ultrastructure parameter analyse, 30 forskjellige 2 × 2 um
2 ultrastructure bilder på 15 forskjellige KYSE-150 celler i hver gruppe ble beregnet. Før ultrastructure parameter analyse, ble AFM bilder flatet med den første Flatten rekkefølgen ved Nanoscope Analysis programvare. Etter det ble hele ultrastructure image beregnet for høyde distribusjon og ruhet av Nanoscope analyse programvare.
AFM stivhet analyse
biomekaniske egenskaper av levende KYSE-150 celler ble målt i DMEM medium med nakne tips Force Volume modus via AFM (Bruker, tysk). Fjærkonstanten av silikonnitrid sonder brukes for levende celle målinger (Bruker, Tyskland) ble kalibrert ved den termiske støy-metode i en ren dyrkningsskål inneholdende PBS, som var 0,08 ± 0,01 N /m med en avbøyning følsomhet på 16,23 ± 0,71 nm /V. I Force Volume modus, ble spissen vekselvis nærmet til celleoverflaten og deretter trukket fra 16 × 16 punkter over 1 × 1 um
2 område på prøveoverflaten mens force kurver ble synkront registrert. For levende celle meaurements, ble mer enn 15 ulike steder på 15 forskjellige celler registrert i det sentrale området av celler i hver gruppe. Den Youngs modul ble beregnet fra styrkekurvene ved basisk Sneddon-modellen, som er beskrevet virkemåten av en kjent geometri inntrenger i kontakt med en elastisk halvrom mye mindre stivt enn det slag som er vist i ligning (1) [22] 🙁 1 )
Hvor sifferkombinasjoner F, s, E, og α er Poisson ratio, lasting kraft, innrykk, Youngs modul, og den halve åpningsvinkel på en konisk spiss, henholdsvis. I Sneddon modell, blir belastningen som utøves av stempel koblet til den forårsaket hakk dybde, som viser forholdet mellom den påførte kraften F og innrykk δ i tilfelle av koniske indenter. En Poisson-forhold på 0,5 er egnet for cellene, og således anvendes i den følgende analyse [23, 24].
statistikker og
Alle resultater er representative for tre uavhengige eksperimenter og de data som presenteres er uttrykt som Mean ± SD Statistisk analyse ble utført ved hjelp av t-test, bortsett fra at Youngs modulus utføres ved hjelp av Kruskal-Waillis test, og p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater og Diskusjon
oridonin hemme KYSE-150 celle levedyktighet av ROS-mediert vei
oridonin har blitt funnet å vise bredspektret anticancer aktiviteter mot ulike kreftcellelinjer [9-13, 25]. Effektene anti-proliferasjon av oridonin mot humane kreft i spiserøret KYSE-150-celler ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse, noe som indikerte sterk hemming spredning effekter av 24 timer oridonin behandling på KYSE-150-celler som vist i figur 1A. Levedyktigheten til KYSE-150 celler ble redusert fra 100,0 ± 6,3% til 90,6 ± 7,8%, 73,2 ± 11,9%, 54,8 ± 16,3%, 32,0 ± 15,3% og 16,2 ± 5,6% etter 10 mikrometer, 20 um, 30 mikrometer, 40 mikrometer og 50 uM oridonin behandling, henholdsvis (figur 1A). De tidligere arbeidene fokusert på anticancer-aktivitet av oridonin underforstått at inhiberings effekter av oridonin ble alltid ledsaget av økning av intracellulært ROS nivå i kreftceller [9-13]. Vi har også bestemt ROS-nivået i KYSE-150-celler, som viste at oridonin behandling kunne gi en betydelig indusere overproduksjon av ROS på en doseavhengig måte, og den overprodusert ROS indusert ved oridonin kunne elimineres ved forbehandling av cellene med ROS gatefeier NAC (fig 1B). Det relative intracellulære ROS-nivå i KYSE-150 celler øket fra 100,0 ± 23,4% for kontrollcellene til 125,5 ± 6,9% 142,1 ± 18,2% og 186,6 ± 15,8% for 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandlede celler, henholdsvis (fig 1C). Med forbehandling av 2,5 mM NAC i 1 time, det intracellulære ROS nivå i KYSE-150 celler ved 50 uM oridonin behandling redusert til 114,9 ± 14,8% og forbehandlingen med NAC viste alene ingen signifikant effekt på ROS nivå i KYSE-150 celler med en gjennomsnittlig ROS nivå på 105,6 ± 2,8% (figur 1C). Disse resultatene underforstått at oridonin kan indusere overproduksjon av ROS i KYSE-150 celler, som kan elimineres ved NAC forbehandling.
