Abstract
Fedme og type 2 diabetes er assosiert med økt risiko for utvikling av visse former for kreft, inkludert tykktarmskreft. Utgivelsen av svært kontroversielle epidemiologiske studier i 2009 hevet muligheten for at bruk av insulin analoge glargin øker denne risikoen ytterligere. Det er imidlertid ikke klart hvordan mitogene effekter av insulin og insulin-analoger målt
in vitro
korrelerer med tumor vekstfremmende effekter
in vivo
. Målet med denne studien var å undersøke mulige vekstfremmende effekten av naturlig humant insulin, insulin X10 og IGF-1, som er ansett som positive kontroller
in vitro
, i et kortsiktig dyremodell av en obesity- og diabetes-relevant kreft. Vi preget insulin og IGF-1 reseptoren uttrykk og responsen på behandling med insulin, X10 og IGF-1 i murine tykktarmskreft cellelinje (MC38 celler)
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre undersøkte vi farmakokinetikk og farmakodynamikk og overvåket vekst av MC38 celle allotransplantater i mus med diett-indusert fedme behandlet med humant insulin, X10 og IGF-1. Behandling med X10 og IGF-1 signifikant økt vekst av MC38 celle allograftene i mus med diett-indusert fedme, og vi kan derfor konkludere med at supra farmakologiske doser av insulin analog X10, som er super-mitogen
in vitro
og økt forekomst av svulster på melkekjertler hos hunnrotter i en 12-måneders toksisitetsstudie, også øke veksten av kreft allograftene i et kortsiktig dyremodell
Citation. Hvid H, Blouin MJ, Birma E, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ et al. (2013) Behandling med insulin Analog X10 og IGF-1 Øker Vekst av Colon Cancer allografts. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10,1371 /journal.pone.0079710
Redaktør: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, USA
mottatt: 26. juli 2013, Godkjent: 24 september 2013; Publisert: 18.11.2013
Copyright: © 2013 Hvid et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av en bevilgning (TFF-116128) fra Canadian Institute of Health Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende interessekonflikter til rapport: H Hvid, J Damgaard, JJ Fels, F Poulsen, C Fledelius og BF Hansen er ansatt i Novo Nordisk og eie aksjer i selskapet. M Pollak er konsulent for Novo Nordisk. For alle øvrige forfatterne er det ingen interessekonflikter å rapportere. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Fedme og type 2-diabetes er forbundet med en økt risiko for visse former for kreft, slik som bryst, pankreas og tykktarmskreft [1] – [5]. Sterkt kontroversielle epidemiologiske studier antydet at terapeutisk anvendelse av insulin analog-insulin glargin ble forbundet med en økt risiko for utvikling av kreft [6], [7], men det ORIGIN prøve nylig gitt sterkt bevis på at dette ikke er tilfelle [8]. Men de epidemiologiske studier publisert i 2009 og følgende diskusjoner streket betydningen av pre-kliniske sikkerhetsvurdering av insulin analoger. Dessuten trenger de beroligende resultater om glargin ikke redusere før bevis for en sammenheng mellom type 2 diabetes og økt risiko eller dårligere prognose for visse kreftformer, inkludert tykktarmskreft, og mekanismene bak denne foreningen er fortsatt et viktig tema.
i denne sammenheng den insulinanalog X10 er en interessant ligand. X10 ble utviklet som en hurtigvirkende insulinanalog ved substitusjon av histidin i posisjon B10 med asparaginsyre [9]. Dette enkel aminosyresubstitusjon øker bindingsaffiniteten til X10 til IGF-1-reseptor (IGF-1 R) og insulinreseptor (IR) 3- til 5-ganger og to ganger i henholdsvis [10], [11]. Videre har X10 redusert off-rate fra IR forhold til naturlig humaninsulin (HI), som resulterer i vedvarende signalering fra IR [12]. Nylig ble det vist at X10 resulterer i forholdsvis sterkere aktivering av fosforyleringsseter i juxta-membran og kinase domener av IR enn den C-terminale domene [13]. Disse reseptor binding og -activation egenskaper gir X10 en 3-15 ganger høyere mitogen potensial enn HI
in vitro product: [14] og i en 12-måneders kronisk toksisitet studier supra farmakologiske doser av X10 økt forekomst av spontan mammary svulster i Sprague Dawley rotter [15]. Videreutvikling av X10 for klinisk bruk ble derfor avviklet, men mekanismene bak den økte tumortilfeller har aldri blitt fullstendig klarlagt (se [16] for en detaljert gjennomgang).