(A) Effekter av oridonin på levedyktigheten til KYSE-150 celler. (B) DCFH-DA-analyse av virkningene av NAC på oridonin indusert ROS-produksjon i KYSE-150 celler. (C) Statistisk analyse av virkningene av NAC på oridonin indusert ROS-produksjon i KYSE-150 celler. (D) Effekter av ROS gatefeier-NAC på oridonin hemmet levedyktighet KYSE-150 celler, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
For å bestemme rollene. av ROS i anticancer aktivitet oridonin, vi også oppdage virkningene av NAC på oridonin hemmet KYSE-150 celleproliferasjon. Som vist i figur 1D, levedyktigheten til KYSE-150-celler var 14,6 ± 2,5% etter 50 uM oridonin behandling, som ble reversert til å være 97,8 ± 1,9% av 1 time forbehandling med 2,5 mM NAC. Disse resultatene sterkeste at de hemming effektene av oridonin på KYSE-150 celleproliferasjon i ROS-mediert veien.
oridonin-indusert ROS-mediert KYSE-150 celle apoptose
Induksjon av kreft celle apoptose har vært mye studert i de siste tiårene, noe som gjør den til en av de mest vanlige og viktige indikatorer som må registreres for utvikling av kreft narkotika. For å klargjøre den anticancer aktivitet av oridonin i humane cancerceller i øsofagus ytterligere, ble det apoptose av KYSE-150-celler bestemt ved Annexin V-FITC /PI assay. Som angitt i figur 2A, kan oridonin indusere apoptose av KYSE-150-celler på en doseavhengig måte, og at forbehandling med NAC kunne inhibere indusert oridonin KYSE-150 celle-apoptose. Den apoptose frekvensen av KYSE-150-celler økte fra 7,3 ± 1,5% for kontrollcellene til 10,5 ± 1,9%, 24,8 ± 1,5% og 52,4 ± 3,1% etter 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandling, henholdsvis (figur 2B). Og med forbehandling av NAC, apoptose ratene KYSE-150-celler var 13,0 ± 1,3% og 6,7 ± 1,6%, med og uten 50 uM oridonin behandling, henholdsvis (figur 2B). Oridonin indusert apoptose av KYSE-150-celler var stort sett alle reversert ved NAC behandling, noe som viste at oridonin indusert KYSE-150 celle apoptose var nært knyttet til den overprodusert ROS indusert ved oridonin.
(A) Annexin V /PI analyse av virkningene av NAC på oridonin indusert KYSE-150 celle-apoptose. (B) Statistisk analyse av virkningene av NAC på oridonin indusert KYSE-150 celle apoptose, *** p. 0,001
For å finne ut om dysfunksjon i mitokondriene var også involvert i oridonin indusert KYSE- 150 celle apoptose, undersøkte vi den mitokondriemembranen potensial (MMP) som reaksjon på oridonin eksponering ved strømningscytometri ved bruk av rhodamin 123 som en fluorescerende probe. Resultatene underforstått at oridonin kan indusere MMP forstyrrelse av KYSE-150-celler på en doseavhengig måte, og NAC kan også reversere denne effekt (figur 3A). Den statistiske analysen viste at den relative fluorescens-signalet av rodamin 123 ble redusert fra 100,0 ± 1,6% for kontrollcellene til 98,1 ± 4,7%, 93,4 ± 1,5% og 77,0 ± 8,2% etter 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandling, henholdsvis ( figur 3B). Forbehandling med NAC hadde ingen signifikant effekt på MMP av KYSE-150 celler, som viste en relativ verdi på 99,96 ± 1,82% (Fig 3B). Og den relative fluorescens-signalet av rodamin 123 også øket til 97,7 ± 4,4% ved forbehandling med NAC og behandling med 50 uM oridonin, noe som indikerer at oridonin kan også indusere MPP forstyrrelse av KYSE-150-celler ved ROS-mediert vei. I tillegg er analysen av cellesyklusfordelingen viste også at oridonin kan også indusere cellesyklus-stans av KYSE-150 celler i G2 /M fase (Fig A i S1-fil). Selv om utbredelsen av cellene ved G2 /M fase var ikke ROS nivåavhengig, men forbehandling med NAC kan også reversere oridonin indusert cellesyklus arrest (Fig A i S1 File).
(A) Rhodamine 123 analysen av effektene av NAC på oridonin indusert forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial i KYSE-150 celler. (B) Statistisk analyse av virkningene av NAC på oridonin indusert forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial i KYSE-150 celler, ** p. 0,01
Behandlingen av oridonin betydelig økt ROS nivå i KYSE -150 cellene og over-produsert ROS ytterligere indusert forstyrrelse av MMP, arrestasjonen av cellesyklus og apoptose av KYSE-150 celler. Med forbehandling av NAC, som hadde ingen signifikant effekt på den fysiologiske status av KYSE-150 celler, men kunne fjerne overprodusert, ROS, oridonin indusert MMP avbrudd, cellesyklus og apoptose av KYSE-150 celler ble dramatisk snudd. Disse resultatene sterkt antydet at kreft aktiviteter oridonin i KYSE-150 celler ble hovedsakelig mediert av den intracellulære ROS nivået KYSE-150 celler indusert av oridonin.
ROS-avhengige morfologiske skader av KYSE-150 celler
i de senere årene har AFM dukket opp som et kraftig verktøy for nanoskala morfologi bildebehandling og pico-newton følsomhet kraft måling av celler i ulike fysiologiske status [26-29]. Den super oppløsning og høy styrke følsomheten AFM viser også svært brede programmer for påvisning av kreft celle apoptose ved medikamentell behandling, gir noen ny informasjon om celle morfologi, celle biomekanikk og membran reseptor funksjoner [16, 18, 28]. Morfologien til cellene er nært knyttet til celle fysiologiske status og funksjoner. Cell apoptose er alltid forbundet med en rekke typiske morfologiske endringer, for eksempel kondensering av kjernen, blebbing av membranen og krympe cellekroppen.
For å løse de nøyaktige morfologiske endringer av KYSE-150 celler indusert av oridonin behandling og rollene til ROS i oridonin induserte morfologiske forandringer av KYSE-150-celler, ble høy oppløsning AFM operert for studiet av KYSE-150 celler. Som vist i figur 4A, tak KYSE-150 celler viste typiske ovale former og cellene tett kontakt med andre celler. Etter behandling med 10 uM oridonin i 24 timer, var det ingen bemerkelsesverdige endringer i morfologien av KYSE-150-celler (figur 4B). Etter 24 timers behandling med 30 mikrometer oridonin, KYSE-150 celler viste noen typiske morfologiske kjennetegn ved apoptose, inkludert de krympede celle organer og kondensert cytoplasma (fig 4C). Og for 50 uM oridonin behandlet KYSE-150 celler, kan mer typiske morfologiske egenskaper av apoptose observeres, slik som krympe av cellelegemer, kondensasjon av cytoplasma, kondensering og fragmentering av kjernen, fremveksten av apoptotiske legeme (Indikert ved grønne piler) og de skadede pseudo strukturer for celleforbindelser (fig 4D). For å demonstrere rollen til økt intracellulær ROS nivå i oridonin induserte morfologiske forandringer av KYSE-150-celler, var morfologien til KYSE-150-celler med forbehandling av 2,5 mM NAC i 1 time og 50 uM oridonin i 24 timer også undersøkt ved AFM. AFM bilder (figur 4E) antydet at KYSE-150 celler hadde ingen vesentlige morfologiske endringer ved 50 mikrometer oridonin