Tidligere dyrestudier ved hjelp av genetiske eller diett-indusert modeller for fedme eller diabetes er korrelert hyperinsulinemi med øket dannelsen av kjemisk induserte preneoplastiske lesjoner i tykktarmen [17], [18], veksten av kjemisk induserte tumorer [19], [20], så vel som vekst av murine cancercelle allografter [21 ] – [25]. I rottemodeller med kjemisk induksjon av kreft, behandling med insulin økt vekst av azyoxymethane-indusert colontumorer [26] og 7,12-dimetylbenz (a) Anthracene-indusert brystsvulster [27]. Det har også blitt vist at kontinuerlig infusjon av insulin til rotter i 12 timer økt proliferasjon av kolon epitelceller [28], og supra farmakologiske doser av HI eller glargin 18 uker økte proliferasjon av colon epitel-celler og dannelse av preneoplastiske lesjoner, men ikke resultere i tumordannelse [29]. I sikkerhetsstudier, som tradisjonelt utføres som karsinogensitetsstudier eller kroniske toksisitetsstudier av 6-24 måneders varighet hos mus eller rotter [30], ingen økt forekomst av svulster ble observert i Sprague Dawley rotter og NMRI-mus etter behandling med relativt lave doser av glargin og HI i inntil 24 måneder [31]. Imidlertid, som nevnt ovenfor, behandling med høye doser av X10 i 12 måneder økte forekomst av brysttumorer i brysttumor utsatt Sprague Dawley hunnrotter [32]. Mens anbefalingene for sikkerhetsstudier av insulin og insulin-analoger er basert på godt validert vitenskapelig praksis, opprinnelig utviklet for studier av mutagener, foreslår eksisterende data som en svulst vekstfremmende effekten av insulin og insulin-analoger er en mer relevant bekymring, enn bekymring for økt startfasen, via økt mutasjonsraten skyldes økt spredning, som også antydet tidligere [33]. Kostnadseffektiviteten av screeningprogrammer for ulike former for kreft understreker at det ikke er uvanlig for voksne, inkludert diabetikere, for å ha uoppdaget premaligne tidlig kreft [34], [35]. Det er derfor relevant å utforske hvordan behandling med insulin og insulin analoger påvirke atferden til eksisterende kreft, og for å gjøre dette i dyremodeller av diabetes eller fedme kombinert med insulinresistens, siden disse faktorene er kjente risikofaktorer for kreftutvikling.
Formålet med studien var å undersøke mulige tumor vekstfremmende effekt av behandling med HI, X10 og IGF-1 i en murine tykktarmskreft allografts modell (MC38 celler) etablert i mus med diett-indusert fedme (DIO) og insulinresistens. Vi kjennetegnes derfor MC38 cellelinje som brukes for allograft studier omfattende og utført en rekke dyreforsøk for å få et pålitelig estimat av mulige tumorvekstfremmende effekten av HI, X10 og IGF-1
in vivo
.
Materialer og metoder
animal Experiments
for å undersøke effekten av behandling med HI, X10 og IGF-1 på vekst av MC38 kreft allograftene vi har utført fem identiske dyreforsøk. Vi har fokusert på forskjellige endepunkter på disse dyreforsøk og overvåkes tumorvekst i alle forsøk, se Tabell 1. De dyreeksperimenter ble utført som beskrevet nylig [36]. I korte trekk, ble mannlig C57BL /6 mus kjøpt fra Jackson Laboratories i en alder av 18 uker hvor musene hadde blitt opprettholdt på en fettrik diett (gnager diett med 60 kcal% fett, D12492, Forsknings dietter, Inc., New Brunswick, NJ, USA) siden en alder av 6 uker. For karakterisering av den metabolske fenotypen i DIO-mus (se tabell 2) ble det metabolske parametre også målt på samme alder magre mus foret med en kontroll diett, (Rodent diett med 10 kcal% fett, D12450B, Forsknings Dietter) inkludert i de tre eksperimentene. Dyr omsorg og behandling ble utført i samsvar med etablerte retningslinjer og protokoller godkjent av Lady Davis Institute (protokoll # 5951) og McGill University Animal Ethics Committee. Mus ble plassert en mus per bur med ad libitum tilgang til vann fra springen og høy eller lav fett diett, henholdsvis gjennom studiene. Temperaturen i dyrerommene ble holdt ved 20-25 ° C med en lys /mørke-syklus på 14/10 timer. Musene ble akklimatisert i 7-10 dager før eksperimentelle prosedyrer ble igangsatt. Ved eksperimentell dag 0, 2,0 x 10
5 (forsøk A) eller 5,0 x 10
5 (alle andre eksperimenter) MC38 celler, suspendert i 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS), ble injisert subkutant (sc) i den høyre flanken av musene. Deretter ble hver mus injisert subkutant to ganger daglig med enten bærer (aqueos oppløsning inneholdende 7 mM fosfat, 150 mM glyserol, 22 mM NaCl og 30 mM fenol, pH 7,4), rekombinant humant insulin 600 nmol /kg, insulin analog-X10 (insulin analog B10Asp) (Novo Nordisk A /S, København, Danmark) 600 nmol /kg eller rekombinante humane IGF-1 (Increlex, IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Tyskland) 600 nmol /kg. Størrelsen av tumor allotransplantater ble målt tre ganger per uke og volumet beregnet ved hjelp av følgende formel: lengde x bredde
2 x 0,52. Basert på tumorvolumdataene for hver mus, beregnet vi areal under tumorvekstkurver (tumorvekst AUC). Ved avslutning av forsøkene, ble musene bedøvet med isofluran. Blod ble oppsamlet ved hjertepunksjon og umiddelbart etter avliving ved cervikal dislokasjon, ble prøver av leveren, tykktarmen, gastrocnemius muskel og MC38 celle-tumor allotransplantater dissekert ut og hurtigfrosset i flytende nitrogen for senere fremstilling av vev-lysat.
blodsukker og HbA1c
for å overvåke den farmakodynamiske effekten av behandling med HI, X10 og IGF-1, ble blodsukkeret målt før behandling og 15 min, 1 t, 2,5 t og 6 timer etter behandling. Blod ble samlet opp ved punktering av saphenous venen og blodsukker målt ved hjelp av en OneTouch Ultra Glucometer (Lifescan, Inc., Milpitas, CA, USA).
Nivåer av glykosylert hemoglobin (HbA1C) i blodet av DIO- og magert kontroll mus ble målt ved hjelp av Tina-quant Hemoglobin A1c Gen.3 analyse kit og en Cobas 6000 instrument (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner.
Innsamling av plasmaprøver og målinger av C-peptid, human insulin, insulin X10 and human IGF-1
Før forsøkene ble igangsatt, de systemiske nivåer av mus insulin ble målt ved hjelp av en rotte /mus insulin ELISA kit (Millipore Corp., Bilerica, MA , USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmaprøver tatt ved avslutningen av forsøkene ble analysert med hensyn på mus C-peptid, human insulin, insulinanalog, eller X10, human IGF-1. Mouse C-peptid ble analysert med Rotte /Mus C-peptid 2 ELISA kit (Millipore), i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmakonsentrasjonene av human IGF-1 ble målt med IDS-isys IGF-1 ELISA kit (IDS Immunodiagnostics, Fountain Hills, AZ, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmaprøver ble analysert med hensyn til nativt humant insulin ved hjelp av en luminescens Oxygen Kanalisering Immuno-analyse (loci-assay), som beskrevet tidligere [37]. Insulin X10 ble målt i mus plasma ved hjelp av en vaske-loci analysen, som også beskrevet nylig [38]. Se Materialer S1 for detaljert informasjon om disse analysene.