behandling på grunn av forbehandling av 2,5 mM NAC. Og forbehandling av NAC også hadde ingen bemerkelsesverdige virkninger på morfologien til KYSE-150-celler (figur 4F). I tillegg fant vi også at kontroll KYSE-150 celler alltid viste klare nucleus områder (Angitt med blå piler i figur 4), som også forsvant etter oridonin behandling og reverseres ved forbehandling med NAC. Disse høy oppløsning AFM bilder antydet at oridonin kunne forårsake morfologiske erstatning av KYSE-150 celler og disse morfologiske skader kan også bli reversert med NAC-behandling, noe som indikerer at AFM kan brukes som en kvalitativ nanotool for å bestemme ROS-mediert celle morfologiske forandringer i kreftcelle apoptose. Imidlertid er denne morfologisk avbildningsmetoden basert på AFM begrenset til den kvalitative analyse av ROS-mediert apoptose kreftcelle, og er ikke egnet for kvantitativ analyse.
AFM morfologi avbildning av (A) kontroll, (B) 10 uM oridonin behandles, (C) 30 uM oridonin behandles, (D) 50 uM oridonin behandles, (E) 2,5 mM NAC + 50 pM oridonin behandles, og (F) 2,5mM NAC behandlet KYSE-150 celler. (A1-F1) Topografi bilder og (A2-F2) sine tilsvarende 3D-bilder av KYSE-150 celler; (A3-F3) Forstørret topografi bilder i (A1-F1) og (A4-F4) sine tilsvarende 3D-bilder av KYSE-150 celler, skala bar. 20 mikrometer
ROS-avhengig membran ultrastructural forandringer av KYSE-150 celler
Cell membranultrastruktur er også mye brukt til å evaluere apoptose av kreftceller ved AFM fordi endringene av membrankomponenter, som for eksempel lipid flåte, membranproteiner og fosfolipid, ble også assosiert med celle apoptose [16, 18, 28, 30, 31]. Med høy oppløsning av AFM, kan noen parametere som beskriver den egenskapen av cellemembranen ekstraheres fra AFM-ultra bildene for å klargjøre endringer av cellemembran under apoptose. Effektene av oridonin på membranen ultra av KYSE-150-celler ble også bestemt ved AFM-analyse for å undersøke de mer detaljerte morfologiske endringer av oridonin indusert KYSE-150 celle-apoptose. Ved forstørret avbildning av cellemembran rundt kjernen områder, kan membranultra parametrene hentes ut for kvantitativ analyse av oridonin indusert KYSE-150 celle-apoptose. Som vist i figur 5 og endring av membranstruktur var vanskelige å klargjøre ved den direkte observasjon av membranultra bilder av KYSE-150 celler. Som vist i figur 5A4-5F4, høydefordelingen på cellemembranen og ruheten til cellemembranen (Inkludert Rq og Ra) økte etter oridonin behandling, som deretter ble reversert med forbehandling av NAC.
AFM og morfologi membranultra avbildning av (A) kontroll, (b) 10 pM oridonin behandles, (C) 30 uM oridonin behandles, (D) 50 uM oridonin behandles, (E) 2,5 mM NAC + 50 pM oridonin behandles, og (F) 2,5mM NAC behandlet KYSE-150 celler. (A1-F1) Topogrphy bilder av KYSE-150 celler, skala bar: 20 mikrometer; (A2-F2) Forstørret membran ultrastructure bilder i (A1-F1) og (A3-F3) sine tilsvarende 3D-bilder av KYSE-150 celler, skala bar: 500 nm; (A4-F4) Høyde distribusjon og grovheten på celleoverflaten ultrastructure analysert fra (A2-F2).