Cell Culture
MC38 celler (musecellelinje beskrevet av Corbett et al. (1975) [39] og sjenerøst gitt av Dr. Pnina Brodt , McGill University, Montreal, QC) og MCF-7-celler (ATCC, Manassas, VA, USA), ble dyrket i DMEM medium inneholdende 4,5 g /l glukose (Wisent Inc., Montreal, QC, Canada) supplert med 10% ( v /v) føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 20 pg /ml gentamicin (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Canada) (dvs. vekstmedium). Celler som brukes i dyreforsøk ble trypsinert, vasket en gang i PBS og resuspendert i PBS (4 ° C) ved en konsentrasjon på 5,0 x 10
6 celler /ml og holdt på is inntil subkutan injeksjon i mus. For signaleringsforsøk MC38-celler ble dyrket i vekstmedium i to dager til 80-90% konfluens, ble cellekulturer så skyllet én gang i PBS (romtemperatur), og sultemedium (i likhet med vekstmedium, bortsett fra at det inneholdt bare 0,25% (v /v) FBS og uten fenolrødt) ble tilsatt i 3 timer. Etter sult-celler ble behandlet med naturlig humant insulin, X10 eller IGF-1 ved sluttkonsentrasjoner på 1 eller 10 nM i sultemedium. Nøyaktig 30 minutter etter behandling, ble cellene skylt en gang i PBS (4 ° C) og lysert ved tilsetning av lyseringsbuffer som beskrevet ovenfor. Hver signaliserer eksperiment omfattet to replikere prøver per behandling og tre uavhengige eksperimenter ble utført. MC38 celler som anvendes for karakterisering av IR og IGF-1R ekspresjon ble dyrket, høstet og lysert som beskrevet for signalerings eksperimentene ovenfor, bortsett fra at de ikke var sultet før lysis.
Cell Proliferation
Effect av testforbindelser på proliferasjon ble undersøkt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyser, i det vesentlige som tidligere beskrevet [40]. I korte trekk, ble MC38-celler sådd ut i 96-brønners plater (5,000 celler pr brønn) i vekstmedium. Etter inkubasjon i 1 dag, ble cellene skylt i PBS (romtemperatur), sultet i 3 timer og deretter behandlet med HI, X10 eller IGF-1 i konsentrasjoner i området 0,001 til 1000 nM. Data for relative celletall fra de tre gjentatte forsøk, hver med fire replikere samplinger pr tilstand, ble deretter brukt for å passe dose-respons kurver ved bruk av GraphPad Prism, versjon 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Celleproliferasjon eksperimenter ble utført med MCF-7-celler som beskrevet for MC38 celler, bortsett fra at 20.000 celler ble utplatet per brønn. Se Materialer S1 og figur S1 for detaljert tilleggsinformasjon om celleproliferasjonsprosesser eksperimenter.
Utarbeidelse av Tissue og cellelysatene og Western blotting
Lysis av frosne vevsprøver og cellekulturer i petriskåler, sentrifugering av lysater, bestemmelse av proteinkonsentrasjon, blanding av cellelysatene eller vev med 2X SDS ladningsbuffer, denaturering, SDS-PAGE på forhåndsstøpt 4-15% gradient-geler (BioRad) og overføring til 0,45 um nitrocellulosemembraner ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],36] Før blotting med primære antistoffer nitrocellulosemembranene ble blokkert ved inkubering i Tris-bufret saltvann med 0,05% (v /v) Tween (TBS-T) med 5% (w /v) bovint serumalbumin (BSA) (når blotting med fosforylering-spesifikke primære antistoffer) eller TBS-T med 5% (vekt /volum) skummet melk (alle andre primære antistoffer) i 1 time ved romtemperatur. Primære antistoffer ble fortynnet i TBS-T med 5% (w /v) BSA, og inkubering ble utført over natten ved 4 ° C. Følgende kanin antistoffer, alt fra Cell Signal Technology Inc., Boston, MA, USA, ble brukt. Anti-fosfor-p70S6K (.. Thr389, katt no 9205), anti-P-S6 (Ser235 /236, kat . 2211), anti-fosfor-Akt (Ser473, kat. nr. 9271), anti-Akt (kat. nr. 9272), anti-fosfor-MAPK (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, kat. nr. 4370) , anti-P-IRS-1 (Ser302, kat. nr. 2384), anti-IRβ (kat. nr. 3025), anti-IGF-1Rβ (kat. nr. 3018), anti-beta-aktin (kat. nr. 4967). Inkubering med sekundært antistoff (pepperrot-peroksydase-konjugert geit-anti-kanin-IgG (i Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, kat. Nr 5401) og visualiseringen av proteinbånd ble utført som tidligere beskrevet [36]. Intensiteten av protein~~POS=TRUNC båndene~~POS=HEADCOMP ble kvantifisert ved hjelp av programvaren ImagePro (BioRad). i hver celle signalisering eksperiment, båndintensitetene ble normalisert til gjennomsnittet av de bæremiddelbehandlede prøvene. IR og IGF-1R band i lever, muskel tykktarm og MC38 celle allografter ble normalisert å bety bandet intensiteter i leveren og muskel prøver, henholdsvis.
analyse av leveren triglyserid innhold i lysat fremstilt av leverprøver fra DIO- og mager mus ble gjort ved hjelp av en triglyserid koloanalysesett (Cayman Chemical Company, Ann Arbor , MI, USA), i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med SAS programvareversjon 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). i alle analyser observasjoner ble antatt å være uavhengig mellom dyr eller cellekultur eksperimentelle enheter. Videre data ble antatt å følge en normalfordeling, og for å ha varians homogenitet. For å oppfylle disse forutsetninger ble data transformert ved hjelp av den naturlige logaritmen når det er nødvendig. Data med en numerisk standardisert restverdi . 3.0 ble ansett som uteliggere, som foreslått tidligere [41], og den statistiske analysen ble gjort med og uten disse uteliggere (se nedenfor)
In vitro
signaleringsdata ble analysert ved anvendelse av en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av parvise sammenligninger mellom hver type behandling og kontroll ved hjelp av flere t-tester med Dunnetts korreksjon. Videre, for hvert dosenivå, ble en direkte sammenligning av behandling med HI og X10 og HI med IGF-1 utføres ved hjelp av student t-test. Data som beskriver IR og IGF-1R-ekspresjon i forskjellige musevev ble analysert i en enveis ANOVA etterfulgt av parvise sammenligninger mellom vev ved bruk av multiple t-test med Bonferroni korreksjon.
Effekt av behandling på tumorvekst i hvert av de fem dyreforsøk ble analysert i en enveis ANOVA etterfulgt av parvis sammenligning av hver behandling med kjøretøyet ved hjelp av flere t-tester med Dunnetts korreksjon for hver av de to tumorvekst endepunkter; tumorende volum og areal under tumorvekstkurver (tumorvekst AUC). Resultatene av denne analysen for hvert eksperiment, dvs. gjennomsnittsverdier for hver behandling, 95% konfidensintervall og folden endringen av hver behandling i forhold til kjøretøyet, er vist i tabell 3.
For å undersøke behandlings -relaterte effekter på tumorvekst i alle fem dyreforsøk, vi for hvert endepunkt (tumorvolum ende og tumorvekst AUC) slått sammen alle data i en datasettet og analyserte dem i en blandet lineær modell med behandling som en fast forklaringsvariabel og eksperiment som en tilfeldig effekt. Ingen signifikant interaksjon mellom behandling og forsøket ble funnet med en hvilken som helst av de to utfall (tumor ende volum og tumorvekst AUC). For ytterligere å utforske forskjellene mellom behandlingene, ble parvise sammenligninger av hver type behandling gjøres ved hjelp av flere t-test med Bonferonni korreksjon. Ingen uteliggere ble observert blant de 131 observasjoner av svulst slutten volum, mens en avvikende ble identifisert blant de 131 observasjoner av tumorvekst AUC. Utelukkelse av denne avvikende var nødvendig for å oppfylle forutsetningene bak de statistiske modellene og ikke endre det samlede resultatet av analysen. Den gjennomsnittlige tumorvolum ende og tumorvekst AUC for hver behandling på tvers av alle fem eksperimenter, inklusive 95% konfidensintervall og brette endring av hver behandling i forhold til den bærer-behandlede gruppe er vist i tabell 3.