Ved å beregne 30 forskjellige steder i 15 ulike celler i hver gruppe, gjennomsnittlig høyde, Rq (root -mean-squared ruhet) og Ra (gjennomsnittlig ruhet) ble presentert i Fig 6. Den gjennomsnittlige høyden av KYSE-150 cellemembranen økte fra 28,9 ± 9,9 nm for kontrollceller til 37,1 ± 14,5 nm, 52,7 ± 25,7 nm og 73,7 ± 31,0 nm til 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandlede KYSE-150-celler, respektivt (figur 6A). Den dramatiske økning i membran partcle størrelse i KYSE-150 celler etter 50 uM oridonin behandling kan også bli eliminert med forbehandling av NAC, som viste en gjennomsnittlig høyde på 29,3 ± 9,0 nm (figur 6A). Og den gjennomsnittlige høyden av NAC behandlet KYSE-150 celler var 29,0 ± 10,5 nm, viser ingen signifikante effekter på membranen høyde fordeling av KYSE-150 celler (figur 6a). RQ verdier av KYSE-150 celler økte også, fra 8,9 ± 2,8 nm for kontrollceller til 10,99 ± 0,69 11,0 ± 3,7 nm, 13,87 ± 1,02 13,9 ± 5,4 nm og 22,6 ± 9,5 nm for 10 mm, 30 mikrometer og 50 mikrometer oridonin behandlede KYSE-150-celler, respektivt (figur 6B). Og hvis cellene ble forbehandlet med NAC, RQ verdiene var 9,6 ± 2,7 nm og 9,1 ± 2,7 nm, med og uten 50 uM oridonin behandling, henholdsvis (figur 6B). På samme måte, Ra-verdien var 7,1 ± 2,3 nm for kontrollceller, og økte til 8,6 ± 2,8 nm, 10,7 ± 4,1 nm og 18,0 ± 7,7 nm etter 10 uM, 30 uM og 50 uM oridonin behandling, henholdsvis (figur 6C). Den betydelige økningen av Ra i KYSE-150 celler etter 50 M oridonin behandling kan også reverseres med forbehandling av NAC å vise en Ra-verdi på 7,5 ± 2,1 nm (Fig 6C). Og NAC forbehandlet KYSE-150 celler uten viste oridonin behandling en Ra-verdi på 7,2 ± 2,1 nm (Fig 6C). Disse resultater indikerte at, i likhet med det intracellulære ROS nivå, både membranen høyde fordeling og membran ruheten KYSE-150-celler økte etter oridonin behandling på en doseavhengig måte, og den økte membranen høyde fordeling og membran ruhet kan også bli reversert ved NAC forbehandling.
(A) Høyde distribusjon, (B) rot-middel-squared ruhet (RQ) og (C) gjennomsnittlig ruhet (Ra) analysert fra 2 × 2 mikrometer ramme ultrastructure bilder av KYSE-150 celler, n = 30, * p 0,05, *** p. 0,001
Det er velkjent at cellemembranen ultrastruktur påvirkes av en rekke miljø- og subcellulære tilstand faktorer som motilitet, adhesjon, og intracellulær kontakt, og dermed kunne utvikles til meget gode indikatorer på helse eller unnormal status av celler [32]. Høyden fordeling og ruheten til cellemembranen bestemt ved AFM er parametre som beskriver strukturen til cellemembranen. Den økte Membranen høyde fordeling kunne tilskrives aggregering av membran biomolekyler. Som rapportert, vil hullet lignende strukturer føre en grovere overflate av celler [18]. Og generelt, flere molekyler befinner seg på plasmamembranen, større ruhet av celleoverflate ville bli detektert av AFM [33]. Celle apoptose er forbundet med eksponeringen av indre membran fosfolipider på celleoverflaten, som dermed frembringer integrerte endringer av elektrostatisk potensial og hydrering i den ytre paknings av cellemembran [34]. Og i ROS-mediert apoptose, blir høye intracellulære ROS-nivåer også funnet å påvirke strukturen eller ekspresjonen av noen viktige membrankomponenter, slik som transmembrankanaler reseptorer og lipid flåte [35-37].