Resultater
MC38 celler reagerer på insulin, X10 og IGF-1
Vi først undersøkt hvordan behandling med HI, X10 og IGF-1 for 24 timer påvirket spredning av MC38 celler og MCF-7 celler (inkludert for sammenligning), se figur 1. Behandling med testforbindelsene økte proliferasjon i begge cellelinjer. I overensstemmelse med tidligere proliferations studier i MCF-7-celler, og ≈ 9 ganger høyere ekspresjon av IGF-1R enn IR i MCF-7-celler [42], ble den mitogene virkning største for IGF-1 X10 HI, mens M38 celler rangeringen for mitogen effekt var X10≥IGF-1 HI. Dette tyder på MC38-celler uttrykker sammenlignbare nivåer av IR og IGF-1R.
MCF-7-celler (A) og MC38-celler (B) ble eksponert for HI /X10 /IGF i 24 timer i medium med lavt serum innhold (MCF-7, 0,1% (v /v), MC38, 0,25% (v /v)). Ved slutten av behandlingsperioden relative celletall ble bestemt med et MTT-assay. Panel A og B viser gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hvert med fire replikater pr tilstand, feilstolper indikerer SEM. HI, X10 og IGF-1 økt spredning i MCF-7 og MC38 celler. I overensstemmelse med tidligere publiserte data og reseptor-ekspresjonsprofilen, rangeringen av testforbindelsene i henhold til mitogen potens i MCF-7-celler ble IGF-1 X10 HI. I MC38 cellene rangeringen var X10≥IGF-1 HI. Dette tyder på IR og IGF-1R uttrykkes på omtrent sammenlignbare nivåer i MC38 celler.
Videre undersøkte vi signaliserer akutt etter behandling med HI, X10 og IGF-1. Som vist på figur 2A-2G, behandling med den valgte doser av HI, X10 og IGF-1 signifikant aktivert IRS-1, Akt, mTOR, p70S6K, og S6 i MC38 celler i fosfoinositid 3-kinase (PI3K) vei, mens signifikant aktivering av P44 /42 mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) ble bare observert med høy dose av IGF-1 på dette tidspunkt. En tidligere studie med MCF-7-celler funnet at P-Akt (Ser473) og P-p70S6K (Ser389) var sensitive endepunkter for deteksjon av en signalforskjell mellom HI og X10 [42]. Vi har derfor sammenlignes direkte ekvimolare doser av HI, X10 og IGF-1, ved å beregne X10 /HI og IGF-1 /HI-forhold for hver av de undersøkte kinase fosforyleringsseter (figur 2H). Etter avtale med forrige undersøkelse, behandling med X10 økt betydelig fosforylering av Akt (Ser473) og p70S6K (Ser389) ved den laveste dosen av 1 nM. Den signaleringsdata som også var i god overensstemmelse med de spredningsdata, som IGF-1 og X10 først like mer potent enn HI i å stimulere aktiveringen av Akt, p70S6K og IRS-1 i MC38 celler.
Representative Western blots finnes vist i panel A. Cellene ble høstet etter behandling i 30 ug av totalt protein ble applisert på gelene. Hvert forsøk inkluderte to replikater per tilstand. Båndintensitetene ble kvantifisert i forhold til gjennomsnittet av de to bæremiddelbehandlede prøver i hvert forsøk. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og resultater fra kvantifisering av band intensiteter fra Vest blottting for P-Akt (B), P-P44 /42 MAPK (C), P-p70S6K (D), P-S6 (E), P-IRS -1 (F) og P-mTOR (G) og β-aktin (belastningskontroll) ble slått sammen og analysert på en enveis ANOVA etterfulgt av sammenligning av bærer-behandlede prøver med hver behandling ved bruk av multiple t-test med Dunetts korreksjon. Til slutt, en direkte sammenligning av kinase-aktivering ved HI og X10 og HI og IGF-1, henholdsvis, ble utført på hvert dosenivå ved hjelp av student t-test (H). Åpne sirkler: en gjengivelse sample, horisontale barer: middelverdier, feilfelt: SEM. * Og *** angir
P
0,05 og
P
. 0,0001, henholdsvis
Mus med Diet Induced Fedme er hyperinsulinemiske, Glukose-intolerant og har nedsatt insulinsensitivitet
Valgte metabolske parametre ble målt i DIO-mus og sammenlignet med alderstilpassede mus matet en kontroll fettfattig diett. Som vist i tabell 2, DIO-mus som hadde omtrent 40% økt kroppsvekt og var hyperinsulinemiske med omtrent fire ganger høyere insulinnivåer. Men DIO-mus var bare marginalt hyperglykemiske, som HbA1c ble bare litt økt. Kronisk eksponering mot høyt fettinnhold resulterte også i hepatisk steatose og DIO-mus måtte 3- til 4-ganger økte nivåer av triglyserider i leveren. På funksjonsnivå, DIO-mus viste også lavere glukosetoleranse og hadde redusert insulinfølsomhet, som bestemmes ved en glukose toleranse test som beskrevet tidligere [43].
Behandling med HI, X10 og IGF-1 Resultater i Short Term men høy systemisk eksponering, lavt blodsukker og Trykt sekresjon av endogent Insulin
Når musene ble behandlet med ekvimolare supra farmakologiske doser av HI, X10 eller IGF-1 ved sc injeksjon, svært høye plasmakonsentrasjoner ble observert kort tid etter injeksjon (figur 3A). C
max var ca 1000 nM for HI, X10 og IGF-1. Dette er omtrent 1000 ganger høyere enn plasmakonsentrasjonen av endogen musen insulin i hyperinsulinemiske DIO-mus (tabell 2). Basert på plasmakonsentrasjonen målt 15 min, 1 time og 6 timer etter sc injeksjon av HI, X10 eller IGF-1 (figur 3A), kan vi anslå at plasma halveringstid (t
½) for HI og X10 var ca 30 min, mens t
½ for IGF-1 ble ca. 70 min, i rimelig samsvar med eksisterende litteraturdata og det faktum at majoriteten av IGF-1 i blodplasma er bundet til IGF-1 bindende proteiner [ ,,,0],44], [45]
A.: Plasmakonsentrasjonen konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP målt i mus behandlet med HI, X10 eller IGF-1. De lavere deteksjonsgrenser for de ulike analysene var: HI; 14:00, X10; 233 pM og IGF-1; 1.3 nm. Mus ble behandlet ved tid 0, og plasmaprøver ble samlet etter 15 minutter, 1 time og 6 timer. Maksimale plasmakonsentrasjoner ble målt 15 minutter etter behandling. 6 timer etter behandling plasmakonsentrasjoner av IGF-1 ble ≈ 100 ganger høyere enn konsentrasjonen i plasma av HI og X10. B: Gjennomsnittlig blodglukose etter behandling med 600 nmol /kg HI /X10 /IGF-1 ved injeksjon fm. Blodsukker returnerte til basalnivåer etter ≈ 3-4 h, n = 8 (HI, X10 og IGF-1), eller n = 6 (kjøretøy). Prikket linje angir gjennomsnittlig blodglukose ved 0. Feilfelt; SEM. C: Plasmakonsentrasjonen 0,5 time og 5 timer etter behandling med HI eller X10, 600 nmol /kg. Svært høye plasmakonsentrasjoner ble observert 0,5 timer etter behandling. Åpne sirkler; observasjoner fra enkeltdyr, horisontale linjer; gjennomsnittsverdier, feilfelt; SEM. D: Nivåer av C-peptid i plasma 0,5 timer og 5 t etter behandling med HI eller X10, 600 nmol /kg, i de samme dyrene som vist i panel C. Nivåer av C-peptid var signifikant redusert 0,5 timer etter behandlingen sammenlignet med C-peptid nivåer målt 5 timer etter sc injeksjon av HI /X10, når blodsukkeret hadde returnert til basale nivåer og plasmakonsentrasjoner av HI og X10 var lave. Åpne sirkler; observasjoner fra enkeltdyr, horisontale linjer; gjennomsnittsverdier, feilfelt; SEM. * Indikerer
P
. 0,05
Behandling de valgte doser av HI, X10 og IGF-1 raskt senket blodsukkeret i musene på tilsvarende måte, men ca 3 -4 timer etter injeksjon blodsukker hadde returnert til basalnivåer (figur 3B).
Som forventet, nivåene av C-peptid var lave kort tid etter behandling med HI /X10, der svært høy plasmaeksponering ble observert ( Figur 3C), men som plasmakonsentrasjonene av HI /X10 reduserte nivåer av C-peptid raskt returnerte til basalnivåer 5 timer etter injeksjonen (figur 3D). Dette mønsteret av C-peptid nivåer også korrelert utmerket med endringer i blodsukker (figur 3B).
Behandling med HI, X10 og IGF-1 Aktiverer signale Nedstrøms IR /IGF-1R i MC38 Cell allografts
in vivo
uttrykk for IR og IGF-1R i MC38 celle allografts ble målt i forhold til referanse vev lever og skjelettmuskulatur (gastrocnemius muskelen) og normal kolon. Både IR og IGF-1R ble uttrykt i MC38 allotransplantater og kan sammenlignes med MC38 celler dyrket
in vitro
, dvs. fenotypen ble holdt
in vivo
. I MC38 allograftene IR ble uttrykt på lavere nivåer enn i leveren og tykktarmen, men kan sammenlignes med muskel-skjelettlidelser. IGF-1R ble uttrykt på nivåer tilsvar til tykktarm og på betydelig høyere nivåer enn lever og skjelettmuskulatur (4A-4C). Med denne teknikken var det ikke mulig å direkte sammenligne nivåer av IR og IGF-1R mellom vev
. Representative vestlige blotter for IRβ og IGF-1Rβ i leveren, MC38 svulst, tykktarm, muskel og MC38 celler kultivert
in vitro
. For hver prøve ble 20 ug totalt protein ble applisert på gelen. B: Kvantifisering av Western blot for IRβ ble gjort i forhold til den gjennomsnittlige bandet intensiteter av leverprøver. Den relative IR nivå i MC38 celle allografts var sammenlignbar med skjelettmuskulatur og betydelig lavere enn lever og tykktarm. n = 3 eller 4 per vev, linjene viser gjennomsnittet av to eksperimenter, feil barer; SEM. *** Indikere
P
0,0001. C: Kvantifisering av Western blot for IGF-1Rβ ble gjort i forhold til den gjennomsnittlige bandet intensiteter av muskelprøver. Den relative IGF-1R nivå var signifikant høyere i MC38 celle allotransplantater enn muskel og lever og kan sammenlignes med kolon. n = 3 eller 4 per vev, linjene viser gjennomsnittet av to eksperimenter, feil barer; SEM. *** Indikere
P
0,0001. D: Representative Western blot for P-mTOR, P-p70S6K, P-Akt og β-aktin i prøver av tumor allotransplantater samlet 1 time etter SC-injeksjon av HI, X10 eller IGF-1. Plasmakonsentrasjoner av HI, X10 og IGF-1 i disse dyrene ved tidspunktet for avliving og innsamling av vevsprøver er vist i figur 3A. Behandling med HI, X10 eller IGF-1 resulterte i aktivering av flere kinaser i PI3K signalveien.
Vi undersøkte også funksjonaliteten av IR og IGF-1RS i tumor allotransplantater ved hjelp av Western blotting for kinaser i PI3K signalveien i svulstvev samlet en time etter sc administrering av HI, X10 eller IGF-1 (figur 4D). Dette tidspunkt ligger i nærheten av den maksimale plasmakonsentrasjon og tidspunktet for maksimal effekt av de administrerte forbindelser med blodsukker. Vi har tidligere vist at fosforylering av Akt i tumor allotransplantater og normal colon etter SC-injeksjon av en bolus av HI og X10 er sterkt tidsavhengig [36]. Etter avtale med disse dataene, observerte vi uttalt aktivering av Akt, p70S6K og mTOR en time etter behandlingen, noe som viser MC38 tumor allografts er følsomme for akutt behandling med HI, X10 og IGF-1.
veksten av kreft allograftene er betydelig økt hos dyr behandlet med X10 og IGF-1
Fem dyreforsøk ble utført. Den midlere størrelse av tumorer i eksperimentelle dag 14 og tumorvekst AUC (eksperimentelt dag 0 til 14) for hver behandlingsgruppe i hvert eksperiment, inkludert 95% konfidensintervall for disse middelverdier, er vist i tabell 3, og alle data som er plottet på figur 5A-B. Med unntak av forsøk A, ble en tendens til økt tumorvekst etter behandling med HI, X10 og IGF-1 observert i alle forsøk, og det ganger endring i tumorvekst var generelt på ca. samme størrelsesorden for hver type behandling.